Article de méthode

À l’aide de Transmission optique extraordinaire pour quantifier les biomarqueurs cardiaques dans le sérum humain

DOI :

10.3791/55597

⸱

13 décembre 2017

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1NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative, National University of Singapore, 2Cardiovascular Research Institute, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Department of Electrical and Computer Engineering, National University of Singapore, 4Institute of Materials Research Engineering, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet ouvrage décrit une méthode de lithographie de dispositifs pour fabriquer des baies de télédétection de haute qualité qui fonctionnent sur le principe de transmission optique extraordinaire. Le biocapteur est peu coûteux, robustes, faciles à utiliser et peut détecter de troponine cardiaque I en sérum aux concentrations cliniquement pertinentes (99ème percentile coupure ∼10-400 pg/mL, selon le test).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour une plate-forme de biodétection avoir la pertinence clinique dans les paramètres de point-of-care (POC), la sensibilité, la reproductibilité et la capacité de surveiller efficacement analytes dans le contexte du sérum humain sont essentiels.

Lithographie de dispositifs (néant) servait à fabriquer, à faible coût, détection des zones de plus grands que 1,5 x 1,5 mm. La surface de détection a été faite de tableaux de haute fidélité de nanoholes, chacun d’une superficie d’environ 140 nm2. La grande reproductibilité du NIL a permis d’employer une stratégie one-chip, une mesure sur 12 surfaces fabriquées individuellement, avec des variations minimales de puce-à-puce. Ces puces de résonance (LSPR) de plasmon de surface nanoimprinted localisé ont été testées sur leur capacité à mesurer de manière fiable un bioanalyte à des concentrations variant de 2,5 à 75 ng/mL au milieu de l’arrière-plan d’un complexe biofluid-dans ce sérum cas, humain. La haute fidélité de NIL permet la génération de vastes zones de détection, qui à son tour élimine le besoin d’un microscope, comme ce biocapteur peut s’interfacer facilement avec une source lumineuse de laboratoire couramment disponibles. Ces biocapteurs peuvent détecter troponine cardiaque dans le sérum avec une grande sensibilité, à une limite de détection (LD) de 0,55 ng/mL, qui est cliniquement pertinent. Ils montrent également le faible écart de puce-à-puce (en raison de la qualité du processus de fabrication). Les résultats sont commensurables avec test couramment immuno-enzymatique (ELISA)-base de tests, mais la technique conserve les avantages d’une plate-forme télédétection LSPR (c.-à-d., susceptibilité de miniaturisation et de multiplexage, ce qui en fait plus faisable pour des applications de POC).

Introduction

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Capteurs chimiques basés sur les baies de nanohole ont été un sujet de nombreuses recherches depuis le premier rapport sur la transmission optique extraordinaire (EOT) a été publié par Ebbesen et coll. 19981. Lorsque la lumière empiète sur des tableaux périodiques de structures nanohole des dimensions de longueur d’onde secondaire, transmission améliorée se produit à des longueurs d’onde spécifiques. Cela se produit lorsque la lumière incidente est couplé à Bloch-onde surface polariton (BW-SPP) et/ou des plasmons de surface localisées (LSP)2.

Le principe physique exploité lorsque biodétection avec tels tableaux périodiques est simple. Adsorption des molécules sur ou près de l’interface métal modifie la constante diélectrique du milieu en contact avec le métal, à son tour changer l’emplacement des bandes dans le spectre de la transmission. Le spectre elle-même peut être ajusté par nano-ingénierie, la forme, la taille et séparation distance3,4,5. Par sa conception, les capteurs basés sur EOT ont bandes caractéristiques dans leurs spectres qui facilitent des tâches précises6,7,8 au cours de l’enquête sur les événements de liaison moléculaire. Il s’agit d’un avantage décisif sur les plates-formes (SPR) de résonance plasmonique de surface disponibles dans le commerce.

Capteurs utilisant EOT généralement impliquent une source lumineuse optiquement alignée tels qu’un faisceau collimaté est incident sur la surface sensible. Techniques de nanohole grandes surfaces comme modèles de copolymère et interférence et nanosphere lithographie, ont mauvaise reproductibilité9. En raison de ces limitations fabricateurs avec précision les grandes surfaces qui montrent le phénomène de l’EOT, microscope optique devait se positionner correctement la source lumineuse et le détecteur. Pour simplifier la technique, de la lithographie de dispositifs de haute qualité (néant)10 a été employé. Cela a permis la production du grand capteur surfaces11 mm (échelle), éliminant la nécessité d’un microscope pour rechercher la surface sensible sur une puce. Au lieu de cela, ce capteur pourrait être facilement relié à un câble optique de fibre standard.

