Optimisation et analyse comparative des méthodes d'enrichissement de l'ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Résumé

La comparaison et l'optimisation de deux méthodes d'enrichissement d'ADN organellaire végétal sont présentées: centrifugation différentielle traditionnelle et fractionnement de l'ADNc total basé sur l'état de méthylation. Nous évaluons la quantité et la qualité d'ADN qui en résultent, démontrons la performance dans le séquençage de prochaine génération de lecture courte et discutons le potentiel d'utilisation dans le séquençage à une seule molécule à longue lecture.

Résumé

Les génomes organellaires végétaux contiennent de gros éléments répétitifs qui peuvent faire l'objet d'un couplage ou d'une recombinaison pour former des structures complexes et / ou des fragments sub-génomiques. Les génomes organellés existent également dans des mélanges à l'intérieur d'une cellule ou d'un type de tissu (hétéroplasmique) donné, et une abondance de sous-types peut changer tout au long du développement ou sous stress (déplacement sous-stoechiométrique). Les technologies de séquençage de la prochaine génération (NGS) sont nécessaires pour obtenir une compréhension plus approfondie de la structure et de la fonction du génome organellaire. Les études de séquençage traditionnelles utilisent plusieurs méthodes pour obtenir l'ADN organellaire: (1) Si une grande quantité de tissu de départ est utilisée, elle est homogénéisée et soumise à une centrifugation différentielle et / ou à une purification par gradient. (2) Si une quantité plus petite de tissu est utilisée ( c'est-à-dire, si les graines, le matériau ou l'espace est limité), le même processus est effectué comme dans (1), suivi d'une amplification complète du génome pour obtenir un ADN suffisant. (3) L'analyse de bioinformatique peut être utilisée pour seqL'ADN génomique total et d'analyser les lectures organiques. Toutes ces méthodes ont des défis et des compromis inhérents. Dans (1), il peut être difficile d'obtenir une telle quantité importante de tissu de départ; Dans (2), l'amplification du génome entier pourrait introduire un biais de séquençage; Et dans (3), l'homologie entre génomes nucléaires et organellars pourrait entraver l'assemblage et l'analyse. Dans les plantes à grands génomes nucléaires, il est avantageux d'enrichir l'ADN organellaire pour réduire les coûts de séquençage et la complexité des séquences pour les analyses de bioinformatique. Ici, nous comparons une méthode de centrifugation différentielle traditionnelle avec une quatrième méthode, une approche CpG-méthyle modifiée, pour séparer l'ADN génomique total en fractions nucléaires et organellaires. Les deux méthodes produisent suffisamment d'ADN pour le NGS, l'ADN qui est très enrichi pour les séquences organellaires, mais à des rapports différents dans les mitochondries et les chloroplastes. Nous présentons l'optimisation de ces méthodes pour le tissu des feuilles de blé et discutons des avantages majeurs et dDes avantages de chaque approche dans le contexte de l'apport d'échantillon, la facilité du protocole et l'application en aval.

Introduction

Le séquençage du génome est un outil puissant pour disséquer la base génétique sous-jacente des traits importants de la plante. La plupart des études de séquençage génomique se concentrent sur le contenu du génome nucléaire, car la majorité des gènes sont situés dans le noyau. Cependant, les génomes organellars, y compris les mitochondries (à travers les eucaryotes) et les plastides (dans les plantes, la forme spécialisée, le chloroplaste, les travaux de la photosynthèse) apportent des informations génétiques importantes essentielles au développement de l'organisme, à la réponse au stress et à la condition physique globale ¹ . Les gé....

Protocole

1. Génération de matériaux végétaux pour l'isolement organellaire et l'extraction d'ADN

1. Croissance standard des semis de blé
   1. Plantez des graines dans de la vermiculite dans de petites casseroles carrées avec 4 à 6 graines par coin. Transférer dans une serre ou une chambre de croissance avec un cycle léger de 16 h, 23 ºC jour / 18 ºC de nuit.
   2. Eau les plantes chaque jour. Fertiliser les plantes avec ¼ c. À thé d'engrais granulés 20-20-20 NPK après germination et 7 jours après germination.
2. Étiologie alternative des semis de blé
   1. Suivez l'étape 1.1, mais placez....

