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L'imagerie à haute résolution et d'analyse de l'individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

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DOI :

10.3791/55610

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20 avril 2017

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1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Levure bourgeonnante est un modèle avantageux pour l' étude de la dynamique des microtubules in vivo en raison de sa génétique puissante et la simplicité de son cytosquelette de microtubules. Le protocole suivant décrit comment transformer des cellules de levure et de culture, d'acquérir des images de microscopie confocale, et analyser quantitativement la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure.

Résumé

microtubules dynamiques sont fondamentales pour de nombreux processus cellulaires et des mesures précises de la dynamique des microtubules peut donner un aperçu de la façon dont les cellules régulent ces processus et la façon dont la régulation de l'impact des mutations génétiques. La quantification de la dynamique des microtubules dans les modèles métazoaires a un certain nombre de défis associés, y compris une forte densité de microtubules et les limitations sur les manipulations génétiques. En revanche, le modèle de levure bourgeonnante offre des avantages qui permettent de surmonter ces défis. Ce protocole décrit un procédé pour mesurer la dynamique des microtubules simples dans des cellules vivantes de levure. Les cellules exprimant la tubuline marqués par fluorescence sont collées à des chambres à glissière assemblés, ce qui permet l'acquisition d'image stable time-lapse. Un guide détaillé pour la grande vitesse, l'acquisition d'images en quatre dimensions est également fourni, ainsi qu'un protocole pour quantifier les propriétés des microtubules dynamiques dans des piles d'images confocales. Ce procédé, associé à la génétique des levures classiques, provIdes une approche qui est particulièrement bien adapté pour évaluer quantitativement les effets des régulateurs de microtubules ou des mutations qui modifient l'activité des sous-unités de tubuline.

Introduction

Les microtubules sont des polymères cytosquelette en sous-unités protéiques aß-tubuline et sont utilisés dans une grande variété de contextes cellulaires, y compris le transport intracellulaire, la division cellulaire, la morphogenèse et la mobilité. Pour construire des réseaux de microtubules pour ces divers rôles, les cellules doivent réguler soigneusement où et quand la forme de microtubules. Cette régulation se fait en contrôlant les réactions que soit l'assemblage des sous-unités aß-tubuline en microtubules des polymères ou des microtubules démonter en sous-unités libres; ceci est connu comme la dynamique des microtubules.

Un objectif majeur de la zone de microtubule est d'élucider les mécanismes moléculaires qui régulent la dynamique des microtubules, y compris des études sur les sous-unités aß-tubuline et les régulateurs extrinsèques qui se lient à la tubuline et / ou aux microtubules. Une approche expérimentale bien établie est de reconstituer ce système in vitro en utilisant la protéine αβ-tubuline purifiée, souvent comavec les régulateurs extrinsèques binaison purifiés. Bien que ce soit une approche utile, il est clair que la dynamique des microtubules dans les systèmes fortement reconstitué diffère de celle observée dans les cellules vivantes. Par exemple, les microtubules croissent plus vite et rétrécissent plus lente in vivo que in vitro. Ces différences peuvent être attribuées à la disponibilité des régulateurs connus extrinsèques 1, ainsi que des facteurs encore à définir et dans les cellules. Par conséquent, il est essentiel de déterminer les activités des régulateurs des microtubules et des mutants qui perturbent la dynamique dans un contexte cellulaire natif.

Bien que les modèles métazoaires se sont avérés être les systèmes en vigueur pour enquêter sur la fonction des microtubules et de l'organisation d'ordre supérieur, plusieurs préoccupations pratiques limitent sérieusement l'utilité de ces modèles pour la mesure précise de la dynamique des microtubules. Tout d'abord, le nombre élevé de microtubules, allant de dizaines à des milliers par cellule, il est difficile de confiancesuivre les microtubules individuels au fil du temps. De nombreuses études abordent ce défi en imagerie des protéines qui localisent sélectivement aux extrémités microtubules, telles que les protéines de la famille contraignante fin (EB). Cependant, ces protéines sont connues pour ne localiser aux extrémités de microtubules de plus en plus métazoaires 2. Par conséquent, l'utilité de ces protéines est limitée à des taux de croissance mesurant directement, alors que la mesure indirectement d'autres aspects de la dynamique, comme la fréquence de la catastrophe. D'autre part, malgré les progrès de la technologie de montage sur le génome, la création de cellules qui expriment de manière stable marqué par fluorescence mutations tubuline ou l'introduction de manipuler sélectivement tubuline ou régulateurs microtubules reste un défi important. De plus, la présence de nombreux isotypes de tubuline dans l'étude métazoaires déconcerte de la façon dont les mutations affectent les gènes individuels de tubuline.

