Évaluation de l'alternance spontanée, reconnaissance récente d'objets et assemblage des membres dans les modèles de souris transgéniques de la neuropathologie amyloïde-β et tau

Résumé

On décrit ici une approche de dépistage comportementale qui peut être utilisée pour cribler des composés qui présentent une efficacité in vivo sur les comportements moteurs cognitifs et fonctionnels dans les modèles de souris transgéniques de la β-amyloïdose et de la tauopathie. Ces méthodes sont optimisées pour filtrer les composés pour l'activité dans des tâches de mémoire à court terme et de travail.

Résumé

Ici, nous décrivons une approche de test comportementale mise en scène qui peut être utilisée pour dépister des composés qui présentent une efficacité in vivo sur les comportements moteurs cognitifs et fonctionnels dans les modèles de souris transgéniques de β-amyloïdose et de tauopathie. Le paradigme comprend des tests d'alternance spontanée dans un labyrinthe Y, une nouvelle reconnaissance d'objet et une fermeture des membres. Ces tests ont été sélectionnés parce qu'ils: 1) interroger la fonction des domaines cognitifs ou moteurs et les circuits neuronaux corrélés pertinents pour l'état pathologique humain, 2) avoir des points d'extrémité clairement définis, 3) avoir des contrôles de contrôle de qualité facilement réalisables, 4) peuvent être exécutés dans Un format de débit modéré, et 5) exigent peu d'intervention de l'enquêteur. Ces méthodes sont conçues pour les chercheurs qui cherchent à cribler des composés pour l'activité dans des tâches de mémoire à court terme et de travail, ou des comportements moteurs fonctionnels associés aux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer. Les méthodes décrites ici utilisent des tests comportementaux qui engUn certain nombre de régions du cerveau différentes, y compris l'hippocampe et diverses zones corticales. Les chercheurs qui souhaitent des tests cognitifs qui évaluent spécifiquement la cognition médiée par une seule région du cerveau pourraient utiliser ces techniques pour compléter d'autres tests de comportement.

Introduction

La maladie d'Alzheimer (AD) est un trouble neurodégénératif progressif entraînant un déclin cognitif débilitant qui touche environ 44 millions de personnes à travers le monde. À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements disponibles pour AD qui modifient la maladie, soulignant le besoin urgent de découverte préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie. Un certain nombre de modèles de souris transgéniques différents ont été créés qui récapitulent divers aspects de AD ^{1 , 2} , y compris les déficits dans les domaines cognitifs perturbés chez les patients ³ . Ces modèles de souris représentent un outil utile pour faciliter le dépistage efficace in vivo .

Lors de l'évaluation d'un composé pour une efficacité in vivo potentielle, une approche progressive doit être prise pour que les écrans d'efficacité dans les domaines cognitifs appropriés et surveille également les comportements qui pourraient influencer les points d'extrémité spécifiques utilisés pourSsess cognition. De nombreux modèles de souris transgéniques d'AD présentent une hyperactivité et d'autres comportements qui peuvent interférer avec un test cognitif particulier et interdire son utilisation dans le dépistage de médicaments ⁴ . En outre, pour une approche à mettre en œuvre dans un environnement de dépistage de drogue, les tests particuliers utilisés devraient maintenir au moins un débit modéré, avoir des paramètres définis clairement définis et une procédure nécessitant une intervention minimale des enquêteurs. En utilisant ces critères, des écrans comportementaux peuvent être implémentés qui présentent la reproductibilité, la faible variance intra et inter-dosage et les tailles d'effets nécessaires au dépistage des composés. Voici quelques-unes des méthodes que nous avons utilisées pour filtrer les composés efficaces pour atténuer les phénotypes cognitifs et moteurs présents dans les modèles de souris transgéniques de β-amyloïdose et de tauopathie ^{5 , 6} . Les méthodes décrites sont adaptées à partir des paradigmes comportementaux couramment utilisés signalés dans le lItération ⁷ , avec des optimisations spécifiques et des contrôles de contrôle de qualité afin qu'ils puissent être utilisés dans des modèles de souris transgéniques pertinents pour AD. Ce protocole peut être utilisé avec une variété de systèmes d'acquisition et d'analyse de données et suppose que l'investigateur possède une connaissance approfondie du logiciel associé.

Protocole

Les méthodes détaillées dans cette publication ont été examinées par le comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux (IACUC) chez Hilltop Laboratory Animals pour assurer un soin, une utilisation et un traitement humain respectueux des animaux conformément aux lois et règlements fédéraux, étatiques et locaux applicables, tels que Comme le Règlement fédéral sur le bien-être des animaux, les AWR (CFR 1985) et la Politique du service de santé publique sur les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire ou la Politique PHS (PHS 1996).

