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Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de

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DOI :

10.3791/55627

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13 juin 2017

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1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les enregistrements de cellules entières des photorécepteurs de Drosophila melanogaster permettent de mesurer des bosses sombres spontanées, des bosses quantiques, des réponses macroscopiques à la lumière et des relations courant-tension dans diverses conditions. En combinaison avec des outils de manipulation génétique de D. melanogaster, cette méthode permet d’étudier la voie de signalisation inositol-lipidique ubiquitaire et sa cible, le canal TRP.

Résumé

Les enregistrements de pinces de tension de cellules entières à partir de photorécepteurs de Drosophila melanogaster ont révolutionné le domaine de la transduction visuelle des invertébrés, permettant l’utilisation de la génétique moléculaire de D. melanogaster pour étudier la signalisation inositol-lipidique et les canaux de potentiel de récepteur transitoire (TRP) au niveau de la molécule unique. Une poignée de laboratoires maîtrisent cette technique puissante, qui permet d’analyser les réponses physiologiques à la lumière dans des conditions hautement contrôlées. Cette technique permet de contrôler les milieux intracellulaires et extracellulaires ; la tension de la membrane ; et l’application rapide de composés pharmacologiques, tels qu’une variété d’indicateurs ioniques ou de pH, dans les milieux intracellulaires et extracellulaires. Avec un rapport signal/bruit exceptionnellement élevé, cette méthode permet de mesurer les courants unitaires spontanés et induits par la lumière (c’est-à-dire les bosses spontanées et quantiques) et les courants macroscopiques induits par la lumière (LIC) à partir de photorécepteurs uniques de D. melanogaster. Ce protocole décrit, en détail, toutes les étapes clés nécessaires à la réalisation de cette technique, qui comprend à la fois des enregistrements électrophysiologiques et optiques. La procédure de dissection de la rétine par une mouche pour l’obtention d’ommatidies isolées ex vivo intactes et viables dans la chambre de bain est décrite. L’équipement nécessaire pour effectuer des mesures d’imagerie de cellules entières et de fluorescence est également détaillé. Enfin, les pièges de l’utilisation de cette préparation délicate lors d’expériences prolongées sont expliqués.

Introduction

Des études génétiques approfondies de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), initiées il y a plus de 100 ans, ont établi que la mouche D. melanogaster est un modèle expérimental extrêmement utile pour la dissection génétique de processus biologiques complexes. La méthodologie décrite ci-dessous combine la puissance accumulée de la génétique moléculaire de D. melanogaster avec le rapport signal/bruit élevé des enregistrements de cellules entières. Cette combinaison permet d’étudier la phototransduction de D. melanogaster en tant que modèle de signalisation inositol-lipidique et de régulation et d’activation des canaux TRP, à la fois dans l’environnement natif et à la plus haute résolution de molécules uniques.

L’application de la méthode d’enregistrement de cellules entières aux photorécepteurs de D. melanogaster a révolutionné l’étude de la phototransduction des invertébrés. Cette méthode a été développée par Hardie1 et indépendamment par Ranganathan et ses collègues2 il y a ~26 ans et a été conçue pour exploiter les outils de manipulation génétique étendus de D. melanogaster et les utiliser pour découvrir les mécanismes de phototransduction et de signalisation inositol-lipidique. Dans un premier temps, cette technique souffrait d’une réduction rapide de la sensibilité à la lumière et d’un faible rendement d’ommatidies pendant le processus de dissection, ce qui empêchait les études quantitatives détaillées. Plus tard, l’ajout d’ATP et de NAD à la pipette patch a considérablement augmenté la pertinence de la préparation pour des enregistrements quantitatifs prolongés. Par la suite, une caractérisation approfondie du mécanisme de transduction du signal au niveau moléculaire a été réalisée.

