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FRET de haute précision au niveau d'une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

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DOI :

10.3791/55623

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13 mai 2017

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1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

Dans cet article

Résumé

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

Résumé

Un protocole sur la façon d'effectuer des mesures de distances interdyeuses de haute précision en utilisant le transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) au niveau de la seule molécule dans le mode de détection de fluorescence multiparamètre (MFD) est présenté ici. MFD maximise l'utilisation de toutes les "dimensions" de la fluorescence pour réduire les artefacts photophysiques et expérimentaux et permet de mesurer la distance interdyeuse avec une précision allant jusqu'à ~ 1 Å dans les biomolécules rigides. Ce procédé a été utilisé pour identifier trois états conformationnels du domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA) pour expliquer l'activation du récepteur lors de la liaison du ligand. En comparant les structures cristallographiques connues avec les mesures expérimentales, elles ont accepté moins de 3 Â pour des biomolécules plus dynamiques. La collecte d'un ensemble de restrictions à distance qui couvre toute la dimension des biomolécules permettrait de fournir un modèle structurel de biomoléculaire dynamiqueEs.

Introduction

Un objectif fondamental des études de biologie structurale est de démêler la relation entre la structure et la fonction des machines biomoléculaires. La première impression visuelle de biomolécules ( p. Ex., Protéines et acides nucléiques) s'est produite dans les années 1950 à travers le développement de la cristallographie aux rayons X 1 , 2 . La cristallographie aux rayons X fournit des informations structurales statiques à haute résolution contraintes par l'emballage en cristal. Par conséquent, l'immobilité inhérente des modèles structurels aux rayons X évite la nature dynamique des biomolécules, un facteur qui affecte la plupart des fonctions biologiques 3 , 4 , 5 . La résonance magnétique nucléaire (RMN) 6 , 7 , 8 a fourni une solution alternative au problème en résolvant des modèles structurels dans des solutions aqueuses. Un grand avantageDe la RMN est sa capacité à retrouver la nature dynamique intrinsèque des biomolécules et des ensembles conformationnels, ce qui aide à clarifier les relations intrinsèques entre structure, dynamique et fonction 3 , 4 , 5 . Néanmoins, la RMN, limitée par la taille de l'échantillon et de grandes quantités d'échantillons, nécessite des stratégies complexes d'étiquetage pour les grands systèmes. Par conséquent, il est urgent de développer des méthodes alternatives dans la biologie structurale.

Historiquement, le transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) 9 n'a pas joué un rôle important dans la biologie structurale en raison de l'idée fausse selon laquelle FRET fournit des mesures de distance à faible précision. C'est le but de ce protocole de revoir la capacité de FRET à déterminer les distances à l'échelle nanométrique, de sorte que ces distances peuvent être utilisées pour la construction de modèles structurels de biomolécules. La première vérification expérimentaleLa dépendance à la R - 6 de l ' efficacité de FRET a été effectuée par Stryer en 1967 10 en mesurant des polyprolines de différentes longueurs comme une «règle spectroscopique». Une expérience similaire a été réalisée au niveau de la seule molécule en 2005 11 . Les molécules de polyproline se sont avérées non idéales et, par conséquent, les molécules d'ADN double brin ont été utilisées plus tard 12 . Cela a ouvert la fenêtre pour des mesures de distance précises et l'idée d'utiliser FRET pour identifier les propriétés structurelles des biomolécules.

FRET est optimal lorsque la distance de distance interdye est de ~ 0.6-1.3 R 0 , où R 0 est la distance de Förster. Pour les fluorophores typiques utilisés dans des expériences FRET à une seule molécule, R 0 est de ~ 50 Å. Généralement, FRET offre de nombreux avantages par rapport à d'autres méthodes dans sa capacité à résoudre et à différencier les structures et la dynamique dansSystèmes hétérogènes: (i) En raison de la sensibilité ultime de la fluorescence, les expériences 1 , 14 , 15 , 16 de FRET à une molécule 13 , 14 , peuvent résoudre des ensembles hétérogènes en comptant directement et en caractérisant simultanément les structures de leurs membres individuels. (Ii) Les voies de réaction complexes peuvent être directement déchiffrées dans les études FRET à une seule molécule car aucune synchronisation d'un ensemble n'est nécessaire. (Iii) FRET peut accéder à une large gamme de domaines temporels qui s'étend sur 10 décennies dans le temps, couvrant une grande variété de la dynamique biologiquement pertinente. (Iv) Les expériences de FRET peuvent être effectuées dans toutes les conditions de solution, in vitro aussi bien qu'in vivo . La combinaison de FRET avec microscopie à fluorescence permet d'étudier les structures moléculaires et les interactions directement dans les cellules vivantes 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , même avec une haute précision 20 . (V) FRET peut être appliqué à des systèmes de presque n'importe quelle taille ( par exemple, les oligomères de polyproline 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , la transcriptase inverse du VIH 26 et les ribosomes 27 ). (Vi) Enfin, un réseau de distances qui contient toute la dimension des biomolécules pourrait être utilisé pour dériver des modèles structurels de molécules statiques ou dynamiques 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Par conséquent, la spectroscopie FRET à une seule molécule peut être utilisée pour dériver des distances suffisamment précises pour être utilisées pour la modélisation structurelle à distance 26 . Ceci est possible en profitant de la détection de fluorescence multiparamètre (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , qui utilise huit dimensions de l'information de fluorescence ( c'est-à-dire le spectre d'excitation, le spectre de fluorescence, l'anisotropie, la durée de vie de la fluorescence, le rendement quantique de fluorescence, Le temps macroscopique, les intensités de fluorescence et la distance entre les fluorophores) pour réparer de manière précise et précise les contraintes de distance. En outre, l'excitation entrelacée pulsée (PIE) est combinée avec MFD(PIE-MFD) 42 pour surveiller la fluorescence de l'accepteur d'excitation directe et pour sélectionner les événements d'une seule molécule découlant d'échantillons contenant une stoechiométrie donateur-accepteur 1: 1. Une configuration typique de PIE-MFD utilise des lasers d'excitation entrelacés à deux impulsions connectés à un corps de microscope confocal, où la détection de photons est divisée en quatre canaux différents dans différentes fenêtres spectrales et caractéristiques de polarisation. Vous trouverez plus de détails dans la Figure 1 .