Le système de levure bourgeonnante offre plusieurs avantages importants pour la mesure dans microtubu vivodynamique. Le La levure a un réseau de microtubules simplifié qui permet la visualisation des microtubules individuels. Dans la levure, les microtubules émanent de l' organisation des centres appelés corps polaires broche (de), qui SPB sont incorporés dans l'enveloppe nucléaire 3. Les SPB servent échafaudages pour les petits complexes y-tubuline qui nucléée microtubules 4, 5. SPBs deux classes de nucléée microtubules, microtubules broche et microtubules astraux. Projet de broche de microtubules dans le nucléoplasme et sont importants pour la fixation à des chromosomes via microtubules kinétochoriens et pour la stabilisation de la broche par l' intermédiaire de chevauchement microtubules interpolaires 6. En revanche, le projet de microtubules astraux vers l'extérieur dans le cytosol et sont relativement rares par rapport au réseau dense de microtubules du fuseau. Au cours de la mitose, les cellules pré-anaphase ont seulement 1-2 microtubules astraux émanant de deux SPB; ceux-ci existent en tant que imicrotubules ertaines plutôt que sous forme de faisceaux 7. Le rôle des microtubules pendant la mitose astrale consiste à déplacer le noyau et la broche dans la jonction entre la mère et les compartiments bourgeon, connu sous le col du bouton. Ce mouvement implique des voies bien définies qui génèrent la force sur les microtubules astraux, en tirant le noyau et la broche en direction et , éventuellement , dans le col du bouton 8.

Un autre avantage du système de levure est l'utilité de la génétique, qui peuvent être utilisés pour étudier les organismes de réglementation des microtubules et des sous-unités de tubuline avec une précision sans précédent. La levure possède également un répertoire simplifié de tubuline isotypes: un seul gène β-tubuline (TUB2) et deux gènes d' a-tubuline (Bain1 et TUB3). Des mutations peuvent être facilement introduits dans ces gènes et , par conséquent étudié dans une population homogène de la tubuline 9, 10. Il y a un certain nombre de trèsconstructions disponibles pour microtubules d'étiquetage, et ceux-ci peuvent être ciblés pour l'intégration au locus chromosomique pour une expression stable (voir la discussion).

Le but général de cette méthode est d'images individuelles microtubules dans des cellules vivantes de levure en quatre dimensions (X, Y, Z et T) pour des mesures de haute résolution de la dynamique des microtubules. Des procédés pour l'intégration des constructions pour la constitutive, l'expression de faible niveau de tubuline marqué par fluorescence dans les cellules de levure sont décrits. Avant imagerie, les cellules vivantes sont montées dans des chambres de lame enduite avec la lectine concanavaline A pour stabiliser les cellules pour l'imagerie à long terme. Les paramètres optimaux pour l'acquisition d'images, ainsi qu'un flux de travail pour l'analyse des données, sont également décrites.

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Protocole

1. Préparation des plaques -Leu Dropout

  1. Ajouter 800 ml d'eau stérile, déminéralisée (2 Dih O) dans un ballon de 2 L. Ajouter 26,71 g de poudre de base de décrochage (DOB), 0,69 g de CSM-Leu, et 20 g d'agar. Mélanger avec un barreau d'agitation magnétique. Porter à 1 L avec Dih 2 O.
  2. Autoclave à 121 ° C et 19 psi pendant 30 min.
  3. Retirez le flacon de l'autoclave et laisser refroidir à ~ 65 ° C sous agitation douce.
  4. Verser 30 ml / plaque dans des plaques de 100 mm de diamètre. Que ces reposer à température ambiante pendant 36-48 h avant de le ranger à 4 ° C.