Depuis les sommets de transmission pour ce tableau de nanohole sont contenues dans le visible pour la région du proche infrarouge (NIR), il est parfaitement adapté à la détection des événements de liaison de biomolécules en milieu aqueux. Le comportement attendu optique du tableau nanohole a été simulé. Le résultat fut ensuite vérifié au moyen d’études avec des liquides de standard les indices de réfraction (RI). Ce tableau a été ensuite utilisé pour mesurer la concentration en troponine cardiaque I (cTnI) dans le contexte complex de sérum humain. cTnI est l’étalon-or clinique pour le diagnostic de l’infarctus aigu du myocarde.

Utilisation de ce capteur, il est possible de détecter et de quantifier la cTnI dans le sérum humain à une limite de détection (LD) de 0,55 ng/mL, qui est cliniquement pertinent. La détection est beaucoup plus rapide que le plus utilisé la technologie dans ce domaine, le dosage immuno-enzymatique (ELISA). En outre, la surface de détection peut facilement être régénérées et donc réutilisées. C’est pourquoi ce travail démontre la promesse de nanohole tableaux comme technologie viable point-of-care (POC) de biodétection au sein des sujets complexes.

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Protocole

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1. fabrication de la sonde et l’Acquisition des données

  1. Préparation du moule nickel
    1. Manteau, une couche de 220 nm d’épaisseur du faisceau d’électrons négatifs résister sur une plaquette de 600 µm d’épaisseur 4-en silicium. Écrire au tableau nanohole conçu sur cette plaquette à l’aide d’un système de lithographie par faisceau électronique.
      1. Pour accélérer le faisceau électronique écrit, écrire les motifs avec un faible dotmap (N) de 20k pour chaque taille de champ de 300 µm (A) (c.-à-d., il sont de 0,4 milliards points mappés sur chaque zone de2 300 µm, et chaque point sera soit exposée par le faisceau électronique ou non selon la conception de modèle). La valeur de la dose d’exposition de résister à faisceau électronique pour la résistance à 110 µ c cm−2 et à écrire à un courant (I) de 800 PA.
        Remarque : Par écrit du faisceau électronique, la dose d’exposition (D) est contrôlée par le temps d’exposition correspondant à chaque point (Tdot), calculée par figure-protocol-1 . Pour la dose d’exposition à 110 µ c cm−2, le temps de logement de faisceau électronique sur chaque point exposée est 0,5 µs12. Étant donné que le tableau captures d’une superficie de 1,8 mm2, il y a un total de 36 parcelles de 300 µm2 zones de champ cousues ensemble sur une baie de grande, or nanohole forme.
    2. Développer la résistance en immergeant la plaquette de silicium de 4 pouces dans la solution de développeur pendant 10 s et en laissant la gaufrette sécher à l’air.
    3. Déposer une couche de base d’un métal, tel que le nickel, cuivre ou aluminium, sur la plaquette de silicium.
    4. Plaquent l’hostie dans un système de placage dans un bain de sulfamate de nickel. Réaliser la galvanoplastie en deux étapes. Dans la première étape, durée 95 min, utilisez une densité de courant de 0,7 A dm−2; Cela remplit complètement le nanopatterns de nickel. Dans la deuxième étape, une durée 125 min, utilisez 12 A dm−2 pour atteindre 300 µm dans l’épaisseur du moule nickel final (20 nm). Assurez-vous que la valeur du pH est à 3,5-3,8 et que la température est à 52-54 ° C.
    5. Séparer le moule nickel le substrat de silicium en appliquant une force mécanique douce. Faire tremper le moule nickel dans environ 100 mL de réactif de retrait résine photosensible positive du jour au lendemain pour laver le résidu de la resist e-faisceau.
    6. Nourrir le moule nickel sec et dans un four à 100 ° C pendant 3 h. nettoyer dans un plasma gravure avec gaz2 O à 10 sccm et 100 W pendant 3 min.
  2. Fabrication de la nanostructure or
    1. Manteau 150 µL de trichlorosilane 1,1,2,2-tétrachloroéthane-heptadécafluorooctanesulfonamide-tetrahydrodecyl (FDTS) sur le moule de nickel dans un auto-assemblage machine d’enduit monocouche (SAM) à 80 ° C.
      Remarque : Cela formera une couche anti-adhésif, qui permettra la séparation de la moule de la résine photosensible (« démoulage ») à l’issue de l’étape de dispositifs. Le temps de vaporisation devrait être 180 s et le temps de réaction devraient être de 900 s.
    2. Mentions légales de le nanopatterns sur un 4 - en plaquette de verre qui a été enduit d’une couche de 300 nm d’épaisseur nulle PHOTODURCISSABLES résister à l’aide d’un nano-dispositif d’impression à une pression de 10 bars et une température de 40 ° C pendant 10 min.
    3. Transférer le moule la résine photosensible et la plaquette de verre à une lumière UV système et photoréticulables avec 75 mW cm-2 de l’exposition aux UV pendant 30 s.
      Remarque : Si toutes les étapes ont été suivies correctement, le moule de nickel devrait facilement être démoulée de la résine photosensible.
    4. Un ion réactif gravure système (RIE), effectuer une etch vierge de la résine photosensible sur le substrat de verre, avec un débit de gaz de2 O de 10 sccm, à 50 W pour 2 s pour exposer le verre sur les zones en retrait.
    5. Déposer une couche de 5 nm d’épaisseur de chrome (Cr) pour une adhérence métal et une couche de 100 nm d’or (Au) pour le capteur plasmonique sur la plaquette de verre dans une machine de dépôts de faisceau d’électrons. Utiliser un taux de dépôt de 1 Å s−1 pour Cr et 2 Å s−1 UA.
    6. Effectuez déjaugeage de la résine photosensible en plasma de2 O gravure pendant 3 min, suivie d’une étape 15-s sonification dans l’acétone.
    7. Dés l’échantillon en morceaux de 5 mm × 5 mm. Le tableau nanohole occupera le central 2 × 2 mm de la puce.
  3. Acquisition des données
    1. Mettre en place l’appareil à faire les mesures optiques tel qu’un faisceau de lumière blanche sortir par l’extrémité de la fibre optique émetteur est collimaté et incident sur la surface du capteur (tableau nanohole) à 90°.
      NOTE : La lumière est transmise à travers le tableau entier nanohole.
    2. Recueillir le signal transmis avec la fibre optique de récepteur et l’enregistrer avec un spectromètre UV-visible au sein de l’ordre de 300 à 1 000 nm.
    3. Définir le temps d’acquisition pour chaque image à 20 images de Mme moyenne 100 pour obtenir le spectre final pour réduire le bruit dans les mesures.
    4. Logiciel de traçage permet d’analyser les données basées sur les pics de transmission précédemment identifiés (en utilisant une méthode Lorentz).

