Une méthode simple pour identifier les kinases qui réglementent la pluripotence des cellules souches embryonnaires par un dépistage des inhibiteurs à haut débit

Résumé

Ici, nous présentons un protocole quantitatif et évolutif pour effectuer des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires (CES) peuvent s'auto renouveler ou se différencier en tous types de cellules, phénomène connu sous le nom de pluripotence. Des états pluripotents distincts ont été décrits, dénommés pluripotence "naïve" et "apprêtée". Les mécanismes qui contrôlent la transition à l'origine ne sont pas bien compris. En particulier, nous restons mal informés sur les protéines kinases qui spécifient des états pluripotents naïfs et apprêtés, malgré une disponibilité croissante de composés d'outils de haute qualité pour sondage de la fonction kinase. Ici, nous décrivons une plate-forme évolutive pour réaliser des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf dans les ESC de souris. Cette approche utilise des conditions simples de culture cellulaire et des réactifs, matériaux et équipements standard pour découvrir et valider les inhibiteurs de la kinase avec des effets jusqu'alors non appréciés sur la pluripotence. Nous discutons des applications potentielles pour cette technologie, y compris le dépistage d'une autre petite moléculeDes collections telles que des inhibiteurs de kinase de plus en plus sophistiqués et des bibliothèques émergentes de composés d'outils épigénétiques.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires (CES) ont la capacité de se renouveler ou de se différencier en n'importe quel type de cellule dans le corps adulte, un phénomène connu sous le nom de pluripotence ¹ . Des preuves récentes indiquent qu'il existe des états pluripotents distincts du développement, appelés «pluripotence« naïve »et« apprêtée » ² . Les CES naïves représentent un état de développement similaire à celui observé dans l'embryon préimplantatif ³ . En revanche, les CES pluripotents préparés sont prêts à sortir de la pluripotence et à se différencier en lignées embryonnaires spécialisées ^{4 , 5} .

Les états pluripotents naturels et préparés sont marqués par des réseaux distincts de régulation des gènes. La pluripotence naïve se caractérise par l'expression de facteurs de transcription de pluripotence clés tels que Nanog, les facteurs de transcription de type Krueppel (Klfs), Rex1 ² et Esrrb 6. Dans les CES de souris (MESC), la pluripotence apprêtée se caractérise par une expression réduite des marqueurs naïfs et une signature d'expression génique spécifique qui comprend l'ADN de la méthyltransférase Dnmt3b ⁷ de novo. In vivo , les cellules souches épiblastiques de post-implantation pluripotente (EpiSCs) ^{4 , 5} expriment en outre le marqueur Epiblast Fgf5 et les marqueurs d'amorçage de lignée tels que Brachyury ⁸ .

Les MESC fournissent un modèle traçable aux mécanismes de sondage qui contrôlent in vitro les transitions pluripotentes imprégnées de naïveté. Lorsqu'ils sont cultivés dans le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) et le sérum bovin fœtal (FBS), les MESC subissent une transition dynamique entre les états pluripotents naïfs et préparés ^{9 , 10} . Fonctions de signalisation LIF-Jak-Stat3 pour promouvoir un réseau de régulation génétique naïf ¹¹ , tandis que la signalisation autocrine via le chemin de croissance 4 du fibroblaste (Fgf4) Erk1 / 2 conduit la transition vers l'état amorcé ¹² . Cependant, il reste un défi d'évaluer systématiquement le rôle des protéines kinases dans la spécification d'états pluripotents distincts.

Ici, nous décrivons une plate-forme quantitative et évolutive permettant d'effectuer des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf. Nous utilisons des conditions simples de culture du SMESC et des réactifs, des matériaux et des équipements standard pour découvrir et valider les inhibiteurs de kinase avec une capacité jusqu'alors non appréciée à stabiliser la pluripotence naïve. En outre, nous discutons des applications étendues potentielles pour cette technologie, y compris pour le dépistage d'autres collections de petites molécules telles que les bibliothèques d'inhibiteurs émergents ciblant les régulateurs épigénétiques.