2. Intégration GFP-tub1 pour l'expression Constitutif de tubuline marqué GFP

  1. Faire bouillir une concentration stock de 10 mg / ml d'ADN simple brin (ADNsb) pendant 3 min.
  2. Moissonneuse 2 ul de l' ADN sb bouillie avec 400 ng d'ADN de plasmide GFP-Bain1 purifié 11.
    NOTE: Il existe une variété de plasmides qui peuvent être utilisés pour l'écurie, le marquage fluorescentdes microtubules dans la levure qui utilisent des fluorophores et des marqueurs sélectionnables alternatifs. Certaines de ces solutions sont décrites dans la section Discussion.
  3. Ajouter le mélange d'ADN à une aliquote de 50 ul de cellules de levure compétentes.
    NOTE: Préparer des cellules de levure compétentes avec une solution de sorbitol (SORB; 100 mM LiOAc, Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM pH 8, et 1 M de sorbitol, ajusté avec de l'acide acétique dilué à pH 8). Pour obtenir une description détaillée de la fabrication de cellules de levure compétentes, voir référence 12.
  4. Vortex à fond.
  5. Ajouter 6x le volume total de solution de polyéthylène glycol (PEG) (100 mM LiOAc, Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM / NaOH pH 8, et 40% de PEG 3350) au mélange ADN-cellules.
  6. Vortex à fond.
  7. Incuber pendant au moins 1 h à 30 ° C sous agitation douce.
  8. Ajouter le diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10% du volume total et vortex.
  9. Incuber à 42 ° C pendant 15 min.
  10. Centrifuger à 2500 g pendant 5 min.
  11. Retirez le surnageant et les cellules en suspension dans 100 pi de 2 O. Dih
  12. Cellules de la plaque sur une plaque de décrochage -Leu.
    REMARQUE: La construction GFP-Bain1 contient un marqueur d'auxotrophie de la leucine, tandis que d'autres constructions peuvent utiliser un marqueur de substitution. Le milieu d'abandon doit être spécifique au marqueur auxotrophe de la construction.
  13. Laisser les cellules transformées de croître pendant 3-5 jours à 30 ° C.
  14. Re-série de simples colonies de transformation sur une plaque fraîche de décrochage -Leu en transférant des colonies en utilisant un cure-dent autoclave. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C.
  15. Cribler visuellement chaque transformant pour un signal de GFP par mise en suspension d' environ 1 ul de cellules à partir d' une seule colonie de la plaque à l' étape 2.14 dans 2 pl d'eau sur une lame propre. Couvrir les cellules en suspension avec une lamelle et observer par microscopie à fluorescence.
    1. Exciter les transformants avec 488 nm de lumière et rechercher la présence d'un signal de GFP.
      NOTE: Cette étape peut utiliser un disque rotatif microscope confocal, mais un microscope Widefield équipé d'un objectif 100X et une optique appropriée pour l'imagerie GFP suffit. Les cellules sans microtubules GFP marqué visibles, ou ceux qui ont une fluorescence anormalement élevée, doivent être rejetées. Après cela, les souches de levure sont prêtes à être mises en culture pour l'imagerie.

3. Stimuler la culture de levure liquide

  1. Ensemencer ~ 1 pi de cellules de levure à partir d'une seule colonie sur une plaque dans 3 mL de milieu complet synthétique. Permettre aux cellules de croître pendant une nuit à 30 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
  2. Diluer la culture saturée le jour suivant à une DO 600 <0,1 dans le milieu. Retour de la culture diluée à l'agitateur 30 ° C pendant 3-4 h ou jusqu'à ce que la DO 600 est compris entre 0,4 et 0,8, lorsque les cellules sont prêtes à être chargées dans des chambres pour l' imagerie.

