In Vitro Imaging et la quantification de l'efficacité de ciblage des médicaments d'Analogues GnRH marqué par fluorescence

Résumé

Sélectivement marqué fluorescent GnRH-I, -II et -III dérivés sont des outils fiables pour le suivi et la quantification de leur absorption cellulaire. Ce manuscrit présente des expériences pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité d'absorption de ces conjugués de GnRH dans diverses lignées cellulaires.

Résumé

analogues de la GnRH sont des fragments de ciblage efficaces et capables de délivrer des agents anti-cancéreux de manière sélective dans des cellules tumorales malignes qui expriment fortement les récepteurs de la GnRH. Cependant, l'analyse quantitative de l'absorption cellulaire des analogues de la GnRH et les types cellulaires étudiés dans les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH sont actuellement limitées. Auparavant introduit, marqué par fluorescence sélective GnRH I, -II et -III dérivés fournir une grande détectabilité, et ils ont des propriétés chimiques appropriés pour des expériences reproductibles et robustes. Nous avons également constaté que les méthodes mises à jour appropriées avec ces analogues de la GnRH marqués pourraient offrir des informations inédites sur les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH. Ce manuscrit présente quelques expériences simples et rapides en ce qui concerne l'absorption cellulaire de [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II et [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH -III sur l'EBC-1 (poumon), le BxPC-3 (pancréas) et sur le Detroit 562- (pharynx) t malignesumor cellules. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, le niveau des récepteurs de la GnRH-I de surface cellulaire a également été examinée sur ces lignées cellulaires avant et après le traitement à la GnRH par microscopie confocale à balayage laser. L'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC a été quantifié par tri cellulaire activé par fluorescence. Dans ces expériences, des différences mineures entre les analogues de la GnRH et de grandes différences entre les types de cellules a été observée. Les différences significatives entre les lignées cellulaires sont mises en corrélation avec leur niveau distinct de récepteurs de surface cellulaire GnRH-I. Les expériences présentées contiennent des méthodes pratiques pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité de l'absorption de conjugués GnRH-FITC dans un temps et de manière dépendante de la concentration sur les différentes cultures de cellules adhérentes. Ces résultats pourraient prédire l'efficacité des médicaments ciblant des conjugués GnRH sur la culture cellulaire donné, et d'offrir une bonne base pour d'autres expériences dans l'examen des systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH.

Introduction

Systèmes de délivrance de médicaments peptidiques à base ciblées sont devenues un développement rapide et domaine prometteur dans le traitement du cancer au cours des dernières années ^{1, 2.} La gonadotrophine humaine de type récepteur d'hormone de libération de I (GnRH-IR) est principalement situé dans la glande pituitaire , mais est aussi présent dans plusieurs autres tissus qui sont responsables de l' autoreproduction ^3. GnRH-IR est également exprimée dans de nombreux tissus cancéreux, liés ou non au système reproducteur ^{4, 5.} L'expression élevée de GnRH-IR sur plusieurs cellules tumorales malignes par rapport aux tissus sains est l'occasion pour la thérapie ciblée ^{5, 6.}

Beaucoup gonadolibérine (GnRH) analogues ont été développés au cours des dernières décennies, qui pourraient être utilisés comme groupements de ciblagef "> ^{7, 8, 9.} Ces peptides sont capables de délivrer des agents anticancéreux avec une sélectivité élevée dans les cellules tumorales malignes qui surexpriment GnRH-IR ^6. Plusieurs médicaments anti-tumoraux conjugués GnRH avec une sélectivité plus élevée et une meilleure efficacité que le non conjugué correspondant sans drogue ont été signalés ^{7, 8, 9.}