1. Lignes directrices générales pour toute évaluation comportementale

1. Avant toute manipulation d'animaux, couvrez les cartes de cage existantes avec une nouvelle carte de cage qui indique uniquement l'identifiant d'animal unique, aveuglé.
   NOTE: Les chercheurs qui manipulent des souris lors d'un dosage régulier de composé / placebo ne sont pas autorisés à manipuler des souris pour une évaluation comportementale.
2. Éteignez ou éteignez les feux aériens et ajustez l'éclairage de sorte que l'éclairage au sol de l'arène ou du labyrinthe soit de 30 à 35 lux.
3. FOu des études qui couvrent plusieurs semaines, enregistrent des poids corporels hebdomadaires comme une mesure indirecte de la santé globale.
   REMARQUE: Des contrôles supplémentaires en cage pour la qualité du manteau, la posture, la démarche et la locomotion spontanée peuvent être inclus si des contrôles de santé plus robustes sont justifiés.

2. Habituating Mice to Handling par les enquêteurs

1. Deux jours avant tout test de comportement, habituez les souris à la manipulation. Retirez la cage du support de cage et placez-la sur une surface plane.
2. Retirez le couvercle de la cage. Manipulez la souris exactement comme elle serait traitée pendant la performance du prochain test de comportement. Placez la souris dans une main en forme de vantail au-dessus de la cage de maison.
3. Mesurez la latence pour passer de la main de l'investigateur à la cage de la maison. Tenir les souris pendant 5 s maximum.
   REMARQUE: Les souris qui présentent des latences ≥ 2 s sont considérées comme «habituées». Les souris qui présentent des latences <2 s pendant le premier essai subissent 2 habituatio supplémentairesN sessions ce jour-là.
4. Demandez aux souris de subir 2 jours consécutifs de traitement de l'accoutumance. Notez toute souris qui n'est pas habitué à la fin du ^2ème jour.

3. Évaluation de la mémoire de travail spatial en mesurant l'alternance spontanée dans un labyrinthe Y ⁸

1. Avant l'utilisation initiale, nettoyez soigneusement le labyrinthe Y avec un chiffon germide non parfumé, 70% d'EtOH, suivi de dH ₂ O ⁹ . Désignez clairement les bras du labyrinthe comme 'A', 'B' et 'C' ou d'autres identificateurs uniques comparables.
2. Avant le début d'une session de test, configurez le système d'acquisition de données ou les caméras vidéo et configurez le suivi approprié des souris dans le labyrinthe. Calibrez la distance dans le labyrinthe à l'aide d'images vidéo capturées d'une règle ou d'un autre objet de longueur connue.
   REMARQUE: les méthodes comportementales dans cette procédure fonctionneront avec une variété de systèmes d'acquisition de données et les auteurs supposent toutNe effectuant cette procédure est compétent dans l'utilisation de leur système d'acquisition de données choisi. Les analyses de puissance indiquent que des tailles d'échantillon de 10 à 15 souris par groupe sont nécessaires pour un ß ≤ 0,2.
3. Retirez la cage de la crémaillère et placez-la doucement sur une table à proximité du labyrinthe Y. Retirez la souris de sa cage de maison et placez-la doucement dans un bras du labyrinthe Y, en face du centre. Demandez à l'enquêteur de s'éloigner suffisamment du labyrinthe afin que la souris ne puisse pas voir l'enquêteur.
4. Activez le système d'acquisition de données / vidéo immédiatement après le placement de la souris dans le labyrinthe.
5. Appuyez sur Play et enregistrez le comportement spontané pour chaque souris pendant une durée de 10 min. Une fois la session terminée, placez délicatement la souris dans sa cage de maison et renvoyez la cage sur le rack.
6. Nettoyez minutieusement le labyrinthe entre chaque session avec un chiffon germide non parfumé, 70% d'EtOH, suivi de dH ₂ O. Répétez l'étape 3.4 pour évaluer tout le microE.
7. Une fois que toutes les souris ont terminé l'exploration du labyrinthe Y, analyser les données du système d'acquisition ou noter manuellement les vidéos des sessions. Une entrée de bras se produit lorsque les 4 pattes de la souris traversent le seuil de la zone centrale et dans le bras et le museau de l'animal est orienté vers la fin du bras.
   REMARQUE: Les points d'extrémité qui seront analysés comprennent: la distance totale parcourue dans le labyrinthe, la distance totale parcourue dans chaque bras (y compris la zone centrale), le temps total passé dans chaque bras (y compris la zone centrale), le nombre total d'entrées de bras, le nombre de Les entrées dans chaque bras, et une liste séquentielle d'armes entrées pour évaluer le nombre d'alternances effectuées.
8. Une alternance spontanée se produit lorsqu'une souris entre dans un bras différent du labyrinthe dans chacune des 3 entrées de bras consécutives. L'alternance spontanée% est ensuite calculée avec la formule suivante.
   
