Nous décrivons une méthode pour l'analyse qualitative et quantitative de la formation de granules de stress dans des cellules de mammifères après que les cellules sont confrontées à des bactéries et à un certain nombre de contraintes différentes. Ce protocole peut être appliqué pour étudier la réponse des granules de stress cellulaire dans une large gamme d'interactions hôtes-bactéries.
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Article de méthode
Analyse d'immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'imagerie fluorescente des composants cellulaires est un outil efficace pour étudier les interactions hôte-pathogène. Les agents pathogènes peuvent affecter de nombreuses caractéristiques différentes des cellules infectées, y compris l'ultrastructure des organelles, l'organisation du réseau cytosquelettique, ainsi que les processus cellulaires tels que la formation du granulé du stress (SG). La caractérisation de la façon dont les agents pathogènes subversent les processus hôtes est une partie importante et intégrante du domaine de la pathogenèse. Bien que les phénotypes variables puissent être facilement visibles, l'analyse précise des différences qualitatives et quantitatives dans les structures cellulaires induites par le défi des agents pathogènes est essentielle pour définir des différences statistiquement significatives entre les échantillons expérimental et les témoins. La formation du SG est une réponse au stress évolutive qui conduit à des réponses antivirales et a longtemps été étudiée en utilisant des infections virales 1 . La formation SG affecte également les cascades de signalisation et peut avoir d'autres conséquences encore inconnues2 . La caractérisation de cette réponse au stress par des agents pathogènes autres que les virus, tels que les agents pathogènes bactériens, est actuellement un domaine émergent de recherche 3 . Pour l'instant, l'analyse quantitative et qualitative de la formation SG n'est pas encore utilisée de manière routinière, même dans les systèmes virales. Nous décrivons ici une méthode simple pour induire et caractériser la formation de SG dans les cellules non infectées et dans les cellules infectées par un agent pathogène bactérien cytosolique, ce qui affecte la formation de SG en réponse à divers contraintes exogènes. L'analyse de la formation et de la composition du SG est obtenue en utilisant un certain nombre de marqueurs SG différents et le plug-in détecteur spot de ICY, un outil d'analyse d'image open source.
Introduction
La visualisation des interactions hôte-pathogène au niveau cellulaire est une méthode puissante pour obtenir des idées sur les stratégies pathogènes et pour identifier les voies cellulaires clés. En effet, les agents pathogènes peuvent être utilisés comme outils pour identifier des cibles ou des structures cellulaires importantes, car les agents pathogènes ont évolué pour subvertir les processus cellulaires centraux en tant que stratégie pour leur propre survie ou propagation. La visualisation des composants cellulaires peut être obtenue par l'expression recombinante de protéines hôtes marquées par fluorescence. Bien que cela permette une analyse en temps réel, l....
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Protocole
1. Préparation des bactéries et des cellules hôtes
- Remettre le couvercle de verre de 12 ou 14 mm dans des plaques de 24 ou 12 puits, respectivement, avec une pince stérile, en comptant un puits par état expérimental. Stérilisez-les par traitement UV dans un capuchon de culture tissulaire pendant 15 min.
REMARQUE: Inclure les puits de contrôle pour la provocation bactérienne et pour l'induction SG par des contraintes exogènes. - Pour une plaque de 24 puits avec des lamelles de 12 mm, semer 1 x 10 5 cellules de mammifères ( par exemple, cellules HeLa) sur des lamelles; Appuyez sur les lamelles vers le bas avec une point....
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Résultats
Pour expliquer et démontrer le protocole décrit dans ce manuscrit, nous avons caractérisé l'image des SGs induites par le clotrimazole dans les cellules HeLa infectées ou non avec le pathogène cytosolique S. flexneri . Un schéma de la procédure est présenté dans la figure 1 , et comprend S. flexneri virulent et avirulent rayé sur les plaques rouges du Congo, la préparation des bactéries, l'infection, l'ajout de stress environnem.......
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Discussion
Le protocole décrit ici décrit l'induction, la localisation et l'analyse des SG dans les cellules non infectées et les cellules infectées par le pathogène cytosolique S. flexneri en présence ou en l'absence de stress exogène. En utilisant un logiciel d'imagerie gratuit, les protocoles permettent une analyse qualitative et quantitative précise de la formation SG pour identifier et analyser statistiquement les différences dans les phénotypes donnés.