Il est important de noter que FRET doit être combiné avec des méthodes de calcul pour obtenir des modèles structurels atomiques compatibles avec les résultats FRET 26 , 30 . Ce n'est pas l'objectif du protocole actuel de passer en revue la méthodologie associée pour construire des modèles structurels avec des distances dérivées de FRET. Cependant, ces approches ont été appliquées en combinaison avec d'autres techniques ( p. Ex., La dispersion des rayons X à angle petitOu la résonance paramagnétique électronique), donnant naissance au domaine de la biologie structurale intégrative 43 , 44 , 45 , 46 . L'objectif actuel est d'ouvrir la voie à FRET en tant qu'outil quantitatif en biologie structurale. À titre d'exemple, cette méthodologie a été utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand (LBD) du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Le but ultime est de surmonter les limitations précitées et d'introduire FRET parmi les méthodes d'intégration utilisées pour la détermination structurale des biomolécules en fournissant des distances mesurées avec une haute précision.

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Protocole

1. Préparation du tampon PBS et traitement de la chambre

REMARQUE: Portez une gaine de laboratoire et des gants jetables lors d'essais chimiques humides. Utilisez une protection des yeux lors de l'alignement du laser.

  1. Préparation du tampon PBS
    1. Dissoudre 4,5 g de Na 2 HPO 4 , 0,44 g de NaH 2 PO 4 et 3,5 g de NaCl dans 400 ml d'eau distillée. Assurer un pH de 7,5 et stériliser la solution en autoclave sur un cycle de liquide pendant 1 h (selon l'autoclave).
    2. Prendre 15 ml de la solution PBS et mélanger avec 0,1 g de charbon de bois. Filtrer le mélange en utilisant un filtre de seringue régulier de 20 mL avec une taille de pores de 0,2 μm . Sceller et stocker le tampon PBS à température ambiante.
  2. Traitement au verre de couverture à chambre à microscope
    1. Ajouter 500 μL d'eau distillée et 5 μL de tensioactif non ionique au polysorbate 20 (voir la liste des matériaux)À un système de verre recouvert en chambre (voir la liste des matériaux) et bien mélanger. Laissez-le tremper pendant 30 min. Retirer la solution de polysorbate 20 et laver la chambre avec de l'eau distillée deux fois. Laissez-le sécher.
      REMARQUE: la chambre est maintenant prête à l'emploi.

2. Préparation de l'échantillon d'ADN

REMARQUE: Utilisez des brins d'ADN étiquetés conçus (voir la liste des matériaux) pour la création d'échantillons standard d'ADN double brin (ADND). Les oligos conçus ne doivent pas avoir de colorants à la fin d'un polymère afin d'éviter les artefacts qui peuvent compromettre la distance déterminée. La séquence d'ADN doit être choisie pour se comporter comme un corps rigide.

  1. Ajouter 1,5 μL d'un brin d'ADN marqué par un donneur et 4,5 μL d'un brin d'ADN complémentaire (accepté ou non marqué) dans un tube à microcentrifugeuse et les mélanger avec 24 μL d'eau exempte de nuclease.
    NOTE: Selon le mélange des oligonucléotides sélectionnés, les échantillons suivants seront générés: non-FRET, loW-FRET, ou les dsDNA à haute liberté.
  2. Hybrider l'ADN en utilisant un mélangeur thermique et le procédé suivant: 95 ° C pendant 10 min, 90 ° C pendant 10 min, 80 ° C pendant 10 min, 70 ° C pendant 10 min, 60 ° C pendant 10 min, 50 ° C Pendant 10 min, 40 ° C pendant 10 min, 30 ° C pendant 10 min, 20 ° C pendant 10 min, 10 ° C pendant 10 min et maintien à 5 ° C.
    REMARQUE: Les normes dsDNA générées peuvent être conservées dans un congélateur de -20 ° C pour un stockage à long terme ou peuvent être utilisées immédiatement.

3. Préparation de l'échantillon de protéines

Note: À partir de l'ADN recombinant pour l'expression de la protéine d'intérêt dans les systèmes bactériens, il est possible de muter les résidus à partir desquels les distances doivent être mesurées en cystéines. Pour ce faire, utilisez des techniques standard de mutagenèse dirigées 47 . Pour faciliter la purification des protéines, cloner l'ADN recombinant et muté dans un vecteur contenant un marqueur de purification ( par exemple,Un His-tag). Le domaine de liaison au ligand de la sous-unité 1 de glutamate (LBD) à partir du récepteur ionotropique du glutamate de NMDA (GluN1) LBD ( c.-à-d. NMDA GluN1 LBD clone dans le vecteur pET-22b (+) a été utilisé.