   REMARQUE: Par exemple, iF l'ordre de l'entrée du bras était: ABCCBABCABC, l'investigateur marquerait un total de 6 alternances spontanées (dans l'ordre: ABC, ABC, ABC, BCA, CAB, ABC). Avec un total de 11 entrées de bras, le% d'alternance spontanée serait de 67%.
9. Effectuez les contrôles de contrôle de qualité suivants pour s'assurer que les données représentent une évaluation impartiale de l'alternance spontanée.
   1. Effectuer une corrélation Pearson de l'alternance spontanée% à la distance totale parcourue et le nombre d'entrées du bras effectué.
      NOTE: S'il existe une corrélation significative de l'alternance spontanée% à l'un ou l'autre paramètre, les données devraient être examinées plus en détail en raison de l'influence potentielle de la locomotion hyperdynamique sur le point final cognitif apparent ¹⁰ .
   2. Analyser le nombre d'entrées dans chaque bras avec un test ANOVA à 1 voie.
      REMARQUE: si cette analyse est significative, cela indiquerait la présence de signaux dans l'environnement qui attiraient des souris dans un regi particulierSur le labyrinthe.

4. Évaluation de la mémoire de reconnaissance à moyen terme en évaluant la reconnaissance d'objets nouveaux ^{11 , 12 , 13}

1. Pour chaque phase de ce test, nettoyer soigneusement l'arène de champ ouvert avec un chiffon germicide non blanchi, 70% d'EtOH suivi de dH ₂ O avant l'utilisation initiale.
2. Un jour avant l'exposition des objets, habituez les souris sur l'arène du champ libre.
   1. Avant le début de la séance d'habituation, configurez le système d'acquisition de données ou les caméras vidéo et confirmez le suivi approprié des souris dans le labyrinthe. Calibrer la distance dans l'arène à l'aide d'images vidéo capturées d'une règle ou d'un autre objet de longueur connue. Marquez les coins de l'arène dans le logiciel pour permettre le marquage des biais de position.
      REMARQUE: les méthodes de comportement dans cette procédure fonctionneront avec une variété d'acquisition de donnéesEt les auteurs supposent que toute personne qui effectue cette procédure est compétente dans l'utilisation de son système d'acquisition de données choisi. Les analyses d'énergie indiquent que des tailles d'échantillon de 15-20 souris par groupe sont nécessaires pour un ß ≤ 0,2.
   2. Retirez la cage de la crémaillère et placez-la doucement sur une table à proximité immédiate de l'arène.
   3. Retirez la souris de la cage de la maison et placez doucement la souris au centre de l'arène. Activez le logiciel de suivi et / ou le système d'enregistrement vidéo immédiatement après avoir placé la souris dans l'arène.
   4. Autoriser les souris à explorer librement l'arène pendant 30 min.
      REMARQUE: pendant cette période, les enquêteurs ne perturbent pas les souris.
   5. Après la séance d'habituation, placez les souris dans leur cage de maison et nettoyez soigneusement l'arène avec un chiffon germinatif non parfumé, 70% d'EtOH suivi de dH ₂ O.
   6. Répétez l'étape 4.2.2 jusqu'à ce que toutes les souris aient été habituées à l'arène.
   7. Après que toutes les souris aient été habituéesÀ l'arène, analysez la vidéo.
      NOTE: Les points d'extrémité à analyser comprennent la distance totale parcourue dans l'arène et le temps passé près de chaque coin. Si cela est pertinent pour le modèle de la souris, les comportements stéréotypés sont inclus dans ces analyses ( c.-à-d . Saut d'angle myoclonique, circling, etc. ). Les souris présentant des biais dans le temps passé dans des régions particulières de l'arène sont exclues de toute expérimentation, car cela influencera l'exploration d'objets.
      NOTE: La première phase de la nouvelle reconnaissance d'objet consiste à familiariser les souris avec un objet. Dans cette partie de la nouvelle procédure de reconnaissance d'objet, on appellera la phase d'échantillonnage.
   8. Avant le début d'une session de phase d'échantillonnage, placez des objets dans l'arène et fixez-les au sol avec un mastic de montage afin que les animaux ne puissent pas déplacer les objets. Alignez deux objets identiques à un mur particulier avec une distance suffisante entre les murs et les objets afin que les souris puissent explorer librement les objets de tous les angLes.
   9. Configurez le système d'acquisition de données ou les caméras vidéo et confirmez le suivi approprié des souris et des objets dans le labyrinthe. Calibrez les distances dans l'arène à l'aide d'images vidéo capturées d'une règle ou d'un autre objet de longueur connue.
   10. Marquez les coins de l'arène dans le logiciel pour permettre le marquage des biais de position. Marquer les objets dans le logiciel et suivre leur comportement d'exploration séparément pour chaque objet ( c.-à-d . "Objet A" et "Objet B").
   11. Retirez la cage de la crémaillère et placez-la doucement sur une table à proximité de l'arène.
   12. Retirez la souris de la cage de la maison et placez-la doucement dans le centre de l'arène face aux objets.
   13. Autoriser la souris à explorer librement les objets pendant 15 min. Pendant cette période, ne pas déranger les souris.
   14. À la fin de la séance, placez doucement la souris dans sa cage de maison. Nettoyez l'arène et les objets avec 70% d'EtOH et dH ₂ O. Placez ces objets dans la pièceE arena.
   15. Répétez l'étape 4.2.11 jusqu'à ce que toutes les souris soient familiarisées avec un objet.
   16. Une fois que toutes les souris ont été familiarisées avec un objet, analysez les vidéos.
       REMARQUE: Les explorations d'objet sont comptées une fois que les critères suivants ont été respectés: la souris est orientée vers l'objet, le museau est à moins de 2 cm de l'objet, le point médian du corps de l'animal est supérieur à 2 cm de l'objet et le critère précédent Ont été remplis pendant au moins 1 s. En outre, si un animal a satisfait aux critères d'exploration mais présente une immobilité de> 10 s, le combat exploratoire est réputé terminé.
   17. Calculez un score de polarisation d'objet pour chaque souris comme suit.
       