Protocole

1. Collation des petites bibliothèques d'inhibiteurs de la molécule moléculaire

1. Associez les bibliothèques d'inhibiteurs des collections d'inhibiteurs de kinase accessibles au public, par exemple , la Bibliothèque des Signatures Cellulaires Intégrées (LINCS) de Harvard Medical School, une collection ciblée de 228 inhibiteurs de kinase sélectifs et puissants (http://lincs.hms.harvard.edu) , Et l'Ensemble d'inhibiteurs de la protéine kinase (PKIS), une collection de composés 376 assemblée par des chercheurs industriels (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ . Alternativement, assembler une collection d'inhibiteurs de kinase sur mesure à partir de composés disponibles dans le commerce.
   REMARQUE: dans notre laboratoire, nous avons rassemblé une collection de 72 inhibiteurs puissants et sélectifs de l'inhibiteur de la kinase couvrant 51 kinases cibles primaires, toutes disponibles à partir de sources commerciales.
2. Assembler les inhibiteurs de la kinase dans des plaques à 96 puits pour un traitement optimal à haut débit à de multiples concentrations (utiliser 1, 0.1 aNd 0,01 mM). Inclure dans chaque puits de contrôle de plaque contenant uniquement du DMSO et les inhibiteurs de contrôle de référence PD173074 (FGFRi) et Ruxolitinib (JAKi), qui sont connus pour promouvoir des états pluripotents naïfs et apprêtés respectivement. Annotez dans une feuille de calcul ou un logiciel similaire.

2. Conditions et procédures de culture du mESC pour la préparation de l'écran

1. Préparer des plaques de 10 cm revêtues de gélatine à 0,1% en ajoutant 5 ml de gélatine à 0,1% (p / v) à des plaques de 10 cm et à incuber à température ambiante pendant 5 min. Aspirer la gélatine et laisser sécher la plaque pendant 2 min.
2. Culturez toute ligne mESC standard à 37 ° C 5% de CO ₂ sur 0,1% de plaques 10 cm de gelatine dans des milieux mESC standard (voir la Table des Matériaux) contenant 100% de GST-LIF, 10% de sérum de veau fœtal et 5% de sérum knockout Remplacement. Remplacez les médias tous les jours et passez les MESC à environ 80% de confluence tous les deux jours à une dilution de 1: 5-1: 10.
3. Pour passer les MESC, aspirer les milieux et laver avec 5 mL oF solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par plaque.
4. Ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (0,05% de trypsine, 0,02% d'EDTA) par plaque de MESC et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
5. Remettre en suspension les cellules trypsinisées dans 4 ml de milieu mESC et centrifuger à 1 200 tr / min pendant 5 min.
6. Remplacer complètement le culot cellulaire dans 5 ml de milieux MESC, faire pipeter vers le haut et vers le bas pour générer une seule suspension cellulaire.
7. Compter les cellules en combinant une suspension cellulaire de 10 μL et 10 μL de Trypan Blue (0.4%). Placez-le dans une chambre de comptage cellulaire ou utilisez un hémocytomètre et un microscope optique.
8. Graine 3 x 10 ³ mESC dans 0,1% de plaques 96 puits revêtues de gélatine, volume final 100 μL de support, à l'aide d'une pipette multicanaux.
9. Appliquer des inhibiteurs de kinase à une dilution de 1: 100 (1 μl d'inhibiteur ajouté à 100 μL de support) en utilisant une pipette multicanaux. Mélanger doucement les milieux pour mélanger l'inhibiteur et la suspension cellulaire, puis permettre aux cellules de s'installer dans un capuchon de culture tissulaire pendant 1 h pour assurer une répartition égale de l'acroSs la surface de placage. Culturez les cellules pendant 48 h sans changer les médias.
   NOTE: Des plaques stockées de 1 / 0,1 / 0,01 mM donneront une concentration d'inhibiteur finale de 10/1 / 0,1 μM respectivement. Nous recommandons de commencer l'écran à une concentration finale de 1 μM pour assurer une inhibition efficace des kinases cibles primaires tout en minimisant les effets hors cible.