Les publications précédentes au sujet de peptides GnRH et leurs récepteurs ont indiqué que le GnRH-IR peut prendre différentes conformations qui ont sélectivité différente pour GnRH analogues de ^10. La GnRH-IR très variable a des voies de signalisation complexes et diverses sont dotés d' une activité différente contre leurs ligands naturels et artificiels ^11. Ces faits font enquête sur les systèmes basés sur la GnRH difficile. D'autre part, la y possèdent un potentiel thérapeutique prometteur. Plusieurs expériences avec des peptides GnRH radiomarqués ont été signalés précédemment ^{12, 13, 14, 15,} mais des expériences dans lesquelles analogues de la GnRH marqués par fluorescence ont été utilisés sont encore limitées. Bien que le marquage radioactif offre une sensibilité élevée, un marquage fluorescent a plusieurs autres avantages, par exemple la manipulation plus facile, et la capacité de contre-colorer avec des fluorophores différents. Trois analogues de la GnRH communes qui ont été utilisées avec succès pour la délivrance de médicaments sont le [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II et GnRH-III, mais l'efficacité de ces peptides comme fragments de ciblage est rarement contre ^{16, 17.} D'autre part, les résultats d'expériences distinctes dans lesquelles des cellules cancéreuses différentes et des analogues de la GnRH ont été utilisés sont divers.

MÉNAGEMENT "> Sur la base de ces considérations, nous nous sommes concentrés sur le ciblage de la tumeur et le potentiel de distribution de médicaments de ces peptides de la GnRH et, par conséquent synthétisé et caractérisé par la [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] - GnRH-II et [Lys ⁸ (FITC)] - peptides conjugués GnRH-III ¹⁸ Ces analogues sont sélectivement marqués par la FITC sur la chaîne latérale de la Lys ou D-Lys (rapport peptide-FITC 1: 1 à chacun. conjugué). l'idée était que le marquage fluorescent sélectif peut offrir des informations inédites sur ces peptides, et permet leur bonne suivi et une quantification fiable. ces conjugués ont une manipulation sûre et détectabilité fiable, ce qui rend plus facile de comparer leur tumeur efficacité du ciblage, et projection de nombreux types de cellules tumorales malignes. Nous espérons que la mise à jour des expériences avec ces conjugués peptidiques pourrait contribuer au développement de nouveaux cancer ciblant conjugués GnRH-médicaments, et d'aider à identifier de nouvelles tar thérapeutiqueobtient ainsi.

Le présent manuscrit démontre quelques expériences bien reproductibles et rapides avec des conjugués GnRH-FITC. L'expression de surface cellulaire de la GnRH-R est une condition déterminante en ce qui concerne l'absorption de la GnRH, par conséquent, nous avons étudié simultanément le niveau de la GnRH-IR à la surface cellulaire sur les lignées cellulaires testées. Nous avons visualisé les conjugués GnRH-IR et GnRH-FITC par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et quantifié l'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC en utilisant les cellules activées par fluorescence (FACS).