       REMARQUE: Les souris présentant un score de polarisation d'objet inférieur à 20% ou supérieur à 80% sont exclues de toute autre expérimentation.
3. La phase finale de la reconnaissance d'objets nouveaux implique d'évaluer le comportement exploratoireVisant à la fois un objet nouveau et familier dans l'environnement, appelé ici la phase de test. Cette phase est effectuée 2-3 h après l'achèvement de la phase d'échantillonnage.
   1. Avant le début d'une phase de test, placez des objets dans l'arène et les fixez au sol afin que les animaux ne puissent pas déplacer les objets.
      1. Placez les objets dans la même position dans l'arène par rapport à la phase d'échantillonnage ¹³ .
      2. Équilibrez la position relative des objets nouveaux et familiers à travers les génotypes et les groupes de traitement.
      3. Assurez-vous qu'il y a suffisamment de distance entre les murs et les objets afin que les souris puissent explorer librement les objets sous tous les angles.
   2. Configurez le système d'acquisition de données et / ou les caméras vidéo. Confirmer le suivi approprié des souris et des objets dans le labyrinthe. Calibrer les distances dans l'arène à l'aide d'images vidéo capturées d'une règle ou d'un autre objet de longueur connue.
   3. Marquez les coins de l'arène dans le softwSont pour permettre la notation des biais positionnels. Marquer les objets dans le logiciel et suivre le comportement d'exploration pour chaque objet individuellement ( c.-à-d . "Novel" et "Familiar").
   4. Retirez la cage de la crémaillère et placez-la doucement sur une table à proximité de l'arène.
   5. Placez délicatement les animaux dans le centre de l'arène, face aux objets. Enregistrez des souris librement explorer des objets pendant 10 min.
   6. À la fin de la séance de test, retirez les souris de l'arène et placez les souris dans leur cage de maison. Nettoyer soigneusement l'arène et les objets avec un chiffon germinatif sans parfum, 70% EtOH et dH ₂ O après chaque séance.
   7. Répétez l'étape 4.4.3 jusqu'à ce que tous les animaux aient été évalués.
   8. Une fois l'exploration d'objet mesurée pour toutes les souris, les vidéos sont analysées.
      REMARQUE: les explorations d'objet sont comptées une fois que les critères suivants ont été respectés: la souris est orientée vers l'objet, le museau se trouve à moins de 2 cm de l'objet, le point médian deLe corps de l'animal est au-delà de 2 cm de l'objet et les critères précédents ont été remplis pendant au moins 1 s. En outre, si un animal a satisfait aux critères d'exploration mais présente une immobilité de> 10 s, le combat exploratoire est réputé terminé.
   9. Évaluer la nouvelle reconnaissance d'objets en comparant le temps passé à explorer le roman à l'objet familier. Trois méthodes sont communément rapportées dans la littérature.
      1. Analyser le temps brut consacré à explorer des objets nouveaux et familiers en utilisant un test de mesure répété. Cette méthode est mieux utilisée lorsque le génotype et / ou le traitement n'affectent pas le temps d'exploration total.
      2. Calculez la préférence de nouveauté, en utilisant l'équation:
         
         REMARQUE: cela fournit le pourcentage de temps passé à explorer l'objet nouveau par rapport à l'exploration de l'objet total. Les valeurs varient de 0% (pas d'exploration de l'objet nouveau) à 100% (exploration uniquement du roman obJect), avec une valeur de 50% indiquant le même temps d'exploration d'objets nouveaux et familiers.
      3. Calculer l'indice de discrimination ¹¹ , en utilisant l'équation:
         
         REMARQUE: cela permet de décrire le temps passé à explorer le roman et les objets familiers par rapport au temps total consacré à l'exploration d'objets. Les valeurs varient de -1 (exploration seulement de l'objet familier) à +1 (exploration uniquement de l'objet nouveau, avec une valeur de 0 indiquant le même temps d'exploration d'objets nouveaux et familiers.
   10. Retirer les animaux qui ne participent pas à la séance de test en raison de la locomotion hyperdynamique ou d'autres stéréotypes, de la prise en compte ¹¹ .
       REMARQUE: Les critères utilisés pour le retrait doivent être objectifs et déterminés a priori pour le modèle de la souris ( c.-à-d . <5 ^e percentile pour le temps d'exploration total et> 100 moyenneAngle de virage lors de la séance de test ou> temps de 50 ^e percentile présentant un saut d'angle myoclonique).

