Structure-fonction des études chez la souris à l'aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d'échange

Summary

Les protéines contiennent souvent plusieurs domaines qui peuvent exercer différentes fonctions cellulaires. knock-out gène (KO) ne considèrent pas cette diversité fonctionnelle. Nous rapportons ici un échange de cassette à médiation recombinaison (CREM) approche structure-fonction dans les cellules à base de souches embryonnaires KO qui permet la dissection moléculaire de différents domaines fonctionnels ou variants d'une protéine.

Abstract

génie génétique dans des embryons de souris ou de cellules souches embryonnaires (mESCs) permet l'étude de la fonction d'une protéine donnée. Les protéines sont les chevaux de trait de la cellule et sont souvent constitués de multiples domaines fonctionnels, qui peuvent être influencés par des modifications post-traductionnelles. L'épuisement de la protéine entière chez les souris knock-out conditionnel ou constitutive (KO) ne prend pas en compte cette diversité fonctionnelle et de la réglementation. Une ligne MESC et un modèle de souris dérivé, dans lequel un site d'amarrage pour l'échange de cassette de recombinaison à médiation par FLPE (CREM) a été insérée dans le locus ROSA26 (R26), a été précédemment rapporté. Nous présentons ici une approche structure-fonction qui permet la dissection moléculaire des différentes fonctionnalités d'une protéine multidomaine. A cet effet, les souris compatibles CREM doivent être croisées avec des souris KO et KO mESCs compatibles CREM doivent être isolés. Ensuite, un panel de constructions de sauvetage putatifs peut être introduit dans le locus R26 via CREM targeting. Les cDNA de sauvetage candidats peuvent être facilement insérés entre les sites CREM du vecteur de ciblage en utilisant le clonage de recombinaison. Ensuite, KO mESCs sont transfectées avec le vecteur de ciblage en combinaison avec un plasmide d'expression de recombinase FLPE. CREM le gène réactive résistance à la néomycine promoteur moins dans les sites d'accueil Rosa26 et permet la sélection de l'événement correct de ciblage. De cette manière, l'efficacité élevée de ciblage proches de 100% sont obtenus, ce qui permet l'insertion de plusieurs constructions de sauvetage putatifs d'une manière semi-débit élevé. Enfin, peut être testé une multitude de constructions de secours entraînées R26 pour leur capacité à sauver le phénotype qui a été observé dans mESCs KO parental. Nous présentons une étude de validation de principe structure-fonction dans p120 caténine (p120ctn) KO mESCs en utilisant la différenciation endoderme dans les corps embryoïdes (EbS) comme lecture phénotypiques. Cette approche permet d'identifier des domaines importants, en aval des voies putatives, et point pertinent maladiemutations qui sous-tendent KO pour une phénotypes protéine donnée.

Introduction

On estime que les génomes de mammifères contiennent environ 20 000 gènes codant pour des protéines. L'épissage alternatif et modifications post-traductionnelles augmenter encore le répertoire de protéines. Les protéines ont une structure modulaire ¹ et contiennent souvent de multiples domaines d'interaction, qui permettent leur recrutement dans différents complexes de protéines et leur participation à de multiples processus cellulaires ^2. Un exemple est la protéine multifonctionnelle appelée p120ctn. p120ctn est codée par le gène Ctnnd1 et se compose d'un grand domaine de répétition de tatou centrale flanquée p....

Protocol

Toutes les expériences sur des souris ont été menées conformément à la réglementation des animaux dans les institutions, nationales et européennes.

1. Isolement de mESCs KO CREM compatibles

1. Breed souris hétérozygotes avec des souris KO compatible CREM, tels que des souris ROSALUC ¹⁰ ou souris ROSA26-COPSi ^21. Les deux souris compatibles CREM ont été maintenues sur un mélange 129 / C57BL6 / fond suisse.
   NOTE: Le croisement avec des souris hétérozygotes KO est conseillé de surmonter chez la souris mortalité embryonnaire homozygotes KO.
2. Utiliser une PCR pour sélectionner les souris hétéroz....

Results

La procédure d'isoler les lignes compatibles CREM KO Mesc est représenté sur la figure 2. Deux consécutifs sont nécessaires Élevages pour obtenir des blastocystes KO compatible CREM. Tout d'abord, les souris KO hétérozygotes sont croisées avec des souris compatible CREM pour obtenir, souris hétérozygotes KO compatible CREM. Ces souris sont ensuite utilisées pour chronométrés avec d'autres conjugaisons souris KO hétérozygotes pour obtenir 3,5 dpc, CREM compatible, blastoc.......

