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Article de méthode

Isolation Lipid Droplet pour l'analyse quantitative de spectrométrie de masse

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DOI :

10.3791/55585

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17 avril 2017

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Dans cet article

Résumé

des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à la réplication d'une variété de différents agents pathogènes, le plus en évidence le virus de l'hépatite C (VHC), comme le site présumé de virion morphogenèse. analyse des gouttelettes de lipide protéome quantitative peut être utilisée pour identifier les protéines qui se localisent à ou sont déplacés à partir de gouttelettes lipidiques dans des conditions telles que les infections virales. Nous décrivons ici un protocole qui a été utilisé avec succès pour caractériser les changements dans le protéome des gouttelettes de lipides après infection par le VHC. Nous utilisons l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) et l'étiquette ainsi le protéome complet d'une population de cellules avec des acides « lourds » acides pour quantifier les protéines par spectrométrie de masse. Pour l' isolation des gouttelettes de lipides, les deux populations de cellules ( par exemple le VHC infectés / acides aminés « légers » et témoins non infectés / acides aminés « lourds ») sont mélangés à 1: 1 et lysées mécaniquement dans un tampon hypotonique. Après avoir enlevé les noyaux et cellules debris par centrifugation à basse vitesse, les protéines de gouttelettes lipidiques associée sont enrichies par deux étapes d'ultracentrifugation ultérieures suivies de trois étapes de lavage dans un tampon isotonique. La pureté des fractions de gouttelettes lipidiques est analysé par transfert de type western avec des anticorps reconnaissant les différents compartiments subcellulaires. protéines associées à des gouttelettes lipidiques sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. Après digestion trypsique, les peptides sont quantifiés par spectrométrie de masse Chromatographie liquide-électrospray-tandem à ionisation (LC-ESI-MS / MS). En utilisant cette méthode, nous avons identifié des protéines recrutées à des gouttelettes lipidiques sur l'infection par le VHC qui pourraient représenter des facteurs d'accueil pro- ou anti-viraux. Notre méthode peut être appliquée à une variété de différentes cellules et conditions de culture, telles que l'infection par des agents pathogènes, stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

Introduction

Les gouttelettes lipidiques sont des organelles cellulaires hautement cytoplasmiques (et nucléaires) dynamique composé d'un noyau de lipides neutres (triglycérides (TG) et l' ester de cholestérol (CE)) entourée par une monocouche de phospholipides avec des protéines intégrées 1. Tous les types de cellules produisent des gouttelettes lipidiques, mais ils varient en taille, la composition des lipides, et la décoration des protéines. Les gouttelettes lipidiques remplissent diverses fonctions, notamment comme réservoirs d'énergie et d'un précurseur de membrane ou en tant que dépôts de protéines. De plus, grâce à l'absorption des lipides, ils protègent les cellules de lipotoxicité, les lipides de libération sous forme de molécules de signalisation, et sont impliqués dans la dégradation des protéines et réticulum endoplasmique (RE) les réponses au stress 2. En tant que tel, une multitude de protéines se lient à des gouttelettes lipidiques et régissent leur génération, la dégradation, la traite, et l'interaction avec d'autres organelles. Parmi ceux - ci sont la famille périlipine des protéines de liaison des gouttelettes de lipides de bonne foi (PLIN1-5)f "> 3.