Protocole

1. Préparation des cultures de cellules et réactifs

1. Maintenir les cultures de cellules dans le milieu recommandé par le fabricant, supplémenté avec 10% (v / v) de sérum et d'antibiotiques de veau fœtal (milieu appelé complet). Maintenir la fiole de culture de cellules dans un humidifiée à 5% de CO ₂ atmosphère incubateur à 37 ° C. Suivre la prolifération et la confluence des cellules au microscope inversé (en utilisant l'objectif 10X de contraste de phase).
2. Lorsque les cellules atteignent la confluence adéquate, éliminer le milieu, et laver la culture avec 2-3 ml, solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et on ajoute 0,5 ml de solution stérile à 0,25% de trypsine-EDTA à la culture cellulaire et on incube à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent (environ 10 minutes).
3. Suspendre les cellules dans 3-4 ml de milieu complet stérile pour arrêter la trypsine et de les transférer dans un tube à centrifuger stérile. Centrifuger les cellules à 150 g pendant 4 minutes à la température ambiante (TA). Jeter le surnageant avec soin et suspendre le pEllet dans 2-3 ml de milieu complet stérile.
4. Sortez 100 pi de la suspension cellulaire et mélanger avec 100 pi de 0,4% (m / V) trypan solution bleu, pour colorer les cellules mortes. Charge 10 ul de ce mélange dans un hémocytomètre et déterminer le nombre de cellules viables par microscope inversé.
5. Diluer la quantité requise de la suspension cellulaire préparée à l' étape 1.3 à 10 ml avec du milieu complet stérile contenant 4 x 10 ⁴ cellules / ml.
6. Ajouter 250 ul de suspension cellulaire (préparé à l' étape 1.5) par puits (10 ⁴ cellules / puits) dans sept puits du premier fond de verre 8 puits lame microscopique. Utilisez cette diapositive dans la méthode d'absorption GnRH.
7. Ajouter 250 ul de suspension cellulaire (préparé à l' étape 1.5) par puits (10 ⁴ cellules / puits) dans cinq puits de la deuxième diapositive 8 puits microscopique. Cette glissière sera utilisée dans le procédé d'expression de la GnRH-IR.
8. Ajouter 1 ml de suspension de cellules (préparé à l' étape 1.5) par puits (4 x 10 ⁴ cellules / puits) en sept wells d'une plaque de 12 puits. Cette plaque sera utilisée dans la méthode de quantification de la GnRH.
9. Que les cellules adhèrent sur les deux lames microscopiques et la plaque. Incuber dans un humidifiée à 5% de CO ₂ atmosphère incubateur à 37 ° C pendant 48 heures.
10. Après l'incubation de vérifier les cellules par microscope inversé (en utilisant 10X objectif à contraste de phase). Si les cellules sont en bonne santé et attaché, continuez avec les étapes suivantes.
11. Préparer mM GnRH-FITC solution stock 10 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) de chacun des trois conjugués ^18. (Utilisez ces concentrations de dilution: 16,43 pg / pl [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, 16,97 pg / pl [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II et 16,47 pg / pl [Lys ⁸ ( FITC)] - GnRH-III) Gardez ces solutions mères dans un endroit sombre à la température ambiante et de les utiliser au sein de quelques semaines.
12. Diluer 1,7 ul de chacun des trois 10 mM GnRH-FITC de solutions mères dans 1,7 ml de milieu complet. Agiter ces solutions. (These sont les 10 uM GnRH-FITC traitement de médias.) On dilue 150 ul de chacun des trois 10 uM GnRH-FITC milieu de traitement dans 1,35 mL de milieu complet. Agiter ces solutions ainsi (ce sont les 1 uM GnRH-FITC milieu de traitement).
    NOTE: Toutes les GnRH-FITC milieu contenant le traitement doit être protégé de la lumière et utilisée au sein de quelques heures.
13. Préchauffer le-FITC GnRH moyenne six traitement (préparé à l'étape 1.12) et 4 ml de milieu complet à 37 ° C.
14. Diluer 3 pl de solution de sonde fluorescente 5 mM (de contre-coloration nucléaire mentionné dans la liste des matières) dans 3 ml de PBS à 5 uM. Cette solution doit être protégé de la lumière, le garder à température ambiante et de l'utiliser au sein de quelques heures.

2. confocale à balayage laser (CLSM)