  1. Expression protéinique
    1. Transformer le plasmide d'ADN de construction dans le système d'expression de choix 48 .
      NOTE: Les étapes suivantes supposeront que l'expression d'une protéine soluble est transformée en Escherichia coli . La purification à partir, par exemple, de cellules de mammifères transfectées 49 ou de cellules d'insectes transduites 50 , est également possible, et des étapes détaillées peuvent être trouvées ailleurs. Assurez-vous que la souche de E. coli choisie est appropriée pour la protéine d'intérêt. Par exemple, l'expression de protéines contenant des ponts disulfure nécessite une souche de cellules compétentes avec un compartiment intracellulaire moins réducteur (voir la liste des matériaux).
    2. Inoculer un démarreur E. Coli en utilisant une pointe de pipette stérile pour ramasser une seule colonie transformée 48 . Déposez-le dans 100 mL de milieu LB sélectif (voir la Liste des matériaux) et permettent à la culture de croître pendant une nuit à 37 ° C.
    3. Préparez le bouillon LB (voir la liste des matériaux). L'autoclave pour stériliser.
    4. Inoculer des cultures à grande échelle d' E. coli transformé en ajoutant la culture de nuit à 2 L de milieu LB sélectif à un rapport 1: 500.
    5. Au cours des prochaines heures, évaluer la croissance de la culture en surveillant les lectures d'absorbance (Abs) de la culture à 600 nm, parfois appelée densité optique à 600 nm (OD 600 ), ou en utilisant un compteur de densité cellulaire. Notez que les lectures augmentent avec le temps.
    6. Induire l'expression de la protéine avec une concentration finale d'isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside 0,5 mM (IPTG) lorsque la culture atteint une DO 600 de 0,7. Shake induit E. coli à 20 ° C pendant 20-24 h.
    7. Après l'induction de protéines, granuler le E. coli en faisant tourner pendant 20 min à 3 000 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et stocker la pastille de E. coli contenant la protéine intracellulaire à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
  2. Purification des protéines
    1. Lyse E. coli en utilisant une méthode de lyse choisie ( p. Ex., Sonication, presse française, cavitation à l'azote, etc. ) 51 .
    2. Faites tourner la membrane et les débris cellulaires en centrifugant le lysat pendant 1 h à 185 000 xg et 4 ° C.
    3. Pour une protéine étiquetée par His, charger le surnageant sur une colonne de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) équilibrée, chargée de nickel en utilisant un système de chromatographie liquide à protéines rapide (FPLC) (voir la Table des matériaux ) 52 .
      NOTE: Un tampon d'équilibrage pour NMDA GluN1 LBD: 200 mM de NaCl, 20 mM de Tris et 1 mM de Glycine, pH 8. Le tampon d'élution pour NMDA GluN1 LBD: 200 mM de NaCl, 20 mM de Tris, 1 mM de Glycine et 400 mM d'Imidazole, pH 8.
      1. Lavez la colonne IMAC avec un tampon contenant une faible quantité (~ 12 mM) d'imidazole.
      2. Eluer la protéine de la colonne IMAC en utilisant un gradient linéaire d'imidazole de 12 mM à 400 mM.
    4. Dialysez la protéine pendant une nuit dans un tampon d'équilibrage sans imidazole 53 en plaçant l'éluat de l'étape 3.2.3.2 dans un tube de dialyse et en le submergeant dans le tampon d'équilibrage sous agitation continue pendant 2-3 h. Répétez au moins une fois de plus.
      REMARQUE: Les étapes 3.2.3-3.2.6 supposent la purification d'une protéine étiquetée par His. Si vous purifiez par une autre méthode, ajustez le protocole en conséquence.
    5. Quantifier la quantité de protéines en prenant l'absorbance à 280 nm de la protéine dialysée et en utilisant la loi de la bière ( unité Absorbance = ε L c , où ε Est le coefficient d'extinction (M -1 cm -1), Qui peut être obtenu ici 54 ; L est la longueur du trajet lumineux (cm); Et c est la concentration en protéines (M)).
      NOTE: Différents tests de quantification de protéines sont disponibles, y compris le dosage de Bradford et l'essai d'acide bicinconinique. Les deux fournissent des résultats précis.
  3. Étiquetage des protéines
    1. Ajouter des colorants fluorés de donneur (colorant cyan-vert réactif maléimide) et d'accepteur (colorant farineux réactif maléimide) à la protéine purifiée à un rapport molaire de protéine 1: 1: 8: donneur: accepteur.
    2. Incuber le mélange de protéines et de fluorophores sur de la glace pendant 30 min. Des temps d'incubation plus longs sont possibles.
    3. Emballer une colonne d'agarose à 0,5 ml de Ni-Nitrilotriacetic (Ni-NTA) (voir la Liste des matériaux) et l'équilibrer en utilisant le même tampon d'équilibrage qu'à l'étape 3.2.3 pendant que la protéine est en incubation.
      REMARQUE: Conservez la quantité de protéines chargées en fonction de la capacité de liaison de la résine.
    4. Après les 30 minutes enEn couche, charger le mélange protéine / fluorophore sur la colonne préparée à l'étape 3.3.3 et purifier par écoulement par gravité.
    5. Laver l'excès de fluorophore avec 5 ml de tampon d'équilibrage.
    6. Eluir la protéine marquée par gravité à partir de la colonne quatre fois avec 0,5 ml de tampon d'élution. Parce que la protéine a déjà été purifiée à partir d'autres protéines, aucun gradient n'est nécessaire.
    7. Vérifier chaque éluat avec un spectromètre UV-Vis pour identifier quelle fraction contient la protéine marquée. Numériser l'absorbance de 230 à 700 nm afin de s'assurer que les pics d'absorbance de la protéine (280 nm) et de chaque fluorophore (493 nm pour le fluorophore cyan-vert et 651 nm pour le fluorophore lointain) sont visibles dans le Éluat.
      NOTE: Typiquement, la protéine élue dans la fraction 2.
    8. Equilibrer une colonne de dessalage (voir la Table des matériaux ) avec du PBS traité au charbon (étape 1.1).
    9. Chargez la protéine marquée sur la colonne de dessalage par écoulement par gravité.
      REMARQUE: conservez la quantité de protéine chargée en fonction de la capacité de la colonne de dessalage sélectionnée 55 .
    10. Elute en utilisant 3,5 ml de PBS traité au charbon par écoulement par gravité et collecter des fractions de 0,5 ml de l'éluat.
    11. Utiliser un spectromètre UV-Vis pour analyser l'absorbance de chaque éluat de 230 à 700 nm pour identifier quelle fraction contient des protéines marquées.
      REMARQUE: les étapes 3.3.8-3.3.11 servent essentiellement d'étape d'échange de tampon. D'autres protocoles qui répondent à ce but sont également possibles ( p. Ex. Dialyse étendue). Alternativement, on pourrait passer directement à l'étape 3.3.8 de l'étape 3.3.2.