Gouttelette lipidique biogenèse commence probablement à l'ER, où les enzymes ER-résident catalysent la synthèse des lipides neutres qui accumulent dans la membrane bicouche, la formation d' une lentille de lipides neutres, un procédé qui a été récemment visualisé bien dans la levure 4. Membrane de flexion et des taux élevés d'acides phosphatidiques et de diacylglycérol sont alors pensé à attirer des protéines impliquées dans la biosynthèse des phospholipides, comme la synthèse simultanée des lipides neutres de base et les phospholipides de blindage est nécessaire pour la génération de gouttelettes de lipides 5. Enzymes hébergeant des domaines transmembranaires qui se trouvent à l'ER catalysent ce processus. Extension de grosses gouttelettes de lipides nécessite l'activité d'une autre classe d'enzymes de synthèse de lipides qui abritent une hélice amphipathique et peut ainsi se déplacer à partir de l'ER à des gouttelettes lipidiques. La mobilisation des lipides de gouttelettes lipidiques se produit par l'activation locale du triglycéridee lipase et diacylglycérol triglycéride lipases adipeux (ATGL) et de la lipase sensible aux hormones (HSL) ou par différentes voies de autophagiques, tels que autophagie macro- et microlipophagy ou chaperon à médiation 6. Les gouttelettes lipidiques interagissent avec d' autres organelles cellulaires tels que mitochondries (pour la bêta-oxydation et la synthèse des lipides) et ER (pour la synthèse des lipides et le trafic de protéine), mais aussi avec les lysosomes, les endosomes et les vacuoles induites par des bactéries intracellulaires 7. En effet les bactéries, les virus, les parasites et même cible gouttelettes lipidiques pour la réplication et la persistance, parmi eux le VHC 8.

L' infection par le VHC est l' une des principales causes de la morbidité liée au foie et mortalité dans le monde, ce qui représente environ 0,5 million de décès par an 9. Le nombre réel d'infections par le VHC est inconnu, mais les estimations récentes suggèrent que 130 - 150 millions de personnes sont chroniquement infectées. pas VACCINe existe, mais l'augmentation a récemment approuvé Antiviraux-à action directe de façon spectaculaire les réponses thérapeutiques par rapport à la thérapie à base d'interféron standard. Cependant, dans le monde entier, le traitement des patients sera probablement limitée en raison des coûts extrêmement élevés des nouveaux traitements. Environ la moitié des personnes chroniquement infectées par le VHC développent une maladie du foie gras (stéatose), une condition caractérisée par l'accumulation excessive de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. Intrigant, des gouttelettes lipidiques ont également émergé comme organites cellulaires vitaux pour la réplication du VHC, au service putative comme sites d'assemblage viraux 10, 11.

Dans les cellules infectées par le VHC, le noyau de la protéine virale et NS5A localisent à des gouttelettes de lipides dans un processus qui dépend de la biosynthèse des triglycérides, en tant qu'inhibiteurs de la diacylglycérol acyltransférase 1 (DGAT1) compromettre le trafic de gouttelettes lipidiques et la production de particules de VHC subséquente 12 >, 13, 14, 15. En outre, des mutations dans les domaines de gouttelettes lipidiques de liaison de l' une ou noyau NS5A du VHC suppriment l' assemblage 16, 17. Core NS5A recrutent alors toutes les autres protéines virales, ainsi que des complexes de réplication d'ARN viral, des membranes étroitement associées à des gouttelettes lipidiques 16. Une action concertée de toutes les protéines virales est nécessaire pour la production réussie de la descendance virale infectieuse 10, 11. Les protéines structurelles font partie des virions, et les protéines non structurales favorisent les interactions protéine-protéine nécessaire à ce processus. Curieusement, la protéine de liaison aux lipides gouttelettes de bonne foi PLIN3 / TIP47 est nécessaire à la fois pour la replication de l' ARN du VHC et la libération des virions 18, 19 , 20. En dépit de ces progrès récents, les détails mécanistiques, en particulier des interactions virus-hôte au cours des dernières étapes de la réplication du VHC, restent mal définis, et la fonction précise des gouttelettes lipidiques est inconnue.

Nous décrivons ici une méthode pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées. En utilisant cette méthode, nous avons trouvé des changements profonds dans le protéome des gouttelettes de lipides lors de l' infection par le VHC et l' annexine A3 identifié comme une protéine hôte qui co-fractionne avec des gouttelettes lipidiques et est nécessaire pour la maturation du VHC efficace 21.

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Protocole

1. Préparation des médias pour l'étiquetage des Isotopes Stables avec des acides aminés dans la culture cellulaire (de SILAC)

REMARQUE: Ici, la Quantification protéine SILAC Kit - DMEM complété avec 50 mg de 13 C 6 L-Arginine-HCl a été utilisé pour l' étiquetage des SILAC. Le sérum de veau foetal dialysé (FCS) est fourni avec la protéine Kit Quantification de SILAC.