Discussion

Notre méthode d'isolement MESC est convivial et ne nécessite pas de compétences avancées ou de l'équipement, comme la microchirurgie de blastocystes. Ainsi, cette technologie est accessible à une grande partie de la communauté scientifique. Toute personne ayant une expérience de culture cellulaire de base peut se propager ICM excroissances et établir des lignes de mESCs. Cependant, le rinçage et la manipulation des blastocystes nécessite une certaine pratique. Une pipette de bouche est utilisé pour transférer le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Souris ROSALUC	fabriquées à la maison		Sperme congelé disponible sur demande
R26-iPSC	Souris fabriquées à la maison		Sperme congelé disponible sur demande
Sonde de vaisseau	Outils de science fine	10160-13	pour vérifier la présence de bouchons de copulation
M2 moyen	Sigma-Aldrich	M7167	faire des aliquotes et stocker à -20 ° ; C
Pince fine (Dumont #5 Pince d’étudiant à pointe standard)	Fine Science Tools	11251-10	pulvériser 70 % d’EtOH avant utilisation (ne pas autoclave)
Aiguilles 23 G Seringues	Fine-ject	8697
de 1 mL	Soft-ject	6680
Plaques de qualité bactérienne de 60 mm (pour rinçage)  ;	Gosselin	BB60-01
Pipette buccale	fabriquée en interne		voir discussion
Fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs, TgN (DR4)1 souche Jae)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Souris Jae	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycine C  ;	Sigma-Aldrich	M0503
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium	Souris Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J Souris	JAX	3208	qui contiennent quatre gènes sélectionnables par médicament et DR4 MEFS confère une résistance à la néomycine, à la puromycine, à l’hygromycine et à la 6-thioguanine
0,1	Gélatine Sigma-Aldrich	G1393	Dissoudre 0,5 g dans 500 mL d’eau distillée, en autoclave et conserver à 4 °C.
Trypsine (0,25 %)  ;	Gibco	25200-056
2 &mu ; M pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection  ;	LMBP 08870	public disponible dans la collection BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)  ;
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection  ;	LMBP 08195	public disponible dans la collection BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)  ;
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  ;	Addgene	20733
résistant aux chocs thermiques DH5&alpha ; bactéries  ;	fabriqué en interne
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contient le gène de résistance à la kanamycine
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020  ;
Bouillon Luria (LB)  ;
Ampicilline  ;
Applied Biosystems 3730XL Analyseur d’ADN	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 réactif de transfection	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX réactif de transfection	Thermo Fisher	15338100
Effectene	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vecteur	Thermo Fisher	A10462	vectorielle compatible avec la recombinaison
monoclonale anti-p120ctn anticorps BD	Transduction Laboratories	610134
souris monoclonal anti-Ecadherin	anticorps BD Transduction Laboratories	610181
General equipment
		de dissection stériles	Ciseaux fins et pinces pour la dissection de l’utérus
Pipettes stériles : 5 mL, 10 mL et 25 mL
Tubes à centrifuger coniques de 15 mL et 50 mL Plaques
de culture à 96 puits Fond en V et fond plat)
Boîtes de culture : 24 puits, 12 puits et 6 puits Pipettes
multicanaux (pour pipettes 30, 50, 100 et 200 &mu ; L)  ;
Réservoirs
Accès à un flux
Accès à un incubateur à 37 ° ; C avec 5 % de CO2
Accès à un microscope
Accès à une centrifugeuse
Accès à un stéréomicroscope à lumière transmise  ;
Milieux de culture
MEF Moyen			stocké à 4 ° ; C; chaud 30 min à 37 ° ; C avant l’utilisation
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10 % de sérum de veau fœtal (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024  ;
Pyruvate de sodium  ; (0,4 mM)	Gibco	11360-039  ;
pénicilline (100 U/mL)	Gibco	15140-122  ;
streptomycine (100 & micro ; g/mL)	Gibco	15140-122  ;
SR-based mESC medium			stocké à 4 ° ; C; chaud 30 min à 37 ° ; C avant utilisation
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mélangé dans un rapport de 1:1
15 % de remplacement sérique knock-out (SR)	Gibco	10828&ndash ; 028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024  ;
0,1 mM d’acides aminés non essentiels  ;	Gibco	11140-050
pénicilline (100 U/mL)	Gibco	15140-122  ;
streptomycine (100 & micro ; g/mL)	Gibco	15140-122  ;
&bêta ;-mercaptoéthanol (0,1 mM)  ;	Sigma-Aldrich	M 3148  ;
2 000 U/mL de souris recombinante LIF  ;	(Installation IRC/VIB Protein Service)
FBS (similaire au milieu mESC basé sur SR)			stocké à 4° ; C; chaud 30 min à 37° ; C avant utilisation
Knockout DMEM	Gibco	10829-018  ;
15 %	FBS Hyclone	SH30070.03E
>Differention Medium			stocké à 4 ° ; C; chaud 30 min à 37 ° ; C avant utilisation
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)	Gibco	21980-032  ;
15 %	FBS Hyclone	SH30070.03E
5 % CD Hybridoma Medium(1x) liquide  ;   ;	Gibco	11279-023  ;
2 mM de L-glutamine	Gibco	25030-024  ;
0,4 mM 1-thioglycérol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 &mu ; g/mL d’acide ascorbique	Sigma-Aldrich	A-4544²
pénicilline (100 U/mL)	Gibco	15140-122  ;
streptomycine (100 & micro ; g/mL)	Gibco	15140-122  ;
2i
1 &mu ; Inhibiteur de M Erk PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 &mu ; Inhibiteur de M Gsk3 CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386