4. Mesures nécessaires dans les conditions d'ensemble (en Cuvette)

  1. Détermination de la constante de Förster
    1. Scan f D , l'émission de fluorescence fluorophore (cps), dans un fluorimètre en excitant le donneur à 15 nm jusqu'à sa longueur d'onde d'absorbance maximale afin d'obtenir le pleinSpectre ission. Surveiller l'émission à partir de 5 nm après la longueur d'onde d'excitation et se terminer 150 nm plus tard. Utilisez des conditions d'angle magique en réglant le polariseur d'émission à 54,7 ° Et les polariseurs d'excitation à 0 ° 56 .
      NOTE: Pour le fluorophore donneur utilisé ici, le maximum Abs se produit à 490 nm; 475 nm est utilisé comme longueur d'onde d'excitation, et l'émission de 480-650 nm est surveillée. Pour l'accepteur, le maximum Abs atteint 645 nm; 630 nm est utilisé pour la longueur d'onde d'excitation, et l'émission de 635-735 nm est surveillée.
    2. Utilisez le fluorimètre pour effectuer un balayage d'excitation du fluorophore accepteur (Abs A ) allant de 400-700 nm et utilisez des conditions d'angle magique en réglant le polariseur d'émission à 54,7 ° Et les polariseurs d'excitation à 0 ° 56 . Réglez le monochromateur d'émission à 15 nm après la longueur d'onde maximale d'émission. Normalize au maximum de l'excValeur de répartition.
    3. Sur les tableaux publiés, localiser le coefficient d'extinction de l'accepteur, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , ou utiliser les valeurs fournies par le fabricant.
      NOTE: La valeur publiée pour le fluorophore accepteur utilisé dans ce manuscrit est ε A647 = 270 000 cm -1 M -1 56 .
    4. Calculer le chevauchement spectral en utilisant J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , où f D , Abs A et ε A ont été définis au-dessus de λ et sont la longueur d'onde (nm). Utilisez une feuille de calcul pour répertorier dans les colonnes toutes les valeurs dépendant de la longueur d'onde obtenues aux étapes 4.1.1-4.1.3. Alignez-les en fonction de la longueur d'onde. Effectuer la sommation à partir de la longueur d'onde minimale de l'émission du donneur (λ min ) à la longueur d'onde maximale de l'absorbeur accepteurE (λ max ).
    5. Calculez la constante de Förster (R o ) en utilisant la formule suivante R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , où J est le chevauchement spectral préalablement calculé à l'étape 4.1.4, Κ 2 Est le facteur d'orientation, Φ F, D Est le rendement quantique de fluorescence du fluorophore donneur, et n est l'indice de réfraction du milieu dans lequel se situe le fluorophore.
      REMARQUE: Utilisez n = 1.33 (si le tampon aqueux est utilisé) et κ 2 = 2/3.
    6. Localisez la valeur de rendement quantique du fluorophore donneur (Φ F, D , Dépendant de l'environnement) sur les tableaux publiés (voir Référence 57) et utiliser la valeur du chevauchement spectral obtenu à l'étape 4.1.4 pour calculer la valeur finale de la constante de Förster en utilisant l'eqDe l'étape 4.1.5.
      REMARQUE: si le rendement quantique n'est pas disponible, suivez l'étape 4.2 ci-dessous pour le calculer. Dans ce cas, utilisez Φ F, D = 0,8, ce qui correspond à une durée de vie du donneur τ D, r = 4,0 ns.
  2. Détermination du rendement quantique de fluorescence
    REMARQUE: la procédure suivante ne suppose que la trempe dynamique. Pour considérer la trempe statique, reportez-vous à la référence 56. Cependant, les expériences PIE-MFD sont également utiles pour déterminer le rendement quantique, même dans le cas de la trempe statique (voir les résultats).
    1. Sélectionnez un fluorophore de référence avec des profils d'absorbance et d'émission similaires pour les fluorophores accepteurs et donneurs pour lesquels le rendement quantique (Φ r ) a été déterminé.
      NOTE: Pour le donneur, Φ r = 0.8 et τ r = 4 ns, alors que pour l'accepteur, Φ r = 0.32 et τ r = 1.17 ns, WQui correspondent aux Φ r et τ r pour les fluorophores cyan-vert et les oligonucléotides marqués au fluorophore, respectivement 57 .
    2. Mesurez la carie de fluorescence résolue dans le temps (f (t)) en utilisant la méthode de comptage à un seul photon corrélée dans le temps (TCSPC) dans des conditions d'angle magique.
    3. Ajuster la carie de fluorescence avec une fonction de désintégration mono- ou multi-exponentielle sous la forme de f (t) = Σ i x i e -t / τ i , où x i Est la fraction de population et τ i Est la durée de vie de la fluorescence de la population.
    4. Calculer les durées de vie moyen de l'espèce, <τ> x = Σx i τ i , Où x i Est la fraction de population et τ i Est la durée de vie de la fluorescence de la population.
    5. Utilisez thE formule Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Pour calculer le rendement quantique de fluorescence du fluorophore donneur en branchant la durée de vie de fluorescence et le rendement quantique de la référence, ainsi que la durée de vie de fluorescence du fluorophore donneur.
      REMARQUE: cette méthode suppose une trempe dynamique. Pour d'autres déterminations Φ F, D , suivez Lakowicz 56 .

