Utilisation d'une ligne centrale pour les fluides veineuses, les drogues et l'administration des nutriments dans un modèle de souris de maladies graves

Résumé

Ce protocole décrit un modèle murin à cathétérisme central de maladie critique prolongée. Nous combinons la méthode de ligature cæcale et de ponction pour induire la septicémie avec l’utilisation d’une ligne veineuse centrale pour l’administration de liquides, de médicaments et de nutriments afin d’imiter le cadre clinique humain.

Résumé

Ce protocole décrit un modèle de souris cathétérisés au centre d'une maladie grave prolongée. Nous combinons la ligature du caecum et la méthode de ponction pour induire une septicémie avec l'utilisation d'une ligne veineuse centrale pour les fluides, les médicaments et l'administration des nutriments pour imiter le milieu clinique humain. Les patients gravement malades ont besoin de soutien médical intensif pour survivre. Alors que la majorité des patients guérissent en quelques jours, environ un quart des patients ont besoin de soins intensifs prolongée et sont à risque élevé de mourir d'une non-résolution de défaillance de plusieurs organes. En outre, la phase prolongée de maladie grave est poinçonnée par une profonde faiblesse musculaire, et des changements endocriniens et métaboliques, dont la pathogénie est actuellement incomplètement comprise. Le modèle animal le plus largement utilisé dans la recherche de soins intensifs est le modèle de ligature et ponction du caecum pour induire une septicémie. Ceci est un modèle très reproductible, avec des changements inflammatoires et hémodynamiques aiguës similaires à septembre humainsis, qui est conçu pour étudier la phase aiguë de la maladie grave. Cependant, ce modèle est poinçonnée par une haute létalité, qui est différente de la situation clinique humaine, et n'est pas mis au point pour étudier la phase prolongée de maladie grave. Par conséquent, nous avons adapté la technique en plaçant un cathéter veineux central dans la veine jugulaire qui nous permet d'administrer des soins de soutien pertinents sur le plan clinique, pour imiter mieux la situation clinique humaine de maladie grave. Ce modèle de la souris nécessite une vaste intervention chirurgicale et de soins intensifs quotidienne des animaux, mais il en résulte un modèle pertinent de la phase aiguë et prolongée d'une maladie grave.

Introduction

maladie grave est un état pathologique dans lequel la fonction d'un ou plusieurs systèmes d'organes est entravée dans la mesure où le patient va mourir, à moins que le soutien médical intensif est administré. Alors que la cause initiale d'admission à l'unité de soins intensifs (USI) peut varier, allant d'un traumatisme, une intervention chirurgicale compliquée, brûlures, exacerbations de la maladie à la septicémie, tous les patients gravement malades souffrent de dommages cellulaires causés par hypoperfusion, l'hypoxie et l'inflammation excessive entre autres , ce qui conduit à l'échec d'organes. La plupart des patients survivent à leur insulte aiguë, mais une fraction importante des patients ne sont pas immédiatement récupérer et ont besoin de soins intensifs prolongée. Ils sont à risque élevé de décès dus à la non-résolution de défaillance de plusieurs organes. En outre, la phase prolongée de maladie grave est poinçonnée par une profonde faiblesse musculaire et endocrinien et le changement métabolique, dont la pathogénie est actuellement incomplètement comprise.