2. capteur Test de sensibilité en vrac

  1. Déposer le liquide RI standard dans la cellule liquide, avec des variables de RI de 1,31 à 1,39.
  2. Immerger la puce du capteur dans le liquide standard de RI et l’aligner avec le faisceau de lumière blanche. Obtenir le spectre de la transmission.
  3. Nettoyez la puce du capteur après chaque mesurage avec un réactif de nettoyage tensio-actif et séchez-le à l’azote.

3. Modification de Surface de capteur

  1. Avant toute modification chimique, nettoyer les copeaux de capteur par immersion séquentielle dans l’isopropanol, l’acétone et l’eau désionisée. Sécher à température ambiante dans un courant de gaz d’azote sec.
  2. Incuber les puces de la sonde dans une solution éthanolique de 0,4 mM 10-carboxy-1-decanethiol et 1,6 mM 1-octanethiol de 12 h à température ambiante.
    Remarque : Cela formera une amine-réactive auto-assemblage monocouche (SAM).
  3. L’éthanol permet de rincer soigneusement et sécher à température ambiante.
  4. Faire un mélange de 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) et 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Plonger les morceaux dans ce mélange pendant 15 min.
    Remarque : Ceci activera le groupement carboxylique du SAM.
  5. Spot 50 µL de solution d’anticorps anti-troponine µg/mL 200 faite dans un tampon d’acétate pH 4.5 sur la surface du capteur et incuber pendant 30 minutes.
  6. Désactiver les esters n’ayant pas réagis en immergeant la puce du capteur dans l’éthanolamine-HCl 1 M pendant 15 min.
  7. Rincez la puce avec l’eau déminéralisée et sécher dans un courant de gaz d’azote sec à température ambiante.

4. TnIc Assay

  1. Bloquer toute liaison non-spécifique de détachage 100 µL de solution d’albumine sérique bovine (BSA) de 1 % sur la surface.
Incuber pendant 15 min.
  • Rincer les puces capteur trois fois dans une solution tampon phosphate saline (PBS). Insérez la puce dans la cellule de mesure d’enregistrer le spectre de la transmission.
    NOTE : Ceci est le spectre de référence.
  • Spot 50 µL de TnIc standard sur la surface de la puce et incuber dans un environnement humide pendant 30 min.
  • Rincer les puces capteur trois fois dans une solution de PBS et l’insérer dans la cellule de mesure d’enregistrer le spectre de la transmission.
    NOTE : Ceci est le spectre de la liaison aval.
  • Plonger les puces en 50 mM glycine-HCl (pH 2) pendant 1 min et puis rincez dans une solution de PBS trois fois pour régénérer la surface de la puce. Mesurer le spectre de transmission dans du PBS pour vérifier le succès de l’étape de régénération.