  1. Retirer 50 ml de chaque bouteille de milieu DMEM et ajouter 50 ml de FCS dialysé.
  2. Dissoudre 50 mg de 13 C 6 L-Lysine-2HCl et 50 mg de 13 C 6 L-Arginine-HCl dans 1 ml de milieu. Bien mélanger et ajouter les acides aminés au milieu DMEM + FCS.
  3. Ajouter 1x Pen / Strep et 1x substitut L-glutamine. Stérile filtre le milieu en utilisant un filtre de 0,45 um. Etiqueter le flacon comme « lourd » moyen de SILAC.
  4. Pour préparer la "lumière" milieu, répéter les étapes 1.1 à 1.3 en utilisant 50 mg de L-arginine-HCl et 50 mg de L-Lysine-2HCl. Etiqueter la bouteille "lumière » moyenne SILAC.

2. SILAC-étiquetage et de contrôle des acides aminés constitutifs

  1. Trypsiniser les cellules (1 x trypsine-EDTA) et fendue 1 x 10 5 Huh7.5 cellules dans 2 puits d'une plaque de culture à 6 puits contenant 2 ml de milieu, un puits avec le milieu de SILAC « lourd » et l' autre avec la « lumière » moyen SILAC.
  2. Cultiver les cellules pendant au moins 6 passages (de rapport de division: 1: 6); après 6 passages, l'incorporation des acides aminés « lourds » doit être supérieure à 95%.
  3. Récolte 1 x 10 6 cellules de la « lourd » - et « lumière » population de cellules à analyser marqué au l'efficacité d'incorporation. Laver les cellules dans du PBS 1x et sédimenter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 160 x g et 4 ° C.
  4. Remettre en suspension les culots cellulaires dans 150 ul de tampon SM (NaCl 150 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, et EDTA 1 mM additionné de cocktail d'inhibiteurs de protease 1x) et incuber les cellules sur de la glace pendant 30 min. Lyse caunes par sonication à 4 ° C.
    REMARQUE: Les éléments suivants sont les paramètres de sonication utilisés ici: minuterie, tenez; commande de sortie, 8; cycle de travail, 80%; et 2 x 30 impulsions.
  5. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 11 000 xg à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et déterminer la concentration en protéine avec un dosage de protéine compatible avec les détergents.
  6. Mélanger 75 pg de protéine avec un tampon 6x d'échantillon (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% de glycerol, 123 mg / ml de SDS, 600 ug / ml de bleu de bromophénol, et 60 ul / ml β-mercaptoethanol), faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min, et on sépare les protéines par SDS-PAGE dans un tampon de migration SDS (3,02 g / L de base Tris, 18,8 g / glycine L et 1 g / L SDS) à 180 V pendant environ 1 h ou selon les fabricants ' instructions.
  7. Transférer le gel dans une solution de coloration colloïdale Coomassie. Exciser la même bande de protéines de chaque voie. Digèrent les protéines avec la trypsine et d'analyser l'efficacité de l'incorporation par MS analysis, tel que décrit 22.