plusieurs rmodèles Odent sont utilisés dans le cadre de la recherche de soins intensifs. Les deux modèles les plus utilisés sont l'administration exogène de lipopolysaccharide (LPS) et la ligature et ponction du caecum (CLP). Les deux modèles sont développés pour imiter la phase aiguë de la septicémie, définie comme un dysfonctionnement des organes mortelle causée par une réponse hôte dysregulated à l' infection, et l' une des principales raisons pour l' admission à l'unité de soins intensifs dans le monde entier ^{1, 2.} Le modèle LPS présente plusieurs inconvénients car il ne touche transitoirement la libération de cytokines et l'état hémodynamique de l'animal ^3. Contrairement aux humains, les rongeurs sont particulièrement résistants à l' endotoxine et l'utilisation des « fortes doses » de endotoxine est nécessaire pour produire une hypotension et de mortalité, par les présentes préoccupations de la collecte validité de cette méthode ^{4, 5.} L'autre modèle, la ligature caecale et ponction modèle (CLP)dispose d'une ligature d'une partie du caecum suivie d'une ponction à l'aiguille traversant et traversant. Cette procédure provoque une infection abdominale polymicrobienne des lésions tissulaires, suivie d'une translocation des bactéries dans le compartiment sanguin. Cela déclenchera une réponse inflammatoire systémique et le développement de la septicémie. Le modèle CLP a été largement reconnu comme un modèle animal de maladie aiguë grave qui reproduit les caractéristiques principales de la septicémie: hyperinflammation, la vasodilatation, l' hypotension et augmentation du débit cardiaque ^{6, 7.} Toutefois, ce modèle ne permet pas l'étude de la non-résolution de défaillance multiviscérale, atrophie musculaire, et des changements endocriniens et métaboliques, qui sont typiques pour la phase prolongée de maladie grave. En outre, récemment la validité des modèles de souris pour les maladies graves ont été remis en cause, puisque les résultats des modèles de souris ne peuvent pas toujours être traduits au milieu humain ^{8, 9, 10.} Une explication possible pourrait être que les soins de soutien fourni aux malades en phase critique des patients humains diffère sensiblement de la prise en charge qui est fournie à des souris gravement malades.

Par conséquent, pour ressembler milieux humains plus étroitement et de permettre une enquête de la phase prolongée de maladie grave, nous avons développé un modèle de souris qui imite les soins intensifs aiguë donnée à l'homme, comme une vaste administration de liquide par voie intraveineuse et un traitement antibiotique, et qui permet pour administrer des soins de soutien afin de survivre à la phase prolongée de maladies graves, telles que le soutien nutritionnel. A cet effet, nous avons adapté le modèle de souris de la septicémie CLP-induite, étant la norme d'or pour la septicémie, et placé une ligne veineuse centrale qui permet l'administration des fluides, la nutrition et les médicaments.

Protocole

Le protocole a été approuvé par l'Université de Louvain Conseil d'éthique Revue de recherche animale.

1. Préparation de la ligne veineuses

1. Préparer la pointe du cathéter veineux en immergeant rapidement la tubulure partie centrale de 60 cm de microrenathane (MRE) à chaud (> 220 ° C) l'huile de sésame. étirer la suite, la partie médiane du tube pour produire un faible diamètre (diamètre extérieur (OD) <0,5 mm) en déplaçant doucement les extrémités du tube à une distance les uns des autres.
2. Utiliser une lame de scalpel pour couper le tube en deux parties de 30 cm chacune (voir la figure 1, tableau 1).
3. Raccorder le tuyau MRE à une tubulure PE10 polyethylene en utilisant le connecteur de polyéthylène PE50 et raccorder ce tube de PE10 à la partie inférieure de la rotule. Relier la partie supérieure de la tête d' injection à un tube PE10, et le connecter à une aiguille à embout Luer avec un tube de connecteur PE50 selon la figure 1.
4. Appliquer une forte rapide Acting colle adhésive à toutes les connexions et tester le cathéter d'étanchéité par rinçage à l'air. Gaz stériliser le cathéter avant l'utilisation.

Figure 1: Construction de la ligne veineuses. Lignes veineuses sont préparées en étirant le tube MRE à un petit diamètre et de la connexion par l' intermédiaire d'un tube de polyethylene à un dispositif de pivotement de rongeur. Voir le tableau 1 pour obtenir des instructions sur la longueur des différentes parties. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Légende	Longueur	Le volume
1) talon de l'aiguille Luer 22g
2) PE50 - polyethylene 0,023" x 0,038"	5 cm	13 pi
3) PE10 - polyethylene 0,011" x 0,024”	50 cm	30 pi
4) Rongeur pivotant 20 G
5) PE-10	15 cm	9 pi
6) PE-50 (connecteur)	5 cm	13 pi
7) MRE025 Tip tendue microrenathane .025" x 0,012"	30 cm	27 pi
Somme totale	105 cm	92 ul

Tableau 1: Construction de la ligne veineuses. Ce tableau fournit une légende de la figure 1.