1. GnRH méthode absorption
   1. Prenez la première lame microscopique préparée à l'étape 1.6 et pipette le milieu complet de chacun des sept puits. Ajouter 250 ul de medi complète préchaufféum dans le premier puits. Utilisez cela comme un contrôle négatif. Ajouter 250 ul de la GnRH préchauffé FITC traitement de médias (de 1,13) à chacun des six puits suivants (3 puits avec 1 uM et 3 à 10 pm). Incuber la lame dans une humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 5 h.
   2. Pipeter le milieu de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 pi de solution de fixation (10% de formol tamponné neutre) dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante, pendant 10 minutes.
   3. Pipeter la solution de fixation de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 ul de PBS contenant 5 uM solution de sonde fluorescente préparée à l'étape 1.14 dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante, pendant 10 min.
   4. Pipeter la solution de sonde fluorescente de chaque puits, et laver les cellules deux fois avec 250 ul de PBS avec soin. Ajouter 3-4 gouttes de milieu de montage dans chaque puits, enfin. Gardez la lame dans l'obscurité à la température ambiante, jusqu'à ce que l'imagerie.
2. Procédé d'expression de la GnRH-IR
   1. Prendre la deuxième lame de microscope 8 puits préparé à l'étape 1.7 et pipette le milieu complet de chacun des cinq puits.
   2. Ajouter 250 ul de milieu complet préchauffé dans le premier puits, utilisez ce contrôle négatif. Ajouter 250 ul de milieu complet préchauffé dans le second puits aussi, et l'utiliser pour examiner l'expression de la GnRH-IR avant le traitement GnRH.
   3. Ajouter 250 ul de chacun des trois préchauffée 10 uM GnRH-FITC médias traitement dans les trois prochains puits. Utilisez ces puits pour prétraiter les cellules avec des conjugués GnRH-FITC avant d'examiner l'expression de la GnRH-IR. Incuber la lame dans une humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 1 h.
   4. Pipeter le milieu de traitement provenant de chacun des trois puits qui seront utilisés pour examiner l'expression de la GnRH-IR après le traitement de la GnRH et laver les puits avec 250 ul de milieu complet préchauffé. Ajouter 250ul de milieu complet préchauffé dans chacun des trois puits. Incuber la lame dans une humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 1 h.
   5. Pipeter le milieu à partir de chacun des cinq puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 pi de fixation solution dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante, pendant 10 min.
   6. Pipeter la solution de fixation de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 pi de PBS contenant de l'albumine de sérum bovin à 5% (BSA) dans une solution de blocage dans chaque puits et incuber la lame à la température ambiante pendant 1 h.
   7. Diluer 10 ul d'anticorps primaire GnRH-IR dans 1 ml de PBS (1: 100 Ratio). Gardez-le à température ambiante et de l'utiliser au sein de quelques heures.
   8. Pipeter la solution de blocage BSA de chaque puits, sauf le contrôle négatif (premier puits). Laver les cellules avec 250 ul de PBS (sauf le contrôle négatif bien). Ajouter 250 ul de PBS contenant l'anticorps primaire GnRH-IR préparé à l'étape 2.2.7 en each bien (sauf le contrôle négatif). Incuber la lame à la température ambiante, pendant 1 h, dans un endroit sombre.
   9. Diluer 2,5 ul d'Alexa 546 anticorps secondaire marqué dans 1,25 ml de PBS (1: 500 ratio).
      NOTE: Cette solution doit être protégé de la lumière, le garder à température ambiante et de l'utiliser au sein de quelques heures.
   10. Pipeter des solutions de chacun des cinq puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 ul de PBS contenant 546 AF anticorps secondaire marqué préparé à l'étape 2.2.9 dans chaque puits. Incuber la lame à la température ambiante, pendant 1 h dans l'obscurité.
   11. Pipeter la solution de chaque puits et laver les cellules avec 250 ul de PBS. Ajouter 250 ul de PBS contenant 5 uM solution de sonde fluorescente préparée à l'étape 1.14 dans chaque puits et incuber la lame pendant 10 min, à la température ambiante.
   12. Pipeter la solution de sonde fluorescente de chaque puits et laver les cellules deux fois avec 250 ul de PBS avec soin. Ajouter 3-4 gouttes de milieu de montage dans chaque puits, par la suite. Gardez la lame dans l'obscuritéà la température ambiante jusqu'à ce que l'imagerie microscopique.
3. Imaging
   1. Image cellules par confocal inversé à balayage laser (en utilisant 63X objectif à immersion d'huile)
      1. Utilisez les longueurs d'onde d'excitation / d'émission suivantes. conjugués de GnRH: 488/514 nm, Alexa 546 anticorps marqué: 488/546 nm (utiliser uniquement pour la méthode d'expression GnRH-IR), sonde fluorescente DRAQ5: 633/680 nm.
      2. Mettre en place les paramètres d'imagerie utilisant les cellules témoins négatives. Utilisez ces paramètres à des cellules d'image traitées (figure 3). Re-ajuster les paramètres d'imagerie sur chaque diapositive microscopique au début de l'analyse. Peaufinez et d'exportation des images avec le logiciel fourni par le fabricant si nécessaire.