4. Préparer les diapositives Chambre de circulation

  1. Couperune feuille de film de paraffine en une pièce 4 en largeur et 7 en longueur.
  2. Placer une lame de microscope standard de la longueur sur la largeur de 4 pouces de film de paraffine et enrouler le film autour de la glissière 3-4 fois de telle sorte que la lame est recouverte d'un film qui a une épaisseur de 3-4 couches. Appuyez sur les couches ensemble pour qu'il y ait un joint raisonnable; ce sera plus facile à couper. Évitez d'appuyer trop fort ou faire le film à se froisser.
  3. Couper le film de paraffine le long des bords extérieurs de la lame en utilisant un rasoir de cutter propre. Utiliser une autre glissière pour fournir un bord droit pour la coupe.
  4. Pelez le film excès de la lame de travail et le jeter. Les piles restantes du film couvrir une face de la lame et seront utilisés pour fabriquer les parois entre les chambres d'imagerie.
  5. Utilisation de la deuxième coulisse en ligne droite, coupe les couches de film superposées le long de l'axe long de la glissière dans environ dix bandes, chacune de 2 à 4 mm de largeur.
  6. Couper les couches de film de paraffine empilées perpendiculairement àles coupes faites à l'étape 4.5, le long du petit axe de la glissière, pour créer des bandes de 2-4 mm de large, 23-24 mm de long et 3-4 couches épaisses.
  7. Éplucher les bandes découpées au moyen d'un rasoir à un angle de 45 °. En utilisant des pinces, répartir uniformément les bandes de film coupé sur une lame de microscope propre à créer les nombres désirés de chambres. Jusqu'à 3 chambres (4 à base de bandes de film de paraffine) peuvent être créés sur une diapositive.
  8. Placer une seule lamelle couvre-objet au-dessus des bandes de film et de le déplacer en position avec une pince.
  9. Placer la lame préparée, lamelle couvre-objet en place, sur une plaque chauffante réglée à ~ 95 ° C (ce qui est approximativement le réglage basse-moyenne sur la plupart des plaques de cuisson). Chauffer la glissière jusqu'à ce que les bandes de film sont translucides (environ 3 min), puis sceller la lame et lamelle ensemble en appuyant légèrement sur la lamelle avec la pince à épiler.
    NOTE: Il est important de ne presse sur les régions du qui sont directement lamelle au-dessus des bandes de film de paraffine, comme gratter les régions au-dessus du cHambers peuvent diminuer la qualité de l'image. Prenez soin de ne pas trop chauffer la lame; vaporisée couche de film de la volonté de la intérieur de la chambre avec un film hydrophobe qui empêche les cellules d'adhérer.
  10. Utiliser des pinces pour retirer la lame de la plaque de cuisson (le coulisseau sera chaud) et mettre de côté pour refroidir avec le côté de la lamelle orientée vers le haut; que la lame se refroidit, le film sera de retour à une coloration blanche, opaque.
    NOTE: A ce stade, les lames sont prêtes à être chargées avec des cellules de levure cultivées. diapositives supplémentaires peuvent être faites à ce point et stockés dans un endroit propre et sec pour une période de temps indéfinie.