5. Alignement de l'expérience pour PIE-MFD Détection d'une seule molécule (SMD)

REMARQUE: il est préférable d'éteindre les lumières lors de la mesure.

  1. Réglage de l'équipement (Figure 1)
    REMARQUE: Une installation MFD à la maison représentée sur la figure 1 , avec deux lasers pulsés et 4 canaux de détection dans un corps de microscope inversé, est utilisée pour cette expérience. Il existe des systèmes commerciaux similaires.
    1. Activez les lasers 485 nm et 640 nm et tous les détecteurs de la configuration MFD. Ouvrez le logiciel qui contrôle l'acquisition TCSPC et les lasers. Assurez-vous que le taux de répétition laser est de 40 MHz.
    2. Réglez la puissance laser pulsée de 485 nm à 60 μW à un plan d'image de l'objectif d'immersion en eau de 60X 1.2 NA et de la puissance laser pulsée de 640 nm à 23 μW en mode d'excitation entrelacé pulsé (PIE-MFD) 42 .
      REMARQUE: pour régler PIE-MFD, les deux impulsions laser sont retardées dans le logiciel de contrôleur laser. Pour une excitation laser de 485 nm, les canaux TCSPC de détection (canaux TAC) sont de 1 à 12 499 (canal "prompt"). Pour une excitation laser de 640 nm, les canaux TCSPC de détection (canaux TAC) sont 12,499-50,000 (canal "delay").
    3. Ajouter un liquide d'immersion objectif (une goutte d'eau double-distillée) entre l'objectif d'objectif du microscope et une glissière en verre de couverture. Pour s'assurer que le plan de l'image est à l'intérieur de la solution et loin de la surface de verreTournez le bouton de réglage une fois et demie après avoir trouvé le deuxième point focal brillant en raison de la réflexion des lasers à l'interface verre-liquide.
    4. Ajouter 1 μL de Rhodamine 100 nM 110 à 50 μL d'eau distillée au centre du verre de couverture. Assurez-vous que la solution est également au centre de l'objectif du microscope.
    5. Ajustez les positions des trous d'épingle (taille: 70 μm) (direction x et y en une à la fois) tout en surveillant le taux de comptage des photons sur le logiciel d'acquisition afin de maximiser le nombre de photons détectés.
  2. Mesure standard SMD (travail dans une pièce sombre)
    1. Utilisez l'échantillon à partir de l'étape 5.1.4 et enregistrez 120 s du taux de comptage en cliquant sur le bouton "Démarrer" sur le panneau de contrôle résolué dans le temps (TTTR) dans le format "* .ht3" 58 sur le logiciel d'acquisition.
    2. Calculer la spectroscopie de corrélation de fluorescence hors ligne (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( c.-à-d. Mesure FCS) pour déterminer le temps caractéristique de la diffusion, le nombre de molécules dans le volume confocal, la cinétique de l'état triplet et la luminosité moléculaire 62 .
      1. Ouvrez le logiciel pour FCS (Kristine, suite MFD). Sélectionnez les paramètres expérimentaux en cliquant sur "Options" -> "Sélectionner Configurer". Sélectionnez un fichier avec des paramètres expérimentaux similaires et cliquez sur "obtenir des paramètres du fichier" pour lire les informations d'en-tête sur le fichier.
      2. Sélectionnez "Opérer" -> "Corréler" pour effectuer le FCS.
        REMARQUE: assurez-vous que les numéros de chaîne sont correctement spécifiés et que la "porte TAC" (canaux TCSPC) est cochée pour sélectionner en conséquence les canaux d'invite ou de retard.
      3. Sélectionnez "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" pour ouvrir la routine d'ajustement. Utilisez "l'équation # 24" sur la softwarE et cliquez sur "Démarrer".
        NOTE: L'équation n ° 24 sur le logiciel décrit la fonction d'autocorrélation ( G c ) de molécules fluorescentes diffusant librement sur un profil d'éclairage gaussien tridimensionnel tel que 61 :
        figure-protocol-1
        Où N est le nombre moyen de molécules dans le volume de détection, x T est la fraction de molécules exerçant la cinétique du triplet-état avec le temps caractéristique t T , t c , c'est le temps de corrélation, t diff est le temps de diffusion lié à la géométrie Le paramètre ω , et ω décrit le profil d'éclairage gaussien. Après l'ajustement, prenez note du temps de diffusion et du nombre de molécules dans le volume confocal.
    3. Ajouter 10 μL de Rhodamine 101 100 nM dans 50 μL de distilléEau et bien mélanger. Placez ce mélange sur le dessus du couvercle et assurez-vous que la gouttelettes est au centre de l'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" sur le panneau de contrôle TTTR pour enregistrer 120 s de données au format TTTR.