3. Analyse de l'analyse des inhibiteurs de la kinase

1. Lavez les plaques mESC à 96 puits dans 200 μl de PBS en utilisant un aspirateur multicouches et des pipettes.
2. Faire des extraits cellulaires dans 150 μL de tampon de lyse (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 à 1% (v / v), 0,5% de désoxycholate de sodium (p / v), 10 mM de β-glycérophosphate , Pyrophosphate de sodium 10 mM, NaF 1 mM, Na ₃ VO ₄ 2 mM, comprimés complets de cocktails inhibiteurs de la protéase).
3. Clarifier les extraits par centrifugation à 1.500 xg pendant 30 minutes dans des plaques à 96 po de fond en V.
4. Immobiliser 100 μL de surnageants sur un nitrocelMembrane de lulose à l'aide d'un collecteur à point de vide à 96 puits.
5. Sécher la membrane et tacher avec 40 mL de Ponceau S pour assurer un transfert constant.
6. Laver la membrane avec TBST et bloquer dans du TBST / 3% (p / v) de lait.
7. Incuber dans des anticorps Nanog et Dnmt3b à une dilution de 1: 1 000 (v / v) dans de la poudre de lait TBST / 3% (p / v) pendant une nuit.
8. Nettoyez les membranes dans 3 x 10 min dans le TBST et incupez dans 30 mL d'anticorps secondaires à une dilution de 1: 10 000 (v / v) dans du TBST / 3% (p / v) de lait.
9. Développer à l'aide d'un système d'imagerie numérique immunoblot.
   REMARQUE: si possible, utilisez une immuno-dépouille quantitative de fluorescence pour détecter Nanog et Dnmt3b. Cependant, le signal de fond pour Dnmt3b par immunoblot de fluorescence est trop élevé. Par conséquent, on utilise des anticorps secondaires de fluorescence anti-lapin (Nanog) et anti-souris-HRP (Dnmt3b) à 800 nm.

4. Analyse des données d'écran et validation des inhibiteurs en tant que régulateurs de pluripotence Bona Fide

NOTE: Il s'agit d'une étape critique pour s'assurer que seuls les modulateurs de pluripotence de bonne foi sont identifiés. Il est essentiel que les inhibiteurs de triage soient à la fois basés sur le rapport Nanog: Dnmt3b et le signal global, afin de s'assurer que les inhibiteurs de la kinase qui affectent négativement la survie du SMES ne sont pas sélectionnés pour une analyse plus approfondie.

1. Quantifier le signal Nanog et Dnmt3b à l'aide du logiciel d'analyse de l'immunoblotage et importer des valeurs dans une feuille de calcul ou un logiciel similaire. Calculer Nanog: rapport Dnmt3b pour tous les échantillons par rapport au contrôle DMSO. De plus, déterminez le signal total de Nanog et Dnmt3b pour s'assurer que les inhibiteurs de la kinase n'affectent pas le rapport Nanog: Dnmt3b en modifiant la viabilité du MEES.
2. Utilisez les rapports classés Nanog: Dnmt3b pour identifier les inhibiteurs qui favorisent la pluripotence naïve (rapport Nanog: Dnmt3b supérieur à la commande) et la pluripotence amorcée (rapport Nanog: Dnmt3b inférieur au contrôle). Régler la coupure à 2 fois l'écart par rapport aux valeurs de contrôle et filtrer les inhibiteurs de la kinase qui produisent un signal Nanog + Dnmt3b total inférieur à50% de la valeur de contrôle du DMSO pour générer une liste de haute confiance des inhibiteurs de la kinase qui stabilisent les états naïfs (taux Nanog: Dnmt3b élevé) et les états pluripotents amorcés (faible Nanog: Dnmt3b).
3. Valider les inhibiteurs de kinase en semant des MESC à 2 x 10 ⁵ cellules par 6 puits dans 2 ml de milieu et ajouter des inhibiteurs de kinase à 1 μM pendant 48 h, sans changer de support.
4. Lyse mESC dans le tampon de lyse et analyser l'expression de Nanog et Dnmt3b par immunobloting SDS-PAGE conventionnel.
5. Validez davantage les résultats par immunoblot de SDS-PAGE pour les marqueurs de pluripotence naïfs Klf2 et Klf4 et Oct4 pour s'assurer que la pluripotence est maintenue après un traitement inhibiteur de 48 h.