5. Les cellules de levure de chargement dans les diapositives chambre de circulation Préparés

  1. Décongeler une gelée, 200 uL aliquote de la concanavaline A (2 mg / ml dans Dih 2 O stérile).
  2. Ajouter environ 100 ul de décongelé Concanavaline A à chaque chambre de la lame préparée par pipetage dans l'une des extrémités ouvertes. Ajouter assez concanavaline A pour remplir la chambre. Pour ce step, la concanavaline A sera tiré à travers la chambre par action capillaire.
  3. Accrocher la lame, la lamelle vers le bas, entre les deux supports pour tubes de microcentrifugation ou les stylos pendant 5 minutes pour permettre à la Concanavaline A à adhérer à la lamelle couvre -objet ( par exemple, la chambre).
  4. Retour la diapositive à une position de lamelle couvre-up. Laver la chambre avec 2x volume de la chambre (déterminée à l' étape 5.2, ci - dessus; environ 200 pi) de milieu complet synthétique pour enlever la concanavaline A.
    1. L'écoulement du milieu à travers la chambre, en utilisant soit le coin d'une serviette en papier ou un papier filtre plié en deux pour aspirer le fluide sur une extrémité de la chambre tandis que simultanément le pipetage du fluide frais dans l'autre. En variante, en utilisant un aspirateur à vide pour aspirer soigneusement le fluide hors d'une extrémité tandis que le pipetage de liquide frais dans l'autre.
  5. Les cellules de charge en faisant circuler 2x le volume de la chambre (environ 200 ul) de la suspension cellulaire (étape 3.4) en utilisant le métho d'écoulement dirigéeD décrit à l'étape 5.4.1.
    NOTE: L'objectif est à l'image d'une seule couche de cellules à la lamelle. Par conséquent, il est important de charger une concentration de cellules suffisamment petites pour ne pas empiler les uns sur les autres, mais assez grandes que les cellules suffisantes sont présentes sur le terrain pour collecter le maximum de données par acquisition d'images. La concentration optimale des cellules à l'intérieur de la chambre peut varier et doit être déterminée empiriquement. Pour augmenter la concentration de cellules dans la chambre d'écoulement, d'une pastille doucement la culture de cellules à 1000 g pendant 2 min et enlever une partie du surnageant. Pour diminuer la concentration de cellules, ajouter un milieu complet synthétique frais à la suspension cellulaire. La concentration des cellules peut être évaluée après l'étape 5.7 (ci-dessous) par l'inspection de la chambre sur un microscope à contraste de phase. A ce stade, les cellules peuvent être ajoutés à la chambre en faisant circuler la suspension de cellules plus. Cependant, la réduction de la densité des cellules à ce stade n'est pas possible et est mieux atteinten chargeant une nouvelle chambre avec une suspension cellulaire diluée.
  6. Accrocher la lame couvre-objet vers le bas, tel que décrit à l'étape 5.3, pendant 10 minutes pour permettre aux cellules d'adhérer à la lamelle.
  7. Rincer les cellules non collées par écoulement à travers 4x le volume de la chambre (environ 400 pi) de milieu complet synthétique. Cela permettra d'éliminer les cellules flottantes dans la chambre, ce qui peut contaminer l'acquisition d'images.
  8. sécher soigneusement chaque extrémité de la chambre avec un coin propre d'une serviette en papier, ce qui porte le ménisque sur le bord de la lamelle.
  9. Fermer chaque extrémité de la chambre à agent d' étanchéité à chaud (75 ° C) (par exemple, valap; parties égales de gelée de pétrole, la cire de laine, et de cire de paraffine).
    NOTE: A ce stade, la diapositive est prêt à l'image. Les chambres peuvent être imagés jusqu'à 9 h, en fonction de la densité de cellules dans chaque chambre. Les cellules vont produire du dioxyde de carbone (CO 2) dans le temps, ce qui permettra de créer progressivement les bulles qui déplacent les cellules.

6. Acquisition d'image

  1. Amener le coulisseau à un microscope inversé équipé d'un objectif CFI Plan Apo 1,45 NA 100X, un étage piézo-électrique, un disque rotatif scanner confocal, un laser d'illumination, et une caméra EMCCD. Maintenir la température de l'étape à la température ambiante (25 ° C) lors de l'acquisition.
    REMARQUE: La grande ouverture numérique permet une plus grande résolution d'image, et l'étage piézo-électrique permet l'acquisition z-stack à vitesse élevée. Les exigences minimales de microscope sont l'objectif 100X, le laser d'éclairage, et la caméra EMCCD.
  2. Amener les cellules dans le foyer. Faire en sorte que le champ d'acquisition comporte au moins 5-6 cellules regroupées en recherchant le glissement pour les cellules regroupées.
    REMARQUE: Bien qu'il ne soit pas nécessaire à l'image plus d'une cellule à la fois, l'imagerie de plusieurs cellules dans le même domaine améliore l'efficacité de l'acquisition de données sans nuire à la qualité des données. Cependant, il est essentiel que lales cellules sont sur le même plan focal et non empilés l'un sur l'autre.
  3. Programmez une acquisition multidimensionnelle pour collecter plusieurs séries z au fil du temps.
    1. Ajuster les paramètres dans les paramètres d'acquisition actifs à ce qui suit: Z-profondeur totale = 6 um, pour englober toute la cellule de levure; taille Z-step = 300 nm, afin de maximiser la collecte de la lumière sans suréchantillonnage; durée totale = 10 min; intervalles de temps = Z-série tous les 4 s; et le temps d'exposition = 90 ms pour chaque plan z.
      NOTE: Le temps d'exposition optimale varie en fonction de l'appareil photo, la source lumineuse d'excitation et d'autres facteurs. En général, le temps d'exposition optimal sera le temps minimum nécessaire pour atteindre un rapport 3: 1 du signal provenant de microtubules astraux marqué GFP pour signaler à partir du cytoplasme en fonction des valeurs de pixels mesurées par le EMCCD.
  4. Commencez l'acquisition en cliquant sur « Exécuter ». Lui permettre de fonctionner pendant toute la durée de 10 min. Enregistrer les données sous forme d'imagesérie (Tiff ou .nd2).
  5. Sélectionnez un nouveau champ à l'image dans la chambre et répétez les étapes 06.02 à 06.04.
    Remarque: Une seule chambre doit donner entre 15 et 20 champs de cellules, en fonction de la densité de cellules dans la chambre. Densités cellulaires plus élevées produiront des champs totaux inférieurs, comme le CO 2 dans la chambre va construire plus rapidement.