Actuellement, la phototransduction de D. melanogaster est l’un des rares systèmes dans lesquels la signalisation phosphoinositide et les canaux TRP peuvent être étudiés ex vivo à une résolution moléculaire unique. Cela fait de la phototransduction de D. melanogaster et de la méthodologie développée pour étudier ce mécanisme un système modèle très sensible. Ce protocole décrit comment disséquer la rétine de D. melanogaster et déloger mécaniquement les ommatidies isolées des cellules pigmentaires (glies) environnantes. Cela permet la formation d’un giga-seal et d’un patch clamp de cellules entières sur les corps cellulaires photorécepteurs. Heureusement, la plupart des protéines de signalisation sont confinées au rhabdomère et ne diffusent pas. De plus, il existe un tampon Ca2+ immobile appelé calphotine, situé entre le compartiment de signalisation et le corps cellulaire3,4, et un niveau d’expression élevé de l’échangeur Na+/Ca2+ (CalX) dans les microvillosités5. Ensemble, le confinement des protéines dans le rhabdomère, le tampon de calphotine et la forte expression de CalX permettent des enregistrements de cellules entières relativement prolongés (c’est-à-dire jusqu’à ~20 min), sans perte de composants essentiels du processus de phototransduction et tout en maintenant une sensibilité élevée à la lumière. Le protocole suivant décrit comment obtenir des ommatidies isolées et effectuer des enregistrements de cellules entières qui semblent préserver les propriétés natives de la cascade de phototransduction. Des expériences de patch clamp sur des blattes dissociées (Periplaneta americana)6 et des ommatidies de cricket (Gryllus bimaculatus)7 ont été réalisées de manière similaire à celle décrite pour D. melanogaster. De plus, des expériences de patch clamp sur des photorécepteurs dissociés de la lime (Lima scabra) et du pétoncle (Pecten irradians) ont été réalisées d’une manière légèrement différente de celle réalisée sur D. melanogaster, permettant à la fois des mesures à cellule entière8 et à un seul canal9. Nous décrivons ici les principales réalisations obtenues chez D. melanogaster à l’aide de cette technique. La discussion comprend la description de certains pièges et limites de cette technique.

Protocole

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Préparer toutes les solutions conformément aux instructions des Tableaux 1-4.

  1. Remplir une seringue de 10 mL avec la solution extracellulaire (ES ou ES-0Ca2+ ; selon les besoins ; voir Tableau 1) et la maintenir sur glace.
  2. Préparer un flacon de solution de trituration (TS ; voir Tableau 2 ; c.-à-d. ES ou ES-0Ca2+ + FCS et saccharose) et le maintenir sur glace.
  3. Préparer un volume suffisant de solution extracellulaire pour l'expérience et la maintenir sur glace jusqu'à utilisation.
    NOTE : Une perfusion continue par bain n'est pas nécessaire ; le volume de solution extracellulaire requis ne doit donc pas dépasser quelques dizaines de mL.
  4. À l’aide d’un filtre en PVDF de 22 µm, charger la solution intracellulaire (voir Tableau 3 ou Tableau 4) dans une seringue de 1 mL munie d’une pointe allongée pour le remplissage des électrodes. Maintenir cette seringue sur glace.

2. Configuration générale des outils de dissection

Installation de microinjection en laboratoire : pipettes, outils, microscope stéréoscopique, équipement pour tâches de précision.
Figure 1 : Outils et dispositifs nécessaires pour la préparation d'ommatidies isolées. Les images montrent les différents dispositifs requis pour réaliser la préparation d'ommatidies isolées, comme décrit dans le protocole détaillé ci-dessus. Deux béchers, l'un rempli d'eau (A) et l'autre d'éthanol (B), servent à nettoyer les pipettes de trituration (D), qui sont reliées à un tube (C). Les outils de dissection comprennent deux paires de pinces fines et une paire de pinces épaisses (F) ainsi qu'une spatule à rétine (E). Pour préparer la spatule à rétine, une aiguille de microdissection (H) est pressée entre deux outils de tour agissant comme une pince (G) afin d'aplatir le sommet de l'aiguille (I). Ensuite, elle est fixée à une tige métallique allongée à l'aide de colle (J) et montée sur un porte-aiguille (E). Éclat de lame de rasoir et son support : détacher et monter un petit fragment triangulaire de lame de rasoir à l'aide d'un porte-lame (K). La zone de travail pour la dissection comprend un binoculaire (L) et une source de lumière rouge froide (M), équipée de deux guides de lumière (N). Les outils de dissection, incluant les pinces (F), la spatule à rétine (E), les béchers (A et B), une lampe de poche avec filtre rouge (Q) et des essuie-tout délicats (R), sont placés de chaque côté du binoculaire. Un seau à glace contenant le milieu ES, le milieu FBS-ES, les seringues de solution intracellulaire, la boîte de Pétri de 60 mm (S) et le porte-électrode (P) est également disposé sur la table. Les électrodes d'enregistrement sont tirées à l'aide d'un tireur horizontal (T). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