Résultats

Les protocoles présentés dans ce manuscrit décrivent deux méthodes distinctes pour enrichir l'ADN organellaire du tissu végétal. Les conditions présentées ici reflètent l'optimisation du tissu de blé. Une comparaison des étapes clés dans les protocoles, l'apport de tissus requis et la sortie d'ADN sont décrites à la figure 1 . Les étapes du protocole DC testé suivent des conditions similaires à celles décrites précédemment ( Figure 1A

Discussion

À ce jour, la plupart des études de séquençage organellaire se concentrent sur les méthodes DC traditionnelles pour enrichir l'ADN spécifique. Des méthodes pour isoler des organites de diverses plantes ont été décrites, y compris la mousse ⁴⁰ ; Monocoques telles que le blé ¹⁵ et l'avoine ¹¹ ; Et des dicotylédones comme l'arabidopsis ¹¹ , le tournesol ¹⁷ et le colza ¹⁴

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-mercaptoéthanol (bêta-mercaptoéthanol ; BME)	Sigma Aldrich	M3148-100ml
2-propanol (alcool isopropylique/isopropanol), bioréactif	Agarose Sigma Aldrich	I9516
, Bio-Rad Agarose mégabase cétifiée Bio-Rad		1613108
balance analytique	Mettler Toledo	AB54-S
balance	Mettler Toledo	PB1502-S
sérum bovin albumine (BSA)	Sigma Aldrich	B4287-25G
Cylindres de broyage en céramique, 3/8 po x 7/8 po	SPEX SamplePrep	2183
Blocs cryogéniques compatibles avec l’homogénéisateur de tissus pour contenir des tubes de 50 mL	SPEX SamplePrep	2664
DNaseI	Sigma	DN25
éthanol, absolu	Decon Laboratories	2716
Acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA), solution 0,5 M, pH 8,0	Fisher	BP2482-500
			d’imagerie sur gel
colorant			tel que GelRed ou bromure d’éthidium
pilon de broyage, pointe large pour tubes
Guanidine-HCl, solution 8 M	ThermoFisher	24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001
azote
Enzymes de lyse de Trichoderma harzianum	Sigma	L1412
Chlorure de magnésium	G Bioscience	24115
Rack magnétique	ThermoFisher	A13346
Tubes de microcentrifugation, LoBind 1,5 mL  ;	de	Eppendorf
, standard sans nucléases 1,5 mL	Eppendorf
, réfrigérée	Sorvall  ;	Legend X1R	Ou un produit équivalent, doit être capable d’atteindre au moins 18 000 x g avec des rotors pour tubes de 50 ml, des tubes Oak Ridge et des tubes de 1,5 mL
microcentrifugeuse, à température ambiante	Eppendorf	5424	Ou un produit équivalent, doit être capable d’atteindre au moins 18 000 x g avec un rotor pour des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml et 2 ml
Unités de filtre centrifuge à débit rapide Microcon DNA	EMD Millipore	MRCFOR100
Miracloth, 1 carré par échantillon coupé pour s’adapter à l’entonnoir	EMD Millipore	475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit	New England Biolabs	E2612L
parafilm	Parafilm	M PM992
pots et plateaux
polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher	BP431-100
Proteinase K	Qiagen	19131
Appareil d’électrophorèse en champ pulsé sur gel (par exemple CHEF DR III)	de purification 1703697		Bio-Rad
, perles Agencourt AMpureXP	Beckman Coulter	A63881
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
Qiagen 20/g Genomic Tip Kit d’extraction d’ADN	Qiagen	10223
Qiagen Buffer EB (tampon d’élution)	Qiagen	19086
Qiagen Kit de tampons d’extraction d’ADN	Qiagen	19060
QiaRack	Qiagen	19015
machine qPCR (par ex. Roche Light Cycler 480)	Roche
qPCR plaque film d’étanchéité	Roche	4729757001
plaque qPCR, plaque 96 puits	Roche	4729692001
Qubit  ; Tubes d’essai	Life Technologies	Q32856
Kit d’essai à large spectre Qubit	Life Technologies	Q32850
Kit d’essai à haute sensibilité Qubit	Life Technologies	Q32851
RNaseA	Qiagen	19101
Pipettes sérologiques (20 mL) et aide à la pipette	Fisher	13-678-11
Petits entonnoirs, 1 par échantillon
Chlorure de sodium	Ambion	AM9759
Pinceau doux, 2 par échantillon
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder ou un autre type d’homogénéisateur de tissus	SPEX SamplePrep		Ou un autre homogénéisateur de tissus comparable. Si vous n’avez pas accès à un homogénéisateur de tissus, le broyage dans un mortier et un pilon pré-refroidis suffira (voir le protocole pour plus de détails). Cependant, un homogénéisateur donnera des résultats plus cohérents et le temps total d’homogénéisation est réduit.
Sucrose	Omnipure	8550
TBE
thermomélangeur
Tris	Sigma	T2819-100ml
Triton X-100	Promega	H5142
rotatifs
, 50 mL conique polypropylène	Corning	352070
tubes, 50 mL polypropylène haute vitesse  ;	ThermoScientific/Nalgene	3119-0050	par exemple tubes Nalgene Oakridge ou eau de
bain-marie
vermiculite
équivalente, stériles et certifiés sans nucléases.	Fisher	1481
eau, stérile milliQ