7. Analyse de l'image

  1. Ouvrez le fichier image dans ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) en tant que HyperStack en utilisant le plugin importateur bio-formats.
    1. Ouvrir ImageJ et faire glisser la pile d'images acquises à partir de la section 6 directement sur le panneau de commande. L'importateur bio-formats démarre automatiquement. Sélectionnez « Ok » pour charger la pile d'image en tant que HyperStack.
      NOTE: Les « Bio-formats Options d'importation » rapide sera ouvert et faire en sorte que sous la « pile Voir section », « Vue pile avec: » est réglé sur « HyperStack »; et « Ordre d'empilement: » est réglé sur « XYCZT. »
  2. Réduire chaque Z-série en une intensité maximale, projection à 2 dimensions en utilisant la fonction Z-projet.
    1. Sélectionnez le menu « Image », le sous-menu « Stack » et la fonction « Z-projet ». Sélectionnez « projection maximale » dans la liste déroulante et cliquez sur « Ok. »
  3. Appliquer un filtre médian à la pile d'image pour réduire le bruit de mouchetures en sélectionnant le menu « Process », le sous-menu « Filtres » et la fonction « médiane ». Entrez 2.0 pixels dans la zone de rayon et cliquez sur « Ok. »
  4. Identifier les cellules pré-anaphase dans le domaine.
    NOTE: Ceux - ci sont caractérisés par des boutons de taille moyenne et un court fuseau mitotique, de 1 à 1,5 mm de longueur (figure 1; la flèche pointe vers une broche de court-mitotique). Les cellules à ce stade sont idéales pour analyser la dynamique des microtubules, car ils présentent généralement qu'une few microtubules astraux émanant des pôles du fuseau 7. Astral microtubules peuvent être identifiées sous forme de filaments linéaires qui présentent une intensité de signal de la GFP uniforme de l'extrémité moins, au SPB, à l'extrémité plus, dans le cytoplasme.
  5. A partir du premier point temporel de la série d'images, en utilisant l'outil de ligne segmentée pour tracer une ligne le long d'un microtubule unique astrale, à partir de l'extrémité moins, situé à la jonction entre le microtubule astrale et les microtubules plus broche intensément marqués, à la fin, plus qui se trouve dans le cytoplasme (voir les lignes rouges dans la figure 1). Double-cliquez sur la fin de la microtubules pour compléter la ligne segmentée.
  6. Enregistrer la mesure dans le tableau des résultats en utilisant la fonction « mesure » en appuyant sur le bouton « M » sur le clavier.
    REMARQUE: Les fonctions supplémentaires, telles que l'intensité de gris, peuvent être enregistrés en définissant les mesures dans le menu « Analyser » et le sous-menu « Définir des mesures ».
  7. Avance à la prochaine timepoint soit en cliquant sur la flèche droite dans la barre Z-curseur ou en appuyant sur la touche « ./> » sur le clavier. Répétez les étapes 7.5 et 7.6 pour tous les points de temps dans la séquence d'images.
  8. Copiez les données du tableau des résultats et de les coller dans une feuille de calcul. Sauvegardez les données en sélectionnant « Enregistrer sous. »
    NOTE: Ces mesures comprennent plusieurs valeurs, mais les valeurs les plus importantes sont la tranche, ce qui indique le point temporel de la série, et la longueur, ce qui indique la longueur de la ligne (c. -à- microtubules astral). Les colonnes contenant d' autres mesures (par exemple, la zone, la valeur de pixel moyenne, l' angle, etc.) peut soit être maintenu ou mis au rebut.
  9. Créer une nouvelle colonne dans la feuille de calcul en cliquant à droite et en utilisant la fonction « Insérer ». Saisir le temps (s) de chaque point de temps.