3. Lipid Droplet Isolement des cellules Huh7.5 SILAC marqué

  1. Infect une population de cellules ( par exemple ceux marqués avec "légers" acides aminés) avec un virus rapporteur du VHC par incubation avec des stocks de virus (par exemple, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) pendant 4 h à 37 ° C, comme décrit 21 .
    REMARQUE: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD est un virus VHC portant un journaliste de fluorescence pour surveiller les taux d'infection (monomère Kusabira Orange 2, mKO2) suivie d'une résistance Blasticidin gène (BSD) entre un site de clivage NS5A-NS5B dupliquée, décrit précédemment 21, 23. Le travail avec le VHC exige NSB2 + (Etats-Unis) ou S3 ** (Allemagne) confinement de niveau de biosécurité et les pratiques. Au lieu de l'infection par le VHC, les cellules peuvent être infectées par des agents pathogènes différents.
  2. Développez les cellules « légères » infectés par le VHC et non infectés & #34;. Des cellules lourdes » Au cours de l'repiquage des cultures, fixer une partie aliquote avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS et déterminer les taux d'infection par le VHC par cytométrie de flux de la protéine marqueur fluorescent (par exemple, mKO2), comme décrit 21; la les taux d'infection devraient être supérieurs à 90% pour l' isolement des gouttelettes lipidiques . REMARQUE: Si vous utilisez le Jc1 NS5AB-mKO2-BSD souche du VHC, ajouter 10 pg / mL blasticidine S au milieu « lumière » pour sélectionner des cellules infectées par le VHC.
  3. 1 d avant l'isolement des gouttelettes de lipides, laver les cellules avec du PBS, trypsiniser, remettre en suspension dans « lumière » et « lourd » moyen, et compter les cellules en utilisant une chambre de Neubauer. Graine 7 x 10 6 cellules de chaque population dans un 150 cm 2 boîte de culture cellulaire. Préparer au moins 5 plats par population cellulaire « légère » et « lourd ». Culture des cellules dans 30 ml de milieu / plat O / N.
  4. Retirez le milieu et laver les cellules dans du PBS 1x. Détachez les cellules 1xPBS en utilisant un grattoir à cellules.
  5. Compter les deux populations de cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer et mettre en commun des nombres égaux de cellules dans un tube à centrifugation de 50 ml. Pellet les cellules par centrifugation pendant 5 min à 160 x g et 4 ° C.
  6. Retirer le PBS et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon de saccharose (saccharose 0,25 M, EDTA 1 mM et DTT 1 mM, additionné de cocktail d'inhibiteurs de protease). Transférer la suspension cellulaire à un homogénéisateur Dounce moulants et lyser les cellules avec 200 coups sur la glace.
    REMARQUE: Confirmer la lyse cellulaire complète en utilisant une coloration au bleu trypan.
  7. Transférer le lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifuger les noyaux et les débris cellulaires pendant 10 min à 1000 x g et 4 ° C.
  8. Après centrifugation, stocker une partie aliquote de 25 ul de la fraction post-nucléaire (SNP) à -20 ° C en tant que contrôle d'entrée.
  9. Placer le reste de la fraction PNS au fond du tube de centrifugation (11 x 60 mm) et recouvrir avec du tampon de lavage de gouttelettes de lipides (~ 3 ml, 4 ml total) (50 mM, pH du tampon phosphate de potassium 7,4, 100 mM de chlorure de potassium, 1 mM d'EDTA et 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle).
  10. Centrifuger pendant 2 h à 100 000 x g et 4 ° C. La récolte de la fraction des gouttelettes de lipides flottante en utilisant une courbe, canule émoussée de la partie supérieure du tube (environ 250 à 500 ul, en fonction de la quantité de gouttelettes de lipides). Placer la fraction des gouttelettes de lipides dans un tube de centrifugeuse (11 x 60 mm), la superposition avec le tampon de lavage de gouttelettes de lipides (~ 3,5 ml, 4 ml au total), et répéter l'étape de centrifugation.
  11. La récolte de la fraction des gouttelettes de lipides flottante en utilisant une courbe, canule émoussée de la partie supérieure du tube et de transférer les gouttelettes lipidiques dans une nouvelle 1,5 mL tube de microcentrifugation. Ajouter 500 pi de tampon de lavage de gouttelettes de lipides et de spin pendant 20 min à 21 000 xg à 4 ° C.
    REMARQUE: les gouttelettes apparaissent sous la forme Lipid une bande blanche flottant au-dessus du tampon.
  12. Retirer le tampon de lavage sous-jacente en utilisant une pointe de pipette de charge de gel et répéter cette étape de lavage à trois reprises.
  13. Après l'élimination finale du tampon de lavage en utilisant une pointe de pipette de charge de gel, mélanger 5 ul de fractions de gouttelettes lipidiques avec 10 ul de tampon de lyse NP-40 (Tris-HCl 50 mM 7,4, 150 mM de NaCl et 1% de NP-40 , additionné de cocktail d'inhibiteurs de protease). Incuber l'échantillon sur la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Déterminer le niveau de protéine avec un dosage de protéine compatible avec les détergents; au moins 35 ug de protéine est nécessaire pour MS-analyse.
  14. Stocker les fractions de gouttelettes de lipides à -20 ° C.
  15. Mélanger le volume correspondant de la fraction des gouttelettes de lipide avec 4x colorant de charge. Incuber sur la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
  16. Séparer les protéines par SDS-PAGE selon le protocole du fabricant. Transférer le gel dans une solution de coloration colloïdale Coomassie. Exciser toutes les bandes de protéines du gel. Après digestion tryptique en gel 24 </ Sup>, évaporer les échantillons et les dissoudre dans 0,1% d'acide formique. Analyser par LC-MS / MS.
    REMARQUE: Ici, les analyses LC-MS / MS ont été effectuées sur un spectromètre de masse quadripôle-Time-of-Flight (Q-TOF) ou sur un piège linéaire quadripôle (LTQ) Orbitrap spectromètre de masse. Les deux instruments ont été couplés avec un ESI-source à un système nano-UPLC. Les analyses de données et LC-MS / MS analyse sur le Q-TOF et le spectromètre de masse Orbitrap ont été effectuées comme décrit 21, 22. Prenez soin de ne pas contaminer l'échantillon avec la kératine humaine. Utilisez toujours des conseils et des tubes pipette sans kératine. Préparer des tampons sous le capot d'écoulement laminaire avec des produits chimiques libres kératiniques. Avant toute utilisation, nettoyez toutes les surfaces et dispositifs avec de l'eau distillée et de l'éthanol. Portez toujours des gants et une blouse de laboratoire.