3. Fluorescence-tri cellulaire activé (FACS)

1. Procédé de quantification de la GnRH
   1. Prenez la plaque préparée à l'étape 1.8 et pipette le milieu complet de each des sept puits. Ajouter 1 mL de milieu complet préchauffé dans le premier puits. Utilisez cela comme un contrôle négatif. Ajouter 1 ml de chacune des six préchauffée traitement de supports (3 puits avec 1 uM et 3 puits avec 10 uM) dans les six puits suivants. Incuber la plaque dans une humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur à atmosphère à 37 ° C pendant 5 h.
   2. Pipeter le milieu de chaque puits. Laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS avec soin. Ajouter 500 pi de solution de trypsine-EDTA dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent (environ 10 minutes).
   3. Ajouter 1 mL de milieu complet dans chaque puits pour arrêter la trypsine. Agiter la plaque. Suspendre les cellules doucement avec une pipette et transférer la suspension de chaque puits dans des tubes FACS. Centrifuger les tubes à 150 g pendant 4 min, à 4 ° C.
   4. Versez les surnageants soigneusement, avec un seul mouvement. Ajouter 500 pi de PBS glacé dans chaque tube FACS et doucement remettre en suspension les cellules. Gardez les tubes sur la glace jusqu'à la finde l'expérience.
2. Analyse et calcul
   1. Analyser les cellules par cytométrie de flux. Pour l'excitation, utiliser 488 nm de longueur d'onde laser à l'argon et pour la détection utiliser 530 nm de longueur d'onde. Configurer les paramètres du cytomètre en exécutant les cellules témoins négatives. Utilisez ces paramètres pour analyser les cellules traitées (figure 4A). Évaluer les données avec le logiciel du fabricant, de déterminer l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) des valeurs, et de calculer les valeurs relatives des IFM.

Résultats

Les images obtenues par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) offrent de l'information spectaculaire l'absorption de conjugués GnRH-FITC sur la culture cellulaire donnée dans un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, la présence de la GnRH-IR sur la surface cellulaire est également vérifiée par l'expérience CLSM. En outre, en utilisant une coloration de l'ADN sonde fluorescente rouge lointain, il est possible de contre-c...

Discussion

Les expériences décrites ici utiliser analogues de la GnRH marqués sélectivement pour le dépistage adhérent des cultures de cellules in vitro. La microscopie confocale et cytométrie de flux méthodes sont appropriées pour le suivi et la quantification de l'absorption cellulaire de ces conjugués de GnRH-FITC en un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Ces expériences ont les étapes essentielles suivantes: 1) maintenir une culture cellulaire stérile, en bonne santé; 2) des pepti...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
EBC-1	JCRB	JCRB0820	Carcinome épidermoïde du poumon humain
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Adénocarcinome pancréatique humain
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Carcinome du pharynx humain
RPMI-1640 Milieu avec L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Milieu de culture pour cellules BxPC-3
Minimum Essential d’Eagle Milieu	Lonza	BE12-611F	Milieu de culture pour cellules EBC-1, et complété par du pyruvate de sodium à 0,1 % pour les cellules Detroit-562
Sérum fœtal bovin	Euro Clone	ECS0180L	Complète le milieu de culture
MycoZap Plus-CL  ;	Lonza	VZA-2012	Complète le milieu de culture (antibiotiques)
Flacons de culture cellulaire	Standard Line VWR	10062-872	Fournir un environnement de croissance constant et stérile pour les cellules
Mélange trypsine-EDTA  ;	Lonza	BE17-161E	Retirer les cellules attachées
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvant
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvant
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061	Utilisé pour compter les cellules
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	fabriqué par nos soins	-	Pureté &ge ; 98 % (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	fabriqué par	nous-Pureté	&ge ; 98 % (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	fabriqué par	nous-Pureté	&ge ; 98 % (HPLC)
fond en verre Lame microscopique à 8 puits	Ibidi	80826	Utilisation dans l’expérience CLSM
Plaque de culture cellulaire Corning Costar, 12 puits	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Utilisation dans l’expérience FACS
Solution de fixation (formol tamponné neutre à 10 %)	Bio-Optica	01V60P	Cellule adhérente
Cellule sérique bovine Albumine	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Empêcher la liaison non spécifique des anticorps
Anticorps GnRHR	Réactif d’immunocytochimie Proteintech	19950-1-AP	se lie aux récepteurs de la GnRH de type I
humain Anticorps secondaire, conjugué Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A11035	Réactif d’immunocytochimie, se lie à l’anticorps primaire
Solution de sonde fluorescente (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Noyaux de contre-coloration
Fluoromount Medium d’enrobage aqueux	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Utilisation dans l’expérience CLSM, préservation de la fluorescence
Microscope inversé	Elektro-Optika Ltd.  ;	Alpha XDS-2T	Vérifier le phénotype et la confluence des cultures cellulaires
Microscope confocal à balayage laser inversé	Zeiss	LSM-710	Utilisation dans l’expérience CLSM
Cytomètre en flux	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Utilisation dans l’expérience FACS