  10. Créer un diagramme de dispersion XY de la longueur de microtubules (um) en fonction du temps (s) en utilisant le « Insérer une ligneGraphique » fonction, sélectionnez les mesures de longueur comme « Y » et la colonne de temps que « X »
    1. Identifier des régions de la polymérisation, la dépolymérisation et pause en recherchant des changements positifs et négatifs de longueur dans le temps sur le diagramme de dispersion de l'étape 7.10.
      NOTE: les événements de polymérisation augmentent la longueur des microtubules d'au moins 0,5 um sur un minimum de 3 points de temps et ajuster une régression linéaire avec un R 2 ≥ 0,9 et une valeur R> 0 (figure 1B et D, points verts). Les événements de dépolymérisation des microtubules diminuer la longueur d'au moins 0,5 um sur un minimum de 3 points de temps et ajuster une régression linéaire avec un R 2 ≥ 0,9 et une valeur de R <0 (Figure 1B et D, des points roses). les événements de pause sont séparés de polymérisation et de dépolymérisation. Les pauses sont définis comme étant la variation nette de la longueur des microtubules inférieure à 0,5 um sur un minimum de 3 points de temps;ajuster une régression linéaire avec une valeur R entre -0,4 et 0,4; et ont une pente qui ne sont pas statistiquement différents de zéro, telle que déterminée par un test F.
    2. En utilisant le diagramme de dispersion comme guide, identifier les sections du moment où le changement de longueur est positive et les mettre en évidence dans une couleur verte. Mettez en évidence les régions du moment où le changement de longueur est négatif dans une couleur rose.
    3. Calculer la régression linéaire de chaque section de mise en évidence et enregistrer la R- et R 2 -valeur pour chaque section dans les colonnes proximale aux régions. Classer chaque région colorée soit comme un événement de polymérisation ou d'un événement de dépolymérisation.
  11. Calculer les vitesses de polymérisation en divisant la variation nette de longueur par le changement dans le temps pour chaque événement de croissance. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de régression linéaire de l'étape 7.10.3.
  12. Calculer les taux de dépolymérisation en divisant la variation nette de longueur par le changement dans le temps pour chaque shrinking événement. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de taux de polymérisation de l'étape 7.11.
  13. Calculer la fréquence de catastrophe en divisant le nombre de transitions polymérisation-à-dépolymérisation par le temps total de tous les événements de croissance 13. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de taux de dépolymérisation de l'étape 7.12.
  14. Calculer la fréquence de secours en divisant le nombre de transitions dépolymérisation-à-polymérisation par la durée totale de tous les événements de retrait 13. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de fréquence de catastrophe de l'étape 7.13.
  15. Calculer la dynamicité en divisant la somme de la valeur absolue de toutes les variations de longueur de la durée totale de l'acquisition d'image, calculée à l' étape 7.10.1, et en multipliant par 27,0833 pour obtenir des sous - unités de tubuline par seconde 14. Enregistrez ces résultats dans la colonne adjacente à la fréquence de secours values de l'étape 7.14 et enregistrez le tableau des résultats.
    NOTE: Il est possible d'automatiser le processus d'analyse décrit dans les étapes 7.10-7.15 à l' aide d' un programme sur mesure (. Estrem, et al, manuscrit soumis). Le programme est conçu pour identifier les périodes de la polymérisation et de la dépolymérisation dans les mesures de longueur en suivant les paramètres décrits ci-dessus.