4. Analyse des Lipid Droplet Pureté

  1. Diluer aliquotes de fractions de gouttelettes lipidiques 1: 2 et des fractions d'entrée (voir étape 3.9) 01:10 avec NP-40 à Lysest un tampon. Incuber les échantillons sur la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Déterminer le niveau de protéine avec un dosage de protéine compatible avec les détergents.
  2. Mélanger des quantités égales de protéine avec un tampon 6x de l'échantillon et incuber les échantillons sur de la glace pendant 1 h pour inactiver le virus si l'on travaille avec du matériel infectieux. Procéder à la SDS-PAGE et transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose par buvardage de réservoir à 80 V pendant 90 min.
    REMARQUE: Après blocage de la membrane dans du tampon de blocage (5% de poudre de lait en poudre écrémé dans du TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl et 0,05% de Tween 20)), incuber avec des anticorps dirigés contre des marqueurs de gouttelettes lipidiques (par exemple , , PLIN1, PLIN2 ou PLIN3) et des marqueurs des autres compartiments subcellulaires (par exemple, CALR, MnSOD, ou la tubuline), suivis par des anticorps couplés à la HRP-secondaire. Utilisez chimioluminescence pour la détection de protéines.

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Résultats

Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à l'infection par le VHC que les sites présumés de l'assemblage des virions, mais les mécanismes moléculaires de la morphogenèse et la sortie de virions sont en grande partie inconnus. Identifier les facteurs de dépendance hôte nouveaux impliqués dans ce processus, nous avons effectué une analyse quantitative du protéome des gouttelettes de lipides des cellules infectées par le VHC-21 (Figure 1A).