2. L'anesthésie et la manipulation pré-opératoire

1. Utilisation homme de souris C57BL / 6J de 24 semaines (27-32 g).
   NOTE: Nous utilisons des souris âgées de 24 semaines (adultes matures) que cet âge correspond mieux à l'âge moyen des patients de soins intensifs. Nous utilisons seulement des souris mâles pour éviter l'influence cyclique des oestrogènes. La technique peut également être utilisé sur les animaux plus jeunes (testé chez des souris de 16 semaines) et les femmes, si l'on préfère.
2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant utilisation. Rincer le cathéter veineux fait maison avec une solution saline stérile pour éliminer les bulles d'air et pour tester la perméabilité et les fuites éventuelles.
3. Couper un fil métallique (diamètre 0,8 mm) de longueur 80 cm, doubler en pliant et en faire une boucle. Plomb 3 perles sur le fil doublé à la boucle. Fixer le cathéter sur le fil métallique de guidage de la pointe du cathéter à travers les 3 perles.
   NOTE: Le fil de fixation métallique est nécessaire pour une rotation de la rotule à laquelle le cathéter est connecté. A ce titre, la souris peut se déplacer librement, sans bloquer la ligne veineuse.
4. Anesthésier la mouse par une injection intraperitoneale (IP) d'un mélange de 0,03 ml de kétamine (100 mg / kg) et 0,02 ml de xylazine (13 mg / kg). Assurez-vous que l'anesthésie est adéquate en vérifiant l'absence de réflexes. Tirez doucement sur la langue de la souris à l'extérieur avec une pince pour éviter la suffocation en avalant de la langue.
   NOTE: Si au bout de 10 minutes, la souris tente toujours de retirer ses membres donnent kétamine supplémentaires en bolus 0,01 ml.
5. Raser la zone chirurgicale, y compris l'abdomen, la face ventrale du cou (triangle entre le menton, le sternum et la clavicule), et entre les omoplates à la base de la tête).
6. Placez la souris en position couchée sur un coussin chauffant préchauffée, désinfecter la peau avec 70% d'éthanol et d'appliquer une petite quantité de lubrifiant ophtalmique pour protéger les yeux contre le dessèchement. Infiltrer les sites chirurgicaux (abdomen, du cou-avant et arrière) avec 0,2 mL de ropivacaïne (0,67 mg / kg).
7. Alors que la souris est toujours en position couchée, faire une petite incision à la base de la face dorsalede la tête avec un scalpel ou de ciseaux. Exposer les muscles cervicaux postérieurs, et attacher le muscle à la boucle du fil de fixation avec 3,0 nylon par la tête d'un fil de nylon 3,0 sous le muscle.
8. Placez la souris sur son côté droit. Faire une petite incision verticale dans la peau du cou ventrale avec un scalpel ou des ciseaux. Sous guidage visuel, un tunnel sous-cutané de l'aiguille de calibre 18 à travers cette incision ventrale vers l'incision sur le dos fait précédemment et enfiler le cathéter à travers l'aiguille à extérioriser sur le côté ventral.
9. Placez la souris sur le dos. Passer un fil de nylon 3,0 derrière les incisives supérieures de la souris et du ruban adhésif vers le bas pour le coussin chauffant. Fixer la tête dans un masque facial pour fournir de l'oxygène (2 L / min). Fixer la souris dans une position étirée en collant sur la queue et les deux membres antérieurs.
   NOTE: Si la kétamine xylazine l'anesthésie ne suffit pas, isoflurane inhalées (0.5 - 1.5%) peut être livré au cours de la chirurgie.