Il existe plusieurs.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
PS est récipiendaire de la subvention Grand Challenge de Bill et Melinda Gates OPP1141322. PV a été soutenu par une bourse de mobilité postdocale de la Fondation nationale de la science nationale suisse et une bourse postdoctorale Roux-Cantarini. PJS est soutenu par une subvention HHMI et ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anticorps primaires /forts | |||
| eIF3b (N20), origine chèvre | Santa Cruz | sc-16377 | Marqueur SG robuste et largement utilisé. La coloration cytosolique permet la délimitation cellulaire. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origine chèvre | Santa Cruz | sc-16378 | Même cible que eIF3b (N20) et dans nos mains était identique à eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origine lapin (MC : monoclonal) | Signalisation cellulaire | 3411 | Partie du complexe multiprotéique eIF3 avec eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origine chèvre | Santa Cruz | sc-14211 | Recommandé par (Réf # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origine lapin | Abcam | ab186856 | Bon marqueur de granule de stress entre nos mains. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origine lapin | Signalisation cellulaire | 3592 | Recommandée par Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origine lapin | Santa Cruz | sc-11373 | Marqueur SG largement utilisé. (Réf # 13) : peut ne pas bien fonctionner dans les lignées cellulaires de souris. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origine lapin (MC : monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Marqueur SG largement utilisé. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origine chèvre | Santa Cruz | sc-1751 | Marqueur SG largement utilisé. Peut également être trouvé dans les corps P lorsque des SG sont présents (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugual Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-chèvre, origine âne | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbé. Dilution 1:500 |
| A568 anti-chèvre, origine âne | Thermo Fisher | A-11057 | Croix absorbée. Dilution 1:500 |
| A488 anti-souris, origine âne | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-souris, origine âne | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-souris, origine âne | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-lapin, origine âne | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-lapin, origine âne | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Autres réactifs | |||
| Shigella flexneri | Disponible auprès de différents laboratoires sur demande | ||
| Tryptone Caséine Bouillon de soja (TCS) | BD Biosciences | 211825 | Milieu de croissance standard pour Shigella, application - croissance bactérienne |
| Gélose TCS | BD Biosciences | 236950 | Gélose de croissance standard pour Shigella, application - croissance bactérienne |
| Rouge Congo | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Outil de distrimination pour Shigell qui ont perdu le plasmide de virulence, application - croissance bactérienne |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Utile pour enrober les bactéries afin d’augmenter l’infection, application - infection |
| Gentamicine | Sigma-Aldrich | G1397 | Destruction sélective des bactéries extracellulaires mais non cytosoliques, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | Tampon de PH utile lorsque les cellules sont incubées à RT, application - culture cellulaire |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Milieu de culture standard pour cellules HeLa, application - culture cellulaire |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Biowest | S1810-100 | Supplémentation à 5 % utilisée pour le milieu de culture cellulaire HeLa, application - culture cellulaire |
| Acides aminés non essentiels (NEAA) | Life Technologies | 11140 | Dilution 1:100 utilisée pour le milieu de culture cellulaire HeLa, application - culture cellulaire |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Diluant réactif, application - culture cellulaire |
| Arsénite | de sodiumSigma-Aldrich | S7400 | Inducteur de stress granulaire puissant (Remarque : hautement toxique, manipulation et élimination spéciales requises), application - inducteur de stress |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Inducteur de granules de stress puissant (Remarque : danger pour la santé, manipulation et élimination spéciales requises), application - inducteur |
| de stress Paraformaldéhyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4 % de PFA est utilisé pour la fixation standard des cellules, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Utilisé à 0,03 % pour la perméabilisation des cellules hôtes avant coloration immunofluorescente, application - perméabilisation |
| A647-phalloidin Thermo | Fisher | A22287 | La dilution est à 1:40, mieux ajouté lors de la coloration secondaire des anticorps, application - coloration |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Coloration à l’acide nucléide utilisée pour visualiser à la fois le noyau de l’hôte et les bactéries, application - coloration Parafilm |
| Sigma-Aldrich | BR701501 | film de paraffine utile pour la coloration immunofluorescente des lamelles, application - coloration Prolong | |
| Gold | Thermo Fisher | 36930 | Milieu de montage robuste qui fonctionne bien pour la plupart des fluorophores , application - montage |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Support de montage bon marché et robuste qui fonctionne bien pour la plupart des fluorophores, application - montage |
| de plaque de culture cellulaire 24 puits | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Plaques de culture tissulaire standard, application - culture cellulaire |
| 12 mm lamelles en verre | NeuVitro | 1001/12 | Support de culture cellulaire pour applications immunofluorescentes, application - pince de support cellulaire |
| Sigma-Aldrich | 81381 | Support de montage bon marché et robuste qui fonctionne bien pour la plupart des fluorophores, application - montage | |
| Programmes et équipements | |||
| Prism | GraphPad Logiciel | d’analyse de données et de graphiques avec des options de test statistique robustes, application - analyse de données | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Microsope confocale, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Programme professionnel d’analyse d’images, application - analyse de données | |
| Excel | Microsoft | Programme d’analyse de données et de graphiques, application - analyse de données |
Références
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38
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Réimpressions et autorisations