    • 5. surface Plasmon Resonance (SPR) mesure

    1. Exécuter la puce du capteur SPR multiplexée sur le système SPR avec le tampon PBS-T.
      Remarque : La composition du tampon PBS-T est 20 mM Na-phosphate, NaCl 150 mM et 0,05 % Tween 20. Le pH est de 7,4.
    2. Utiliser la norme TnIc et l’anticorps, tel que décrit à l’étape 4.
    3. Activer 3 sur 6 canaux disponibles avec un mélange d’EDC (0,2 M) et sulfo-NHS (0,05 M) pendant 5 min. effectuer une injection de 5 min de 50 µg/mL d’anticorps 560 et une injection de 5 min de la solution de l’éthanolamine-HCl 1 M.
    4. Tournez la puce du capteur à 90° et injecter les normes TnIc à différentes concentrations (75, 30, 7,5 et 2,5 ng/mL).
    5. Observez la conjugaison à l’anticorps à des points d’interaction sur la puce en temps réel par le biais de l’affichage de la SPR.
    6. Régénérer la puce en injectant 50 mM glycine-HCl (pH 2) pendant 1 min.

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    Résultats

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    Le montage optique pour prendre des mesures est illustré dans la Figure 1 a. Une image du tableau nanohole réel est donnée dans la Figure 1 b. Pour comprendre la physique de conduire le processus de détection, le logiciel de simulation de COMSOL a été utilisé pour simuler la distribution du champ plasmonique en milieu aqueux. Les résultats de la simulation sont ensuite associés à la mesure réelle. Une étude précédemment publiée c...

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    Discussion

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    Simulation de l’interaction entre la lumière incidente et les nanostructures permet d’identifier le pic approprié (dans le spectre de transmission), dont Maj peut être enregistrée en fonction de la concentration de l’analyte. Il est important de noter que la localisation des bandes en ce qui concerne la structure du capteur est cruciale pour le choix de la bande de droite, dont le déplacement peut être suivi pour détecter l’analyte. La visualisation peut être réalisée au moyen de simulations. C’est également essentiel à ...

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    Déclarations de divulgation

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    Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

    Remerciements

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    AP reconnaît l’appui du Prof T Venkatesan, directeur, NUS Nanoscience et nanotechnologie Initiative et Cabinet du président adjoint (Université nationale de Singapour) (R-398-000-084-646). CLD reconnaît l’appui de la Singapour Ministère de santé National Medical Research Council sous ses clinicien chercheur régime de financement, la NMRC/CSA/035/2012 et l’Université nationale de Singapour. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Installation de lithographie par faisceau d’électronsElionix ELS 700
    o-XylèneSigma Aldrich95662
    EB resistSumitomoNEB-22A2
    Réactif de développementShipley CompanyMicroposit MF 321
    Machine de galvanoplastieTechnotrans AG RD 50
    Décapant photoresist  ;Rohm and Haas Electronic Materials  ; LLCMicroposit Remover 1165
    Système de gravureTrion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tétrahydrodécyl)trichlorosilane  ;Gelest (PA, USA)78560-44-8
    SAM enduiseur  ;Sorona Inc.AVC 150M
    Photo-durcissable NIL resistmicro resist technologie GmbHmr-UVCur21-300nm
    Système de photopolymérisationDymax  ;Modèle 2000 Flood
    E-beam deposition machineDenton Explorer
    Spectromètre UV-visible  ;Optique océanique HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Liquides à indice de réfraction standard  ;Cargill Inc (Cedar Grove, États-Unis)18032
    Logiciel de traçageOriginOrigin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  ;Dojindo Laboratories (Japon)C385-10
    1-octanethiol  ;Sigma-Aldrich, MO, États-Unis471386
    le sulfo-N-hydroxysuccinimide et le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide  ;BioRad (CA, États-Unis)1762410
    Anticorps anti-troponine 560Hytest (Finlande)4T21
    Solution d’éthanolamine-HClBioRad (CA, États-Unis)1762450
    Configuration de résonance plasmonique de surfaceBioRad XPR36 (Haïfa, Israël)
    Puce SPR multiplexéeBioRadGLC
    Norme cTnI humainePhoenix Produits pharmaceutiquesEK -311-05
    Glycine-HClBioRad (CA, États-Unis)1762221

    Références

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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    Mots-clés

    Lithographie par nano impressionR sonance plasmonique de surface localis eD tection du s rum humainFabrication de biocapteursD tection de la troponineCapteurs pour le diagnostic d centralisMesure de la transmission optiqueR sonance plasmonique de surface

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