  1. Construire un rétinoscope pour isoler les rétines.
    1. Insérez la pointe (1-4 mm) d'une aiguille de microdissection (aiguille entomologique, 12 mm de longueur, 0,1 mm de diamètre) entre les mâchoires du serre-joint et aplatissez-la en tapant délicatement avec un petit marteau.
    2. Monter l'aiguille aplatie sur un porte-aiguille pour microdissection (voir le Table des matériels).
    3. À l'aide d'une paire de pinces, courber l'extrémité aplatie de l'aiguille pour former un crochet d'une courbure d'environ 2,5 mm.
  2. Créer des pipettes de trituration pour la séparation des ommatidies.
    1. Placer une capillarité en verre de 1,2 x 0,68 mm (diamètre extérieur x diamètre intérieur) au-dessus d'une flamme nue et polir la pointe à la flamme afin de réduire l'ouverture.
    2. Mesurer la taille de l'ouverture capillaire au microscope. Répartir les pipettes de trituration ommatidiales créées en sept groupes selon la taille de leurs ouvertures (c.-à-d. 0,2-0,5 mm). Les conserver dans des récipients séparés et adaptés (par exemple tubes à essai).
    3. Remplir un petit bécher d'eau doublement distillée (DDW) et un autre petit bécher d'éthanol à 70 %. Couvrir chaque bécher avec une feuille de film parafilm.
    4. Perforer un petit trou dans la feuille de film parafilm recouvrant le bécher d'eau distillée (voir Figure 1A).
    5. Percez sept petits trous dans la feuille de film parafilm qui couvre le bécher d'éthanol et numérotez les trous de 0 à 6 (voir Figure 1B).
    6. Placer une pipette de trituration ommatidiale de chaque groupe de taille dans chaque trou du film de paraffine, de sorte que la pipette ayant l'ouverture la plus grande soit située dans le 0th trou et la pipette avec l'ouverture la plus petite se trouve dans le 6th trou
    7. Connecter un tube en plastique 200 µL embout de pipette à une pièce de tube en polyéthylène de 35 cm de long et de 1,57 x 1,14 mm (diamètre extérieur x diamètre intérieur). Relier l'autre extrémité du tube à l'une des pipettes de trituration ommatidiales présentant l'ouverture la plus grande (c.-à-d. 0,46 - 0,5 mm), en veillant à ce que l'extrémité effilée de la pipette de trituration ne soit pas dirigée vers l'intérieur du tube.
  3. Préparer des pipettes pour l'enregistrement en configuration tout-cellulaire en tirant des pipettes de patch-clamp à partir de capillaires en verre borosilicate avec filament de 1 x 0,58 mm (diamètre extérieur x diamètre intérieur).
    REMARQUE : La résistance des pipettes doit être comprise entre 8 et 15 MΩ lorsqu'on utilise une solution intracellulaire à base de gluconate de potassium (IS1). Tout tireur de pipettes adapté peut être utilisé (pour des exemples, voir le Table des matériels). Le polissage à la flamme n'est pas nécessaire.
  4. Préparez une chambre d'enregistrement (voir Figure 2) en fixant une lame (voir le Table des matériels) au fond de la chambre de bain à l'aide de paraffine fondue ou de graisse de silicone haute vide. Utilisez une chambre appropriée, maison ou commerciale, permettant l'accès des électrodes et la perfusion.
  5. Monter le bain sur la platine d'un microscope inversé. Placer le tube du système de perfusion, le système d'aspiration et la masse (c.-à-d. fils/ pastille Ag-AgCl) dans le bain (voir le Table des matériels et Figure 2).
  6. Placer deux paires de pinces fines #5 (Figure 1) sur la surface de travail, pour utilisation lors des étapes de dissection de la rétine et d'isolement des ommatidies.