3. Le placement d'un Indwelling chronique Catheter

1. Placez la souris sous le microscope de dissection. Dans l'incision faite précédemment dans le cou ventral, doucement titiller le tissu adipeux et glandes loin avec des pinces jusqu'à ce que la veine jugulaire peut être visualisée.
2. disséquer Bluntly pour libérer la veine jugulaire du tissu conjonctif sous-cutané et au-dessus et autour du récipient en plaçant la pointe de la pince entre la veine et le tissu conjonctif et l'ouverture de la pince de façon répétée parallèlement à la veine. A ce titre, les dommages à la veine sera évitée.
3. Isoler la veine jugulaire en plaçant le forceps émoussé sous la veine. Parasites trois morceaux de 3,0 fil de soie sous la veine, la position d'un seul tenant à proximité de la bifurcation de la veine jugulaire (ligature crânienne) et une pièce à proximité du muscle sterno (caudal de ligature). Serrer la ligature crânienne et caudale de la ligature pour étirer la veine et empêcher un saignement excessif tout en plaçant le cathéter. Tsoit une ligature lâche avec le filetage du milieu pour assurer la fixation facile du cathéter plus tard.
4. En utilisant des micro ciseaux, faire une incision le long de la veine entre les ligatures crânienne et caudale et assez grand pour passer le cathéter. Prenez le cathéter avec une pince, et insérer le cathéter 11 mm dans la veine. Le fixer le cathéter en ligaturant milieu Ligature et confirmer le placement correct en rinçant doucement avec une solution saline stérile.
5. Fixer le cathéter en attachant fermement au large de la ligature du milieu et caudale autour du récipient et le cathéter. Tie extrémités de ligature caudal et milieu ensemble pour fixer solidement le cathéter. Assurez-vous que les nœuds ne bouchent pas la veine, en rinçant le cathéter après chaque noeud fait. Enfin, attacher le caudale et ligatures crâniens. Fermer l'incision avec 5,0 points de suture en soie.

4. caecum ligation et Crevaison

1. Faire une incision médiane de 1 cm à travers la peau de la moitié inférieure de l'abdomen avec un scalpel ou de ciseaux;veiller à ne pas pénétrer dans la cavité peritoneale.
2. Identifier la linea alba de la musculature abdominale et faire une incision intermusculaire pour entrer dans la cavité péritonéale. Localisez le caecum, et utiliser une pince anatomique émoussé pour isoler le caecum et extérioriser.
3. Ligaturer le caecum à 50% de sa longueur avec 3,0 points de suture en soie. Assurez-vous de ne pas ligaturer la vanne Bauhin de telle sorte que la continuité intestinale est maintenue.
4. Perforer le caecum avec une aiguille de calibre 18 par une seule traversant et par ponction à mi-chemin entre la ligature et la pointe du caecum. Après avoir retiré l'aiguille, extruder une petite quantité de matières fécales à partir du trou pour assurer la perméabilité.
5. Repositionner l'intestin dans la cavité abdominale, et fermer le péritoine et la peau avec 5,0 points de suture en soie.
   NOTE: En moyenne, un nouveau stagiaire nécessite 10 à 15 animaux pour pouvoir placer facilement le cathéter veineux et effectuer CLP dans les 45 min. Après la période de formation, une anesthésie / chirurgie related mortalité de 10% peut être attendue.

5. Le traitement post-chirurgical et Réanimation fluide

1. Placez la souris en position couchée et fixer le cathéter sur le fil de fixation avec du ruban adhésif. Déplacez la souris vers une cage individuelle. Utiliser un support à serrage réglable pour maintenir le dispositif de pivotement 25 cm au-dessus de la souris et la bande fermement la partie libre du fil de fixation métallique sur le point de rotation de la pièce pivotante.
2. Attacher une seringue contenant le mélange de colloïdes équilibrés et cristalloïdes (1: 4) à la ligne veineuse pour commencer la réanimation fluide.
3. Placez la cage dans une température contrôlée (27 ° C) armoire animale avec 12 h de lumière et de cycles sombres et commencer la réanimation de fluide par voie intraveineuse (10 ml / kg / h) par l'intermédiaire d'une pompe de perfusion précise à seringue. Fournir l'enrichissement de la cage, comme matériau de nidification et d'un bloc de bois.