5. Évaluation de la fonction cortico-spinale chez les souris avec l'assemblage des membres ¹⁴

1. Document vidéo toute la session. Enregistrez la vidéo à l'aide d'un appareil portable portatif ( c.-à-d ., Smartphone ou équivalent).
   NOTE: Les analyses d'énergie indiquent que des tailles d'échantillon de 10 à 15 souris par groupe sont nécessaires pour un ß ≤ 0,2.
2. Retirez la cage de la maison de la grille et placez-la sur une table. Indiquez l'ID de l'animal dans la vidéo avant l'étape suivante.
3. Retirez doucement la souris de sa cage et suspendez la queue pendant 5-10 s. La vidéo doit enregistrer les pattes postérieures et les pattes avant de l'animal en suspension.
4. Après avoir capturé au moins 5 s de vidéo, placez la souris dans sa cage de maison et renvoyez la cage sur le rack.
5. Nettoie la table. Répétez l'étape 5.2 jusqu'à ce que toutes les souris aient été recorde ré.
6. Notez le partage des membres à partir de vidéos de souris suspendues par leur queue sur une échelle de 0-4 (voir le tableau 1 pour la description de la notation). Inspectez les vidéos de souris suspendues, puis attribuez un score en fonction des critères suivants.
   1. Pas de fermeture des membres. Extension d'échappement normale. Un membre postérieur présente un jeu incomplet et une perte de mobilité. Les orteils présentent un splay normal.
   2. Les deux membres postérieurs présentent un jeu incomplet et une perte de mobilité. Les orteils présentent un splay normal.
   3. Les deux membres postérieurs s'accrochent avec les orteils et l'immobilité enroulés.
   4. Les membres antérieurs et les membres postérieurs se forment et se croisent, les orteils enroulés et l'immobilité.
7. Toutes les souris sont marquées par 2 chercheurs indépendants. Toute souris sur laquelle les 2 scores diffèrent de plus d'un point est reprise une fois de plus.
   1. Les scores qui diffèrent sont en moyenne.

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Tableau 1: Description des scores d'adhérence des membres.

Résultats

Les souris Tg2576 vieillies présentent des déficits robustes dans les alternances spontanées réalisées dans un labyrinthe Y ^{15 , 16} , un phénotype qui peut être répliqué en utilisant les méthodes détaillées ici ( Figure 1A ). Alors qu'une tendance à l'augmentation des entrées de bras est observée chez ces souris ( figure 1B ), l'hyperactivité observée dans cette ligne de souris n'a pas affecté le taux d'alternance spontanée ( figure 1C ). En revanche, les souris rTg4510 âgées semblent présenter une alternance spontanée accrue lorsqu'elles sont placées dans un labyrinthe Y ( Figure 1D ). Ceci est dû à une hyperactivité extrême ( figure 1E ) et à la stéréotypie ¹⁰ , ce qui interfère de manière significative avec la mesure de l'alternance spontanée ( figure 1F ). Lors de l'évaluation initiale des souris dans cette tâche, il est essentiel de s'assurer que les entrées de bras et / ou la distance parcourue ne sont pasSignificativement corrélée avec le taux d'alternance spontané.

Avant l'évaluation de la nouvelle reconnaissance d'objets, les souris sont habituées à l'arène où le test sera effectué. Pendant l'habituation, l'hyperactivité ( Figure 2A ) et d'autres comportements stéréotypés pertinents pour le modèle de souris peuvent être évalués. Au cours de la phase d'échantillonnage, il est essentiel de mesurer l'exploration de chaque objet séparément afin que les souris qui présentent des biais significatifs dans le comportement exploratoire puissent être exclues de l'évaluation ultérieure ( Figure 2B , cercles ouverts). La reconnaissance de nouveaux objets est évaluée en comparant l'exploration d'un objet familier et nouveau et est généralement analysée de trois manières différentes. Si le temps d'exploration total est comparable entre les génotypes et / ou les groupes de traitement, le temps brut d'exploration de chaque objet et les tests de mesures répétées appropriés peuvent être utilisés pour déterminer s'il existe des différences dans l'objet nouveau rÉcognition ( Figure 2C ). Si une souche de souris particulière présente des différences dans le temps d'exploration total, une nouvelle reconnaissance d'objet peut être évaluée en utilisant soit la préférence de nouveauté ( Figure 2D ), soit l'indice de discrimination ( Figure 2E ).

Le calçage des membres est un test moteur fonctionnel qui quantifie les déficits de la fonction cortico-spinale. Le calçage des membres, qui n'est pas une mesure cognitive, est observé dans plusieurs modèles transgéniques de souris tau ^{6 , 17 , 18 , 19} et récapitule certains des déficits moteurs fonctionnels observés chez les patients souffrant d'AD tardive. La suspension des souris par la queue provoque une réponse d'échappée ( Figure 3A , "0"). Les déficits dans la capacité à écarter les membres postérieurs et à prolonger les orteils sont marqués en fonction de leur gravité sur une échelle de 0 à 4 ( figure 3A). En utilisant la procédure décrite ici, on peut observer une adhérence importante dans les souris rTg4510 ( Figure 3B ).