    4. Ajouter 1 μL de fluorophore lointain à 100 nM dans 50 μL d'eau distillée et bien mélanger. Placez ce mélange au centre de l'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" et enregistrez 120 s de données au format TTTR.
    5. Placer 50 μL d'eau distillée au centre de la lentille d'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" et enregistrez 300 s de données au format TTTR.
    6. Placer 50 μL de tampon PBS au centre de la lentille d'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" et enregistrez 300 s de données au format TTTR.
    7. Prendre 1 μl du mélange de l'étape 5.1.4 et mélanger avec 50 μL d'eau distillée. Placez ce mélange sur le couvercle. Tout d'abord, cliquez sur le bouton "Démarrer" et collectez 10 s de données en mode TTTR. Ensuite, analysez le TTLe fichier de mode TR utilisant le logiciel d'analyse Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) (Paris, MFD suite), comme décrit à l'étape 5.3.
      REMARQUE: Vérifiez le nombre de salves par seconde à partir du logiciel de sélection et d'analyse de rafale 26 , 61 . Si le niveau de rafale est d'environ 35 à tous les 10 s, il est approprié pour la mesure d'une seule molécule.
    8. Continuez à enregistrer le taux de compte rendu au format TTTR pendant 1,5 h ( c.-à-d. TCSPC à SMD) pour traiter comme une norme de mesure à une seule molécule.
      REMARQUE: en raison de la grande taille du fichier, diviser les fichiers "* .ht3" en fichiers de taille réduite pour charger et traiter à l'aide de BIFL.
  3. Analyse des échantillons standard utilisant le BIFL
    1. Ouvrez le logiciel BIFL (Paris).
    2. Sélectionnez la configuration de PIE dans la fenêtre contextuelle "Confirmer la configuration" et lisez l'en-tête en sélectionnant le fichier avec des paramètres expérimentaux similaires. Cliquez sur "obtenir des paramètresM. "Cliquez sur" OK ". Notez que la fenêtre pop-up se ferme et est intégrée dans le front-end de Paris. Cliquez sur" OK "sous" Suivant ".
    3. Choisissez les fichiers à analyser en cliquant sur "Sélectionner" sur "Data Path Array" pour sélectionner la mesure à analyser.
      1. Cliquez sur "Étalage vert" (pour une mesure de l'eau), "Vert BG" (pour une mesure tampon), "Vert épais" (pour une mesure 2 nM Rhodamine 110), "Écartement rouge" (pour une mesure de l'eau), " Red BG "(pour une mesure de tampon ou d'eau)," Rouge épais "(pour une mesure de Rhodamine 101 de 20 nM)," Étalage jaune "(pour une mesure d'eau)," BG jaune "(pour une mesure tampon) et "Yellow Thick" (pour une mesure de fluorophore lointain de 2 nM).
      2. Cliquez sur "OK" sous "Suivant".
        REMARQUE: Le canal "Vert" correspond au signal des détecteurs verts dans les canaux TCSPC "prompt". le4; Red "correspond au signal des détecteurs rouges dans les canaux TCSCP" prompt ". Le canal" Yellow "correspond au signal des détecteurs rouges dans les canaux TCSPC de retard.
    4. Cliquez sur "Ajuster" à côté de "Données coupées en ébullition" pour ajuster les paramètres de sélection d'une seule molécule. Dans la nouvelle fenêtre contextuelle, sélectionnez les événements à une seule molécule avec deux écarts types par rapport à l'heure moyenne d'arrivée d'interphoton («dt») en modifiant l'heure d'arrivée d'interphotones sous «Seuil» et le nombre minimum de photons par événement de molécule unique en «min . #. Cliquez sur "Retour" pour fermer la fenêtre contextuelle. Cliquez sur "OK" sous "Suivant".
      REMARQUE: Le seuil, en unités ms, dépend du taux de compte en arrière-plan. Le nombre minimum typique de photons utilisé est de 60.
    5. Ajustez la durée de vie de fluorescence initiale "Paramètres d'ajustement de couleur" ( p . Ex ., De, vers, et convolution) pour générerD paramètres de désintégration de fluorescence sur les couleurs "Vert", "Rouge" et "Jaune". Dans la même fenêtre, réglez les valeurs «de» et «à» pour «Demander» et «Délai». Cliquez sur "Retour" pour fermer la fenêtre contextuelle. Cliquez sur "OK" sous "Suivant".
      REMARQUE: assurez-vous que la case à cocher d'excitation à 2 couleurs est sélectionnée. "From" et "to" correspondent aux bacs initial et final sur l'histogramme de dégradation de fluorescence (numéro de canal TAC). Si les paramètres d'ajustement initiaux sont sélectionnés correctement, une fonction d'ajustement est ajoutée aux décades de fluorescence sur chaque canal.
    6. Sélectionnez l'emplacement sur le disque dur sur lequel enregistrer tous les fichiers ascii traités dans un dossier parent.
      REMARQUE: Paris traite toutes les rafales sélectionnées et crée plusieurs fichiers de sortie ascii que d'autres programmes pour la visualisation ( par exemple, Margarita MFD suite).