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Résultats

Mesure de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure fournit un outil convaincant pour évaluer comment des mutations dans les gènes codant pour des régulateurs de microtubules ou des sous-unités de tubuline polymérisation d'impact et des taux de dépolymérisation, ainsi que la fréquence de transition entre ces états. La figure 1 montre une série temporelle de la dynamique des microtubules astraux dans une cellule de type sauvage et une cellule ...

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Discussion

Le modèle de levure bourgeonnante offre des avantages majeurs pour la collecte des mesures de haute résolution de la dynamique des microtubules dans un cadre in vivo, y compris la capacité à image unique microtubules au fil du temps et la possibilité de manipuler tubuline et des régulateurs de microtubules en utilisant les outils de la génétique de levure.

Les chambres revêtues A concanavaline fournissent un certain nombre d'avantages par rapport aux dispositifs décrits précédem...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions Kerry Bloom (Université de Caroline du Nord), Kyung Lee (NCI), Markus Steven (Colorado State University), et Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) pour le partage de différents plasmides FP-tub1. Nous sommes reconnaissants à Melissa Gardner (Université du Minnesota) pour nous former dans la méthode de préparation de la chambre de diapositives. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) accorder R01GM112893-01A1 (à JKM) et T32GM008730 (à CE).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DOB (bases d’abandon)Sunrise science  ;1650
CSM-LeuSunrise science  ;1005
AgarAmerescoN833
100 mm plaques de polystyrèneFisher ScientificFB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  ; en DiH2OSigma-Aldrich  ;  ; D7656remettre en suspension à 10 mg/mL dans DiH2O. Stocker les aliquotes à -20 º ; C
Média Synthétique Complet  ;Science du lever du soleil  ;1459-100
Concanavalin ASigma-Aldrich  ;L7647remettre en suspension à 2 mg/mL dans DiH2O. Stocker les aliquotes à -20 º ; C
Lames de microscopeFisher Scientific12-544-1
Lamelles de microscopeFisher Scientific12-541-B
ParafilmFisher Scientific13-374-12film de paraffine
VALAP (parties égales de vaseline, de lanoline et de paraffine)fondre à 75 º ; C avant l’utilisation
de la forceps  ;Fisher Scientific16-100-106
Poyéthylène glycol (PEG) 3350Sigma-Aldrich  ;202444
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Microscope
Ti E microscope inversé Perfect FocusInstrumentsMEA53100
objectif 1.45 NA 100X CFI Plan ApoNikon InstrumentsMRD01905
Platine piézoélectrique  ;Physik InstrumenteP-736
Scanner à disque rotatifYokogawaCSU10
Module de combinaison laserAgilent TechnologiesMCL400B
Caméra EMCCDAndor TechnologyiXon Ultra 897  ;
NomEntreprise>Numéro de catalogueComments
Software
NIS Elements softwareNikon InstrumentsMQS31100
Microsoft Excel softwareMicrosoft
Logiciel MATLABMathWorks, Inc
ImageJ64NIHRasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, États-Unis, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-inOpen Microscopy Environment
NameCompany>Catalog NumberComments
Plasmids
pUC19-LEU2 ::GFP-TUB1pSK1050référence : Song, S. et Lee, K. S. Une nouvelle fonction de Saccharomyces cerevisiae CDC5 dans la cytokinèse. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)
Nikon

Références

  1. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
  2. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
  3. Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
  4. Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
  5. Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
  6. Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
  7. Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
  8. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  9. Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
  10. Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
  11. Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
  12. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
  13. Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
  14. Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
  15. Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
  16. Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
  17. Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
  18. Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).

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Mots-clés

Imagerie de cellules de levureMesure de la longueur des microtubulesAnalyse d images confocalesMicroscopie en acc l rTubuline marqu e la GFPG n tique des levuresPr paration de chambres sur lamesAdh sion la concanavaline AVitesse de polym risation des microtubules

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