Figure 1: Alternance spontanée dans le labyrinthe Y. ( A ) Lorsqu'ils sont placés dans un labyrintase Y, les souris adoptent une stratégie de recherche de perte de vitesse qui aboutit à un modèle d'exploration par lequel chaque bras est exploré une seule fois pour chaque entrée de 3 bras. Les souris Tg2576 vieillies présentent un déficit important d'alternance spontanée. En utilisant les procédures décrites dans cette méthode, une restauration importante d'une alternance spontanée a été observée après traitement avec un composé breveté. Les données ont été analysées à l'aide de l'ANOVA à 1 voie et les comparaisons post-hoc au Tg-PBS ont été effectuées à l'aide du test de Dunnett. ** p <0,01. Les barres d'erreur indiquent SEM. ( B ) Le nombre d'entrées du bras n'a pas été significativement différentDes groupes surveillés dans cette expérience. Les données ont été analysées en utilisant un test ANOVA à 1 voie. Les barres d'erreur indiquent SEM. ( C ) Il n'y avait aucune corrélation entre l'alternance spontanée et le nombre d'entrées du bras, ce qui indique que toute différence dans l'activité locomotrice spontanée n'a pas eu d'incidence sur la quantification de l'alternance spontanée. Le test de corrélation a été effectué en utilisant l'analyse de corrélation de Pearson. ( D ) Lorsqu'ils sont placés dans un labyrinthe Y, les souris rTg4510 (6 mois) semblent présenter une alternance beaucoup plus spontanée par rapport aux souris WT de litière. Les données ont été analysées par 1-way ANOVA et les comparaisons post-hoc à Tg-PBS ont été effectuées en utilisant le test de Dunnett. ** p <0,01. Les barres d'erreur indiquent SEM. ( E ) rTg4510 a augmenté significativement les entrées de bras en raison de leur extrême hyperdynamique. Les données ont été analysées par 1-way ANOVA et les comparaisons post-hoc à Tg-PBS ont été effectuées en utilisant le test de Dunnett. *** p <0,001. Les barres d'erreur indiquent SEM. ( F ) Le comportement d'alternance spontanée est significativement corrélé avec les entrées du bras, ce qui indique que le phénotype hyperdomynamique des locomoteurs a obscurci une véritable alternance spontanée. Le test de corrélation a été effectué à l'aide de l'analyse de corrélation de Pearson (r = 0,7, p <0,0001). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Reconnaissance d'objets nouveaux. ( A ) L'habituation de l'arène permet de mesurer la locomotion spontanée et d'autres comportements stéréotypés pertinents pour un modèle de souris particulier. Ici, les souris Tg2576 âgées (22 mois) présentent une locomotion nettement plus spontanée par rapport aux souris WT de litière. Les données ont été analysées par 1-way ANOVA et les comparaisons post-hoc à Tg-Veh ont été effectuées en utilisant Dunnett 'S test. ** p <0,01. Les barres d'erreur indiquent SEM. ( B ) Pendant la phase d'échantillonnage, l'exploration de deux objets identiques a été suivie séparément. Les souris qui présentent des biais importants vers l'exploration de l'un des deux objets (cercles ouverts) ont été exclues de la phase d'essai. ( C - E ) La reconnaissance de nouveaux objets a été évaluée en mesurant l 'exploration d' un objet nouveau et familier. La reconnaissance de nouveaux objets a été évaluée à l'aide de ( C ) temps d'exploration brute, ( D ) préférence de nouveauté ou indice de discrimination ( E ). Les données du panel C ont été analysées à l'aide d'une ANOVA bidirectionnelle avec des mesures répétées et des comparaisons par paires ont été réalisées à l'aide du test de Sidak. Les données dans les panneaux DE ont été analysées avec une ANOVA à 1 voie et des comparaisons post-hoc à Tg-Veh ont été faites en utilisant le test de Dunnett. * P <0,05, ** p <0,01. Les barres d'erreur indiquent SEM. Cliquez s'il vous plaitIci pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Collage des membres. ( A ) Des images représentatives de souris présentant différents degrés d'adhérence de membres comme décrit dans le tableau 1. ( B ) Les souris rTg4510 (6 mois) présentent une adhérence importante par rapport aux souris WT de litière telles qu'elles sont évaluées selon ces méthodes. Les données ont été analysées à l'aide d'une ANOVA à 1 voie et des comparaisons post-hoc au Tg-PBS ont été effectuées à l'aide du test de Dunnett. *** p <0,001, **** p <0,0001. Les barres d'erreur indiquent SEM. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes
Cette procédure a été conçue pour détecter l'activité in vivo des composés dans des modèles de souris transgéniques de β-amyloïdose et de tauopathie. L'approche par étapes utilisée ici assure la détection de composés efficaces dans des domaines cognitifs pertinents pour AD ³ . En outre, l'approche détaillée ici utilise des tests de comportement qui ont des points d'extrémité clairement définis, des contrôles de contrôle de qualité facilement réalisables, peuvent être exécutés avec un format de débit modéré et nécessitent peu d'intervention de l'enquêteur. Ces caractéristiques aboutissent à des analyses qui présentent une bonne reproductibilité chez les animaux et à travers les cohortes, ce qui entraîne une faible variance intra et inter-dosage et des tailles d'effet (2 ≤ f ≤ 6) suffisamment robustes pour supporter le profil comportemental dans un environnement de découverte de médicaments.