6. Normes dsDNA et échantillon de mesureUrements

  1. Ajouter 500 μL de tampon PBS sur un verre de couverture à chambre et placer une goutte d'eau distillée entre la chambre et l'objectif. Cliquez sur le bouton "Démarrer" sur la pédale de commande et collectez 5 minutes de données en mode TTTR à utiliser pour l'analyse.
  2. Prenez une petite quantité (habituellement autour de 0,1 μL, concentration d'environ 1 μM) de la norme dsDNA, ajoutez-la au tampon PBS et mélangez bien. Tout d'abord, collectez 10 s de données en cliquant sur "Démarrer". Ensuite, vérifiez le rafale pour obtenir 35 éclats par 10 s (comme aux étapes 5.2.7 et 5.3). Enfin, collectez> 2 h de données au format TTTR, comme décrit ci-dessus.
  3. Analyser les données recueillies pour les échantillons dsDNA, comme à l'étape 5.3.3.
  4. Visualisez les histogrammes de rafale à l'aide de la suite MFD (Margarita) et affichez l'efficacité de FRET contre <τ D (A) > f ou F D / F A versus <τ D (A) > f .
    1. Open tLe logiciel Margarita et sélectionnez "Fichier" -> "Importer tous les fichiers *. ?? 4 et * .mti." Sélectionnez le dossier parent contenant différents sous-dossiers.
    2. Sélectionnez les paramètres à visualiser en cliquant à côté de "X" (abscisse) d'un des paramètres dérivés de Paris ( par exemple, tau green ou <τ D (A) > f ); De même, répétez ceci pour que l'ordonnée "Y" sélectionne le paramètre souhaité à visualiser ( p. Ex., Efficacité FRET, F D / F A ou S PIE PIE).
      REMARQUE: Dans ce cas, l'efficacité FRET, F D / F A ou S PIE est correcte pour un taux de compte rendu approprié dans les canaux vert, rouge et jaune; Pour les rendements quantiques du donneur et de l'accepteur; Pour le rapport d'efficacité de détection (g G / g R ); Et pour la diaphonie (α). Ici, g G / g R = 3.7 et α = 0.017, en fonction uniquement de l'instrument. Taux de compte rendu d'arrière-planDépend du tampon utilisé, et les valeurs de rendement quantique sont déterminées précédemment.
    3. Ajoutez une ligne FRET en ouvrant la fenêtre "Overlay Equation" en cliquant sur "Display" -> "Overlay Equation". Sélectionnez la ligne FRET statique dans le menu contextuel. Sélectionnez les durées de vie appropriées des donneurs et les paramètres de rendement quantique pour générer la bonne ligne FRET.
      REMARQUE: les lignes FRET pour la corrélation de différents indicateurs FRET peuvent être générées.
  5. Déterminer le facteur de correction pour l'excitation de l'accepteur par la source d'excitation du donneur (β) en utilisant le paramètre stoechiométrie en affichant l'efficacité FRET par rapport à la stoechiométrie (S PIE ) à Margarita (équation 1 ci-dessous).
    NOTE: β est choisi de telle sorte que l'échantillon donneur ait un pic à S PIE = 1,0 dans l'échelle stoechiométrique; L'échantillon accepteur-seulement devrait avoir une stoechiométrie de S PIE = 0,0, et l'ADNc avec les deux étiquettes devrait avoir une stoechiométrie de S PIE ~ 0,5.
    NOTE: L'instrument est maintenant prêt, et il est possible de mesurer des échantillons étiquetés FRET.
  6. Mesurer et analyser les échantillons marqués FRET préparés dans la section 3 en suivant les étapes 6.3-6.4.

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Résultats

Dans les expériences typiques smFRET utilisant une configuration MFD (lignes laser: 485 nm à 60 μW et 640 nm à 23 μW, section 5.1), l'échantillon de fluorescence est dilué à une faible concentration picomolaire (10 -12 M = 1 pM) et placé Dans un microscope confocal, où une impulsion laser sous-nanoseconde excite des molécules marquées diffusant librement à travers un volume d'excitation. Un volume confocal typique est <4 femtoliters (fL). À de faibles concentrations...

