Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

Résumé

Cellulaire sénescence, l'état irréversible de l'arrêt du cycle cellulaire, peut être induite par diverses contraintes cellulaires. Ici, nous décrivons les protocoles pour induire la sénescence cellulaire et des méthodes pour évaluer les marqueurs de sénescence.

Résumé

En réponse au stress cellulaire ou les dommages, les cellules qui prolifèrent peuvent induire un programme spécifique qui déclenche un état d'arrêt du cycle cellulaire à long terme, appelé sénescence cellulaire. L' accumulation de cellules sénescentes se produit avec le vieillissement organismal et par mise en culture continue in vitro. Les cellules sénescentes influencent de nombreux processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, la réparation et la régénération des tissus, la suppression des tumeurs et le vieillissement. Poinçons de cellules sénescentes comprennent, mais sans s'y limiter, l'augmentation de l'activité β-galactosidase associée sénescence (SA-β-gal); p16 ^INK4a, p53 et p21 niveaux; des niveaux plus élevés de dommages à l'ADN, y compris les γ-H2AX; la formation d'hétérochromatine associée à la sénescence Foci (SAHF); et l'acquisition d'une sécrétoire associée sénescence Phénotype (SASP), un phénomène caractérisé par la sécrétion d'un certain nombre de cytokines pro-inflammatoires et des molécules de signalisation. Ici, nous décrivons les protocoles pour les réplicative etADN sénescence dommages induits dans les cellules en culture. De plus, nous mettons en évidence des techniques pour surveiller le phénotype sénescent en utilisant plusieurs marqueurs associés à la sénescence, y compris SA-β-gal, γ-H2AX et la coloration SAHF, et de quantifier les niveaux de protéines et d'ARNm des régulateurs du cycle cellulaire et les facteurs SASP. Ces méthodes peuvent être appliquées à l'évaluation de la sénescence dans divers modèles et tissus.

Introduction

Il y a plus d' un demi - siècle, Hayflick et ses collègues ont décrit comment les cellules prolifèrent dans la culture non transformée, mais seulement pour une période de temps limitée ^1. la culture à long terme des fibroblastes humains a provoqué les cellules pour arrêter la prolifération; cependant, ils étaient métaboliquement actifs, ce qui a été appelé sénescence cellulaire. Sénescence peut être bénéfique pour inhiber la tumorigenèse, mais il peut aussi être préjudiciable, car on pense contribuer à la perte de la capacité de régénération qui se produit avec le vieillissement ^{2, 3.}

Protocole

1. Induire réplicative sénescence

1. Décongeler les fibroblastes diploïdes humains à faible passage (par exemple, WI-38 et IMR-90) ou d' autres lignées cellulaires.
   REMARQUE: Ici, les fibroblastes diploïdes humains ont été utilisés, mais ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la sénescence dans d'autres types de cellules, comme endothéliales, épithéliales ou cellules souches mésenchymateuses. conditions de culture peuvent être optimisées pour les différents types de cellules utilisées en raison de différents taux de croissance ou des conditions de croissance.
   REMARQUE: Les cellules doivent être proliférer et ont une m....

Résultats

Les figures 2 - 6 montrent des résultats représentatifs de coloration SA-β-gal; coloration pour la γ-H2AX et SAHF; l' évaluation des niveaux de protéines de p16 ^INK4a p21 et p53; et de l'ARNm et des protéines de molécules sénescentes associée. Une coloration accrue SA-β-gal se produit avec réplicatif et de l'ADN de la sénescence induite par endommagement. En outre, observer les changements morphologiques qui se produisent à la sénescence. Les cellu.......

Discussion

Ici, nous avons décrit des méthodes pour réplicative induite et l'ADN des dommages sénescence en utilisant des fibroblastes diploïdes humains. En outre, les techniques de quantification de la protéine et les taux d'ARNm de différentes protéines associées à la sénescence sont incluses, ainsi que pour la coloration SA-β-gal et pour le marqueur d'ADN dommages γ-H2AX. Ces protocoles peuvent être largement utilisés pour évaluer phénotypes sénescentes in vitro et in vivo, bien que de nombreuses m.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % Tris-glycine gels	Invitrogen	XP00160BOX
Acide-Phénol ChCl3	Ambion	AM9720
Alexa-Fluor 568 chèvre anti-souris	Anticorps Invitrogen	A11031	dilution 1:300
Élévateurs de cellules	Corning Inc.	3008	Racleur
cellulaire ECL anti-souris HRP anticorps	lié Amersham	NA931V
ECL Plus Western Blot Substrate	Pierce	32132	ECL
DAPI	Sondes moléculaires	MP01306	stock 5 mg/mL en dH2O
GAPDH Anticorps	Santa Cruz	sc-32233	1:1 000 - 5 000
dilution GlycoBlue	Ambion	AM9515
Histone H3 diméthyl K9 anticorps monoclonal	Abcam	1220	dilution 1:500
Essai ELISA de l’IL-6 Quantikine humaine	R& D systems	D6050
Essai ELISA de l’IL-8 Quantikine humaine	R& D systems	D8000C
Human GROa Quantikine ELISA test	R& D systems	DRG00
N-N-diméthylformamide  ;	Sigma	D4551	DMF
p16 anticorps monoclonal	BD Biosciences	51-1325gr	dilution 1:500
p21 anticorps monoclonal	Millipore	05-345	dilution 1:750
p53 anticorps monoclonal	Santa Cruz	sc-126	clone de dilution 1:500 DO-1
phospho-H2AX (Ser139) Anticorps conjugué FITC	Signalisation cellulaire	9719	1:2 000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix  ;	Applied Biosystems	4367659
Marqueurs de poids moléculaire pré-colorés	Biorad	161-0374
ProLong Gold Antifade  ;	Membrane PVDF Invitrogen	P36930
;	Thermo Scientific	88518
Kit de coloration de la sénescence &bêta ;-galactosidase	Signalisation cellulaire	9860
TRIzol	Ambion/Life Tech	10296028