Étapes essentielles au sein du PrOtocol
Beaucoup de modèles de souris utilisés pour la découverte de médicaments AD détectent des comportements compatibles avec une anxiété et une agression accrues. Cela rend l'habitude de manipulation essentielle pour l'exécution de l'un des tests comportementaux décrits ici. Comme ces tests reposent sur des comportements non motivés, la manipulation brutale de l'investigateur en raison d'une souris hyperactive et anxieuse ou agressive peut influencer de manière significative les performances. Une anxiété accrue pourrait entraîner l'échec de l'exécution de la tâche, réduisant ainsi la puissance globale du test. En outre, les niveaux de lumière dans l'arène sont essentiels pour faciliter la locomotion spontanée nécessaire pour chaque test. La lumière lumineuse tend à augmenter l'anxiété et à supprimer la locomotion chez les rongeurs, il faut donc veiller à ajuster les niveaux de lumière ambiante à 30-35 lux dans l'arène.

Un autre aspect critique de la procédure consiste à minimiser les indices environnementaux solides qui entraveraient la capacité d'un animal à effectuer les tâches. Nettoyage de laL'arène et les objets entre les courses sont essentiels car les souris sont attirées par de nouveaux parfums dans l'environnement. Le fait de ne pas nettoyer soigneusement l'arène et les objets pourrait entraîner une inclinaison de l'activité spontanée de la souris et masquer les performances cognitives réelles. Les chercheurs devraient également minimiser l'utilisation de produits d'hygiène personnelle et de colognes / parfums lors de l'exécution de ces procédures. Enfin, les rongeurs présentent de solides changements diurne et circadien dans de nombreux comportements ouverts ^{20, y} compris l'apprentissage et la mémoire ²¹ . Par conséquent, pour minimiser la variance due aux rythmes diurnes dans les comportements basaux et les performances cognitives, tous les tests devraient être effectués au même moment de la journée à travers les cohortes et les études.

De plus, en particulier en ce qui concerne la reconnaissance de nouveaux objets, l'intervalle de délai entre l'échantillon et la phase de test, et la sélection et le placement d'objets dans l'environnement sont des paramètres critiques. La mémoire existe sous 3 formes distinctes: mémoire à court termeOry (STM), mémoire à terme intermédiaire (ITM) et mémoire à long terme (LTM) ^{22 , 23} . La modification de l'intervalle entre l'échantillon et les phases de test de minutes (STM) à heures (ITM) ou jours (LTM) changera le type de mémoire testé par la procédure ¹² . En outre, avant d'exécuter le nouveau test de reconnaissance d'objet, de nombreux objets devraient être sélectionnés dans une cohorte test de souris pour des biais potentiels dans l'exploration. Un objet excessivement attrayant ou répulsif pour la cohorte d'essai ne peut pas être utilisé lors de l'évaluation de la reconnaissance de nouveaux objets. Idéalement, tous les objets qui seront utilisés dans le test, lorsqu'ils seront placés dans une arène, généreront des temps d'exploration égaux à partir d'une cohorte de souris indigène. Un test et une optimisation inadéquats des objets peuvent réduire considérablement la puissance de la nouvelle reconnaissance d'objets.

Modifications et dépannage
Il existe plusieurs facteurs qui pourraient augmenter leVariabilité apparente dans les tests cognitifs décrits ici. De nombreux modèles de souris de l'AD présentent une locomotion hyperdynamique ³ qui peut masquer ou modifier les comportements mesurés comme critère cognitif. De plus, il existe de plus en plus de preuves que le sexe ^{24 , 25 , 26} et même le génotype maternel ²⁷ peut influencer le développement et la progression de la neuropathologie et des phénotypes cognitifs dans les modèles de souris AD. La variabilité inattendue ou l'échec de la mise en œuvre d'une tâche comportementale pourrait être dû à l'un de ces facteurs. Lors de la première mise en œuvre d'un test de comportement particulier, les résultats doivent toujours être stratifiés selon le sexe, l'âge et, le cas échéant, le génotype maternel. En outre, les contrôles de qualité décrits dans cette procédure doivent toujours être effectués pour s'assurer que l'hyperactivité ou d'autres comportements stéréotypés n'interfèrent pas avec la quantification des paramètres cognitifs.