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Discussion

Dans ce travail, le protocole d'alignement, d'étalonnage et de mesure des distances interdyeuses avec une grande précision en utilisant des expériences FRET à une seule molécule PIE-MFD est présenté. En calibrant soigneusement tous les paramètres instrumentaux, on peut augmenter la précision des distances mesurées et atteindre la précision d'Angstrom. Pour ce faire, divers histogrammes multidimensionnels sont utilisés pour analyser et identifier les populations pour une caractérisation plus poussée. En utili...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents avec le contenu de cet article.

Remerciements

VJ et HS reconnaissent le soutien du NIH R01 GM094246 à VJ. HS reconnaît les fonds de démarrage du programme d'enquête créative de l'Université de Clemson et du Centre de technologie des sciences et d'ingénierie des matériaux optiques à l'Université Clemson. Ce projet a également été soutenu par une bourse de formation du Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training du Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) et la Fondation Schissler pour les études translationnelles des maladies humaines communes à DD. Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
charbon de boisMerck KGaAK42964486 320
filtre à seringueFisherbrand09-719Ctaille : 0.20 µ ; Verre
protection à chambreFisher Scientific1554091.5 verre borosilicaté, verre de couverture de microscope à 8 puits
Fisher Scientific063014-9taille : 24 x 60-1.5
Eau sans nucléaseFisher Scientific148859sans nucléase
tween-20Thermo Scientific28320Solution à 10 % de filament d’ADN accepteur de polysorbate 20
( Technologiesd’ADN intégrées1781248955´ ;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
brin d’ADN accepteur (Low FRET)Integrated DNA Technologies1779564245´ ;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
brin d’ADN donneurIntégré DNA Technologies1779514375´ ; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
Brins d’ADN (No FRET)Integrated DNA Technologies5´ ; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermocycleurEppendorfE6331000025nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5  ; MaléimideThermo ScientificA10254appelé fluorophore cyan-vert dans le manuscrit
Alexa Fluor 647 C2  ; MaléimideThermo ScientificA20347appelé fluorophore rouge lointain dans le manuscrit
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426Pour la culture de E. coli
AmpicillineSigma-AldrichA0166Utilisé à 100 & micro ; concentration finale en g/mL dans un milieu LB sélectif pour maintenir la sélection plasmidique
Tétracyline  ;Calbiochem58346Utilisé à 12,5 & micro ; g/mL concentration finale dans le milieu LB sélectif pour maintenir la mutation gor (flutathione réductase) dans les souches d’origami B(DE3) pour faciliter l’oxydation de la liaison disulfure
KanamycineFisher ScientificBP906-5Utilisé à 15 et micro ; Concentration finale en g/mL dans le milieu LB sélectif pour maintenir la mutation trxB (rhioredoxin reductase) dans les colorants B(DE3) pour faciliter l’oxydation de la liaison disulfure
Origami B(DE3) Cellules compétentesMillipore70837-3Cellules E. coli compétentes pour l’expression des protéines avec des ponts disulfure
Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Fisher ScientificBP1755Pour l’induction de l’expression de la protéine E. coli
Chélation HiTrap HPGE Life Sciences17-0409-01Pour la purification à grande échelle de la protéine FPLC de la protéine his-marquée
ImidazoleSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose  ;Qiagen30210
-10 Colonne de dessalageGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC
Instrument Tube de dialyseSpectrum labs13256215 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
DichroicsSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Séparateur de faisceau polariseurQioptiq Linos  ;G33 5743 000Polariseur à film 10 x 10
Filtre passe-vert ChromaET525/50mET525/50m Monture 25 mm de diamètre
Filtre passe-rougeChromaET720/150mET720/150m Monture 25 mm de diamètre
Capteur de puissanceThorLabdPM200
Spectrophotomètre UV-VisVarianCary300Bio
Fluorolog 3 FluorimètreHoribaFL3-22-R3
Contrôleur Fluorohub TCSPCHoribaFluorohub-BTCSPC Électronique pour les mesures d’ensemble
NanoLed 485LHoriba485LLaser à diode bleue
NanoLed 635LHoriba635LLaser à diode rouge
Olympus IX73 MicroscopeOlympusIX73P2FMonture de microscope
PMA 40 HybridPicoQuant GmbH932200, PMA 40Optimisé pour la détection verte
PMA 50 Détecteur hybridePicoQuant GmbH932201, PMA 50Optimisé pour la sensibilité du décaleur de vitesse ed
Laser 485 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
Laser 640 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 et TTTR Logiciel d’acquisitionPicoQuant930021Minuterie d’événement picoseconde et unité de production de photons uniques corrélée dans le temps, comprend le logiciel d’acquisition TTTR
SEPIA II SLM 828 et le logiciel SEPIAPicoQuant910028pilote laser pour impulsions picosecondes, comprend le contrôleur logiciel SEPIA.
ordinateurDelloptiplex 7010processeur : i7-3770 ram : 16 Go
FRET Logiciel de positionnement et de filtrage (FPS)Heinrich HeineIl comprend le clavier Accesibel Volume disponible dans http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
suite MFDHeinrich Heine UniversityIl comprend le progiciel BIFL Paris ; Margarita pour la visualisation des hisotrams multiparamètres, et le logiciel d’analyse de distribution de probabilité disponible à http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
de m University

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FRET mol cule uniqued tection de fluorescence multiparam triquemesure de la distance entre colorantsr cepteur NMDAdomaine de liaison au ligandtats conformationnelstransfert d nergie par r sonance de fluorescencemesures de distance de pr cision

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