6. Soins intensifs

1. A 6 h post-opératoire, la douleur injecter en sous-cutané medication et des antibiotiques (0,3 ml de buprénorphine (0,15 mg / kg) et 0,2 mL imipénème (16.67mg / kg)). NOTE: Conformément à la pratique standard médecine des animaux de laboratoire, la première dose de médicaments contre la douleur est donnée avant l'incision chirurgicale initiale et selon les directives des politiques vétérinaires de l'institution. injections sous-cutanées doivent être soigneusement injectées dans l'espace sous-cutané.
2. Après 20 - 24 h de réanimation liquidienne, remplacer les cristalloïdes / colloïdes par nutrition parentérale totale (6,67 ml / kg / h).
   REMARQUE: la nutrition parentérale totale administrée (5,8 kcal / 24 h) couvre environ 40% des besoins caloriques quotidiens de souris, similaires au début de l'apport calorique des patients dans l'unité de soins intensifs.
3. Sous-cutanée administrer des médicaments de la douleur et des antibiotiques (0,6 ml de buprénorphine (0,3 mg / kg) et 0,2 mL imipénème (16,67 mg / kg) toutes les 12 h pendant toute la période de maladie grave.
4. Vérifiez les animaux au moins tous les 3 h pendant la journée. Évaluer la souffrance en donnant une douleurscore basé sur l'échelle de la souris moue validée ^11. Pour les animaux Intensifier le suivi avec un score de douleur.

7. Fin de l'expérience

NOTE: Approbation et recommandations sur le niveau de gravité du modèle et des lignes directrices et des politiques pour les paramètres humains devraient être demandées à la Commission d'examen éthique des institutions locales de recherche animale.

NOTE: Dans le cas d'une voie veineuse non fonctionnel tel que le cathéter bloqué, du cathéter délocalisation, des problèmes avec la pompe de la seringue, l'animal est exclu de l'étude et euthanasiés.

1. A la fin de la période expérimentale, anesthésier profondément la souris en utilisant un mélange de 0,03 ml de kétamine (100 mg / kg) et 0,02 ml (13 mg / kg) xylazine. Euthanasier la souris par prélèvement de sang par ponction cardiaque. Magasin échantillons instantanés de tissus congelés d'intérêt à -80 ° C.

Résultats

Souris C57BL / 6 ont été faites dans un état critique, comme décrit ci-dessus. Nous avons effectué deux expériences pour évaluer la survie post-CLP jusqu'à deux moments: la survie jusqu'au jour 5 (n = 15) et la survie jusqu'au jour 7 (n = 22) post-CLP. Les courbes de survie des deux expériences ne sont pas significativement différentes (par rapport jusqu'au jour 5), ce qui indique la reproductibilité de l'installation expérimentale. Les animaux non survivants ont été ...

Discussion

Nous avons développé un modèle de souris plus cliniquement pertinente de maladie grave, en combinant la méthode de ligature et ponction du caecum pour induire une septicémie avec l'utilisation d'une ligne veineuse centrale pour les fluides, les médicaments et l'administration des nutriments. Ce dispositif expérimental est reproductible, permet d'étudier la phase prolongée de maladie grave et entraîne un taux de mortalité stable, mimant par la présente la situation clinique humaine ^1.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Buprénorphine	Ecuphar		Vetergesic 0,3 mg/mL
C57BL/6  ;	Janvier labs	C57BL/6JRj
colloïdes	Fresenius Kabi		Volulyte 6 %
crystalloids	Baxter		Plasmalyte a viaflo
Ethilon 3.0	Ethicon	F3211
Imipenem	MSD		Tienam 500  ; mg poudre pour liquide d’injection
Isoflurane	Eurovet		Iso-vet
Kétamine	Eurovet		Nimatek 100 mg/mL
LocTite Super glue3 tous plastiques  ;	Rectavit	119818
Mersilk 3.0	Ethicon	L192
Mersilk 5.0	Ethicon	F682
Microrenathane .025 » O.D. x .012 » I.D.	Bioseb	MRE-025
olimel N7E	Baxter
PE10 - Polyéthylène .011 » x .024"  ;	Instech Solomon	BTPE-10
PE-50 tube .023 » x.038"	Instech Solomon	BTPE-50
Émerillon pour rongeurs 20 G	Bioseb	RS-20G  ;
Ropivacaï ; ne	Astrazenica		Naropin 2  ; mg/mL
Xylazine	VMD		xylazine 2 %

Chlorhydrate de