Résultats

En utilisant la procédure présentée ici ( Figure 1 ), nous examinons la bibliothèque LINCS de 228 inhibiteurs de kinase puissants et sélectifs pour identifier ceux qui modulent la pluripotence du MESC. La bibliothèque est préparée à une concentration de 0,1 mM pour une dilution 1: 100 et une concentration finale de criblage de 1 μM dans les MESC. 48 h plus tard, les MESC ont été lysés et des extraits ont été préparés pour une analyse quantique des points d'analyse de Nanog et Dnmt3b ( Figure 2 , haut). Les résultats d'autres concentrations de dépistage ne sont pas représentés ici pour une brièveté. Nanog: le rapport Dnmt3b est déterminé pour chaque inhibiteur de la kinase et les composés classés et une coupure 2x appliquée ( figure 2 , en bas). Le signal total de Nanog et Dnmt3b par rapport à la commande est superposé au classement des inhibiteurs et soumis à une coupure de 0,5x, pour permettre le triage des inhibiteurs qui présentent une toxicité importante pour le MESC. Sélectionnez les inhibiteurs de la kinase qui stabilisent le niveau naïfTe sont validés en utilisant l'immunoblot conventionnel Nanog / Dnmt3b ( Figure 3 ). Les cibles de la kinase primaire de ces inhibiteurs sont présentées dans le tableau 1 . Nous démontrons également l'applicabilité de cet écran pour identifier les inhibiteurs qui stabilisent l'état amorti ¹⁴ .

Figure 1: Flux de travail pour le dépistage des inhibiteurs de la kinase qui modulent la transition à l'apprêt naïf. Le MESC a été traité avec une banque d'inhibiteurs de la kinase composée 228 à une concentration finale de 1 μM. Les lysats ont été préparés et transférés sur des membranes de nitrocellulose pour une analyse immuno-point-blot, et les niveaux de Nanog et Dnmt3b ont été déterminés (Figure adaptée de Williams et al., ¹⁴ ). Cliquez ici pour voir al La version arger de ce chiffre.

Figure 2: Analyse d'écran de pluripotence à apprêt inoculé et identification des inhibiteurs. (Top) Représentant Nanog et Dnmt3b immuno dot-blot images. (Bas) Les valeurs de Nanog et Dnmt3b pour chaque inhibiteur de kinase ont été déterminées par rapport à la commande de DMSO, et les rapports Nanog: Dnmt3b et le signal Nanog + Dnmt3b relatif total ont été déterminés et les inhibiteurs ont été classés par rapport au contrôle DMSO. Les inhibiteurs ont révélé modifier le rapport Nanog: Dnmt3b au-delà d'un seuil de 2 fois au-dessus ou au-dessous du contrôle du DMSO ont été identifiés comme des conducteurs de pluripotence naïve ou apprêtée. Un seuil de 2x sous le contrôle du DMSO a été fixé à des inhibiteurs de triage qui compromettent la survie du SMES. Les inhibiteurs sélectionnés pour une validation ultérieure sont mis en évidence. (Figure adaptée de Williams et al., ¹⁴ ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Validation de certains composés choisis identifiés. Les MESC ont été traités avec 1 μM d'AZD4547 (un inhibiteur sélectif de FGFR) ou les inhibiteurs indiqués identifiés à partir de l'écran de la Figure 2. Niveaux de Nanog: Dnmt3b déterminés par SDS-PAGE standard et analyse par immunoblot. Les valeurs numériques de Nanog relatives: Dnmt3b et Nanog + Dnmt3b sont indiquées dans le tableau ci-dessous, et des inhibiteurs qui stabilisent l'état naïf pluripotent mis en évidence en vert. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Composé	Principaux objectifs		Autres objectifs
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR et TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 etN ° 160;
AZD-1480	JAK2

Tableau 1: Composés choisis choisis et leur (s) cible (s) principale (s) de kinase.

Discussion

Ici, nous démontrons une méthodologie largement accessible pour analyser le rôle des voies de signalisation de la kinase dans la régulation de la transition pluripotente à apprêt naïf. Cela répond à une question clé dans le champ ESC. Bien que les approches génomiques et transcriptomiques à haut débit soient habituellement utilisées pour identifier les principaux régulateurs de la transcription des états pluripotents naturels et apprêtés, les réseaux de signalisation de pluripotence élucidés se sont révélés difficiles. Nous proposons maintenant une stratégie souple employant des inhibiteurs chimiques pour identifier les kinases qui contrôlent la transition pluripotente à l'élaboration naïve dans les MESC. Cela repose sur des équipements, des réactifs et des matériaux simples qui sont disponibles pour la plupart des laboratoires qui étudient la signalisation cellulaire et la biologie ESC. Le développement d'un test rigoureux pour quantifier la transition entre les états pluripotents naïfs et préparés est essentiel au succès de cette plate-forme. L'établissement de cet essai nécessitait des modifications itératives importantes dans le plat cellulaireLa densité, le temps d'incubation des inhibiteurs et les conditions d'immunoblot.