EnvL'ironisation peut également influencer le comportement exploratoire spontané des rongeurs. Les parfums ou les sons qui sont indétectables pour les chercheurs pourraient attirer ou repousser les souris, faussant les résultats des tests cognitifs qui reposent sur un comportement spontané. Lorsqu'il établit initialement une reconnaissance de Y-maze ou un nouvel objet, la performance des mesures de contrôle pour s'assurer qu'il n'y a pas de biais de position dans l'exploration d'objets et / ou de l'environnement est essentielle. Si les biais de position sont observés, les enquêteurs doivent surveiller minutieusement l'environnement et éventuellement ajuster l'éclairage, le classement de l'arène, la localisation de la salle d'essai par rapport aux autres pièces de l'installation ( c.-à-d. , Pas près d'une zone de trafic ou d'équipement lourd) et des procédures de nettoyage de l'arène.

L'habituation à l'environnement de test est la clé pour obtenir des performances optimales dans le nouveau test de reconnaissance d'objets. Par exemple, les faibles temps d'exploration total peuvent être attribuables à une habitude insuffisante. Comme alternative au procLes calculs décrits ici pour la manipulation (section 2) et l'arène (section 4.2), l'accoutumance à la manipulation et l'environnement de test peuvent être effectués en 3, 5 minutes par jour pendant 2 jours consécutifs.

Limites de la technique
Comme pour toute procédure, ces tests comportementaux ont des limites. Ces procédures ont été utilisées parce qu'elles testent la fonction de diverses régions corticales et de l'hippocampe. Si le modèle de la souris ne présente pas de déficits fonctionnels dans les régions cérébrales sondées par ces tests, ces techniques ne seront pas utiles. En outre, nous avons choisi des tests cognitifs qui utilisent la mémoire à court terme. Si le mécanisme d'action du composé dans le cadre d'une évaluation préclinique ne devrait pas affecter la mémoire à court terme, ces procédures devraient être modifiées en conséquence ( c.-à-d . Augmenter l'intervalle de phase de test d'échantillon pour tester la mémoire à long terme). Enfin, ces tests utilisent des comportements non motivés. Par conséquent, si un modèle de souris est excesExtrêmement hyperactif ou affiche d'autres comportements stéréotypés qui empêchent l'exploration de l'environnement, alors ces procédures pourraient ne pas être optimales. En alternative, on pourrait utiliser le conditionnement de la peur pour Tg2576 ou d'autres modèles de souris ß-amyloïdose, ou le labyrinthe spatial pour rTg4510 ou d'autres modèles de tauopathies de souris ³ .

Applications futures
Une fois que ces procédures ont été adoptées avec succès dans le laboratoire, plusieurs modifications ou extensions peuvent être faites pour évaluer les mesures moteur cognitives et fonctionnelles supplémentaires. Par exemple, modifier la nouvelle tâche de reconnaissance d'objet pour déterminer si une souris peut reconnaître une modification dans le placement d'un objet ¹³ . Alternativement, au lieu d'utiliser des objets, on pourrait utiliser d'autres souris et mettre en œuvre un test de reconnaissance sociale. En ce qui concerne le serrage des membres et la fonction du moteur, on pourrait compléter ce test par les tests de résistance au four et / ou à la force de préhension. Les testsDétaillés dans cette méthode forment une base solide pour filtrer les composés qui ont une efficacité in vivo dans les modèles de souris translationnels pour AD et peuvent être adaptés ou modifiés de plusieurs façons pour mieux interroger un modèle de souris particulier ou répondre aux besoins d'un programme unique de découverte de médicaments .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Topscan Lite-High Throughput	Cleversys		Analyse comportementale automatisée. Comprend des caméras et un système d’acquisition vidéo, un ordinateur portable.
ObjectScan	Module logiciel Cleversys		pour une quantification précise de l’exploration d’objets
Champ ouvert pour souris	Cleversys	CSI-OF-M	Arena pour la reconnaissance d’objets inédits
Labyrinthe en Y pour souris	personnalisés		: 30 cm de long, 10 cm de large, 20 cm de haut, placés à 120 degrés de distance.
Support de caméra pour champ ouvert	Custom	Custom	76 cm de haut, 115 cm de large, caméras montées @ 30 cm de chaque côté. Deux passe-partout, chacun couvrant deux boîtes.
Support de caméra pour Y-maze	Custom		Custom de 76 cm de haut, 115 cm de large, caméras montées @ 30cm de chaque côté. Une monture couvre deux labyrinthes.
Marbles	Inperial Toy	8565	Standard (15,5 mm Dia) billes en verre.
Dés	Cardinal Industries	770	Standard (0,650 pouce) dés blancs avec points noirs.
LOCTITE Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	Standard bleu collant tak
EtOH	Nexeo Solutions	82452	100 % Éthanol Dilué à 70 % à l’aide d’eau distillée
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320
Essuie-tout	Procter & Gamble	B019DM86LA	Bounty, caméra vidéo portable blanche
	Apple, Inc.	MKV92LL/A	Acquisition de Limb serrasping vidéo, Iphone 6S Plus (ou équivalent fonctionnel).
Gants	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	Standard, Gants en latex non poudrés,
Posemètre	Dr. Meter	LX1330B	Éclairage @ le bas du champ ouvert = 35 LUX, Éclairage @ le bas du labyrinthe en Y= 32 LUX
Lingettes germicides à l’eau de Javel	Clorox		Stérilisation de l’équipement pendant et après l’utilisation