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour isoler des gouttelettes lipidiques pour l'analyse du protéome des gouttelettes de lipides quantitative pour comparer l'enrichissement et l'appauvrissement des protéines associées à des gouttelettes lipidiques dans des conditions de culture diverses, telles que les infections virales. En tant que méthode alternative, l'analyse du protéome peut être réalisée avec quantifications sans étiquette basée sur l'intensité totale des pics. Cette méthode n'a aucune limit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions R. Bartenschlager (Université de Heidelberg) pour les constructions jc1, CM Riz (Université Rockefeller) pour les cellules Huh7.5, J. McLauchlan (Conseil de recherches médicales Virologie) pour la construction JFH1, T. Wakita (Institut national de la Maladies infectieuses, Japon) pour le JFH1, et B. Webster et WC Greene (Gladstone Institute of Virology and Immunology) pour les constructions rapporteurs HCVcc. Ce travail a été financé par des fonds de la DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 et INST 337 / 16-1 2013 (SH)). L'Institut Heinrich Pette, Institut Leibniz pour Experimental Virology est pris en charge par la Ville libre et hanséatique de Hambourg et le ministère fédéral de la santé. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de Quantification des Protéines SILAC - DMEMThermo Fisher89983  ;
13C6 L-Arginine-HCl 50  ; mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentréRoth GmbHA152.2  ;
10x SDS-Tris-Glycine - TamponGeyer Th. GmbH & Co.KG  ;A1415,0250  ;
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH  ;350500038
Solution de pénicilline/streptomycine pour la culture cellulaireSigma-Aldrich Chemie GmbH  ;P4333-100ml  ;
DPBS 1x Dulbecco’s Phosphate-buffered SalineSigma-Aldrich Chemie GmbH  ;D8537  ;
Trypsine-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH  ;T3924-100ML  ;
Chlorure de sodium BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure  ;   ;AppliChem GmbHA1086,5000A  ;
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Cocktail d’inhibiteurs de protéase 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH  ;P8340-5ML  ;
D(+)-Saccharose BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Acide chlorhydrique (HCl) pur à 37 % Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Dosage des protéines  ;Bio-Rad Laboratoris GmbH  ;500-0116  ;
GlycérolAppliChem GmbH151339
FDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Bleu de bromophénolAppliChem GmbHA2331
&beta ;-Mercaptoéthanol  ;AppliChem GmbHA4338
BlasticidineInvivogenant-bl-1  ;
Chlorure de potassiumAppliChemGmbH A1039
Fluorure de phénylméthanesulfonyle  ;AppliChem GmbHA0999
Phosphate de potassium monobasiqueSigma-Aldrich Chemie GmbH  ;
Hydrogénophosphate dipotassiqueSigma-Aldrich Chemie GmbH  ;P3786  ;
DTT  ;AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Lait écrémé en poudre en poudreAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP  ;abcamAB52355
M6PRB1/TIP47 100 & micro ; gabcamab47639
Calréticuline, pAb 200 & micro ; gEnzo Life Science GmbH  ;ADI-SPA-600-F  ;
Anti-&bêta ;-tubuline  ;Sigma-Aldrich Chemie GmbH  ;T6074 200µ ; l   ;
Éthanol absolu (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG  ;A3678,0250   ;
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbH  ;ADI-SOD-110-F
Anti-souris HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-lapin HRPThermo Fisher  ; Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blot SubstratSigma-Aldrich Chemie GmbH  ;
de culture cellulaire à 96 puitsGreiner Bio-One GmbH  ;655 180  ;
Seringue Terumo 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0,45 & micro ; m  ;SARSTEDT  ;83.1823.100  ;
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolutiongel Bio-Rad Laboratoris GmbH  ;456-9034  ;
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsGreiner Bio-One GmbH  ;657160  ;
Plats Nunclon 150/20  ;Fisher Scientific GmbH  ;10098720 - 168381
Racleur cellulaireneoLab Migge GmbH  ;C-8120  ;
Tube, 50 mLGreiner Bio-One GmbH  ;227261  ;
Tube SafeSeal sans RNase  ;SARSTEDT  ;72.706.400  ;
Tubes à centrifuger ultra clairs 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH  ;344062
Aiguilles d’aspirationTranscodent6482
Biosphere Fil. Astuce 1000  ;SARSTEDT  ;70.762.211  ;
Biosphère Fil. Astuce 200SARSTEDT  ;70.760.211  ;
Biosphère Fil. Astuce 10SARSTEDT  ;70.1130.210  ;
Broyeur de mouchoirs FisherScientific GmbH  ;
pilons pour broyeurs de tissus tout en verre DounceFisher Scientific GmbH  ;
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer confort, avec Thermoblock 1,5 mLEppendorf5355  ; 000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, module Mini Trans-Blot et bloc d’alimentation de base PowerPac,  ;BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Chambre de coulée multipleBioRad165-4110
PowerPac HC AlimentationBiorad164-5052
Centrifugeuse  ;Eppendorf5424R
  ;Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH  ;365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH  ;
Infinite M1000 PROTecan
22130912015196001 plaque 1188372210389444Centrifugeuse 335649

Références

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