Les approches de petites molécules gagnent une traction pour une utilisation rationnelle dans les applications ESC thérapeutiques ^{15 , 16} . Une forte résistance au dépistage de petites molécules est que les composés d'outils sont conçus et / ou modifiés pour une absorption cellulaire efficace. L'efficacité de la transfection n'est pas limitante, et l'utilisation de systèmes de livraison dangereux tels que le lentivirus n'est pas nécessaire. En outre, les inhibiteurs inhibent fréquemment des isoformes multiples dans une famille kinase ( p. Ex . Fgfr1-4, Jak1-3), qui surmonte la redondance fonctionnelle qui entrave les techniques d'interférence génétique ou génomique telles que l'ARNi et le CRISPR / Cas9. À mesure que des composés d'outils plus puissants et sélectifs deviennent disponibles à la fois dans des programmes de découverte de médicaments universitaires et pharmaceutiques, les kinases peu étudiées et mal connues seront poussées à l'avant-garde de la recherche ESC. Nous proposons donc que ce haut-Une approche de dépistage approfondie ouvrira de nouvelles avenues de recherche sur les réseaux de base de la CES.

Une limitation mineure de cette technologie est que même les inhibiteurs de petites molécules les plus puissants et sélectifs s'engagent et inhibent de multiples kinases indépendantes in vivo . Cependant, les données de profil de l'inhibiteur de kinase de plus en plus larges permettent d'identifier facilement les cibles fonctionnelles des inhibiteurs de la kinase (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibiteurs). Enfin, en principe, notre plate-forme peut être appliquée pour interroger toute collecte de petites molécules et / ou un dosage cellulaire pour lequel des anticorps immunoblotting de haute qualité sont disponibles. Cela permettra d'étudier de multiples systèmes de régulation dans la régulation de la pluripotence et de faciliter l'identification des inhibiteurs de petites molécules qui modifient divers processus cellulaires. Plus précisément, nous envisageons que l'application de collections émergentes de petites molécules telles que l'épigèneLes sondes tic développées par le Consortium de génomique structurale (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) ont le potentiel de découvrir d'autres régulateurs nouveaux de transitions pluripotentes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
fortes
CCE mESCs	ATCC	, ATCC  ; SCRC-1023
DMEM	Media Gibco	11965092
L-Glutamine	Gibco		25030081 Final : 2 mM
Pénicilline/Streptomycine	Gibco	15140122	Final : 50 U/ml
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Final : 0,1 mM
Facteur inhibiteur de la leucémie (fusion GST)	MRC-PPU réactifs et services		Final: 100 ng/mL
Facteur inhibiteur de la leucémie	Thermo	PMC9484	Finale : 100 ng/mL
Acides aminés non essentiels	Gibco	11140050	Final : 0,1 mM
Pyruvate de sodium	Gibco	11360070	Final : 1 mM
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Final : 5 %
Defined Fetal Bovin	Serum Fisher	10703464	Finale : 10 %
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
TC materials
Trypsin-EDTA (0,05 %), rouge phénol	Thermo	25300054  ;
Gélatine de peau de porc	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96 puits Microplaques	Thermo	156545
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190136
V-bottom 96 plaques de puits	Greiner Bio-one	651261
Nom	Entreprise<	strong>Numéro de catalogue	Comments
>Lysis Buffer
Tris buffer	VWR	103157P
Chlorure de sodium	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1 % NP-40	Sigma	9016-45-9
Sodium Désoxycholate	Sigma	D6750-100g
&bêta ;-glycérophosphate	Sigma	G9422
Pyrophosphate de sodium	Sigma	13472-36-1
Fluorure de sodium	Sigma	450022
Orthovanadate de sodium	Sigma	450243
Roche Inhibiteur complet de protéase Comprimés cocktail	Sigma	CO-RO
strong>Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>ChemicalsTween
	Sigma	P1379-1L
Lait en poudre	Marvel
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor ; M  ; Taille des pores (feuilles de 20 cm x 20 cm) (25 feuilles)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Laboratory Equipment
Minifold I Système	GE	10447850
Imageur ChemiDoc	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Antibodies
Anti-mouse Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Âne anti-Lapin	Licor	926-32213
Anti-souris-HRP	Technologie de signalisation cellulaire	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R& D Systems	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279