3. Élevage de D. melanogaster

  1. Élever les mouches D. Melanogaster à faible densité de population (i.e. ~20 mouches dans un flacon de 6 oz) dans des flacons contenant un milieu standard à base de farine de maïs, à une température de 19-24 °C.
    NOTE : Il est préférable de travailler avec des mouches adaptées à l'obscurité. Pour maintenir une haute sensibilité à la lumière, réduire la diversité et prévenir la dégénérescence rétinienne chez les mouches mutantes.
  2. Élever les mouches à l’obscurité pendant au moins 24 h avant l’expérience.
    NOTE : Les mouches utilisées pour les expériences doivent être écloses récemment (<2 h), encore molles, pâles, et présenter le méconium. Des ommatidies peuvent également être facilement préparées à partir de puces, bien que leur sensibilité à la lumière dépende fortement de l’âge10.

4. Dissection de la rétine et isolement des ommatidies : Option 1

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes suivantes sous le microscope stéréoscopique à zoom en utilisant un grossissement adapté à une observation correcte de la préparation (voir Figure 1).

  1. Déposer quatre gouttes de ES-0Ca2+ et une goutte de solution TS sur une boîte de Pétri de 60 mm retournée.
  2. A l’aide de pinces rugueuses, saisir une mouche récemment éclosue (<2 h après l’éclosion) par les ailes ou le corps. À partir de ce moment, effectuer toutes les manipulations rapidement et sous une lumière rouge tamisée à 20 ±1 °C.
  3. Tout en maintenant la mouche avec les pinces rugueuses, utiliser la première paire de pinces fines pour détacher la tête du corps. Plonger la tête dans la première goutte de ES-0Ca2+.
  4. Disséquer la tête en deux parties le long du plan sagittal à l’aide de la deuxième paire de pinces fines. S’assurer qu’à la fin de cette étape, les deux yeux sont encore intacts.
  5. Transférer une moitié de la tête dans la deuxième goutte de ES-0Ca2+ et l’autre moitié dans la troisième goutte de ES-0Ca2+.
  6. A l’aide des pinces fines, retirer autant que possible les tissus entourant l’œil, en veillant à ne pas endommager la rétine.
  7. Saisir fermement le bord d’une cornée avec les pinces fines et extraire la rétine à l’aide de la spatule.
    NOTE : À l’issue de cette étape, la cornée restera vide et intacte, séparée d’une rétine intacte.
  8. Rincer la pipette de trituration reliée au tube avec de l’eau distillée déionisée (DDW) et remplir la pipette avec une petite quantité de ES-0Ca2+ provenant de la quatrième goutte.
    NOTE : Cette étape doit être effectuée chaque fois qu’une nouvelle pipette de séparation des ommatidies est utilisée et retirée du bécher d’éthanol (la solution dans la pipette doit correspondre à celle dans laquelle la rétine est immergée).
  9. Aspirer doucement par la bouche pour faire entrer la rétine isolée dans la pipette. Faire extrêmement attention à ne pas aspirer de bulles d’air dans la pipette.
  10. Transférer la rétine isolée dans la goutte de TS. Réaliser également les étapes 4.6 à 4.10 sur le deuxième œil.
  11. Essuyer les gouttes de ES-0Ca2+ à l’aide de lingettes délicates, en ne laissant que la goutte de TS contenant les deux rétines sur la boîte de Pétri. Ajouter six gouttes supplémentaires de TS sur le dessus de la boîte de Pétri. Transférer les deux rétines vers l’une des autres gouttes de TS.
  12. Remplacer la pipette de trituration par une pipette ayant une ouverture de diamètre plus petit. La rincer comme décrit à l’étape 4.8, en utilisant la solution TS pour remplir la pipette.
  13. Aspirer et expirer rapidement et répétitivement les deux rétines dans la solution afin d’initier la séparation des ommatidies isolées, débarrassées des cellules pigmentaires, à partir de la rétine entière.
    NOTE : Les ommatidies isolées sont visibles dans la goutte de TS, et au fur et à mesure de l’avancement de l’isolement, la goutte de TS devient moins translucide.
  14. Transférer les rétines restantes dans la goutte de TS suivante. Remplir la pipette avec toute l’ancienne goutte de TS (contenant les ommatidies isolées) et expirer la goutte dans la chambre de bain.
  15. Répéter les étapes 4.12 à 4.14 afin d’obtenir un nombre maximal d’ommadites isolées. Attendre environ 1 minute pour permettre aux ommatidies isolées de couler et de s’ancrer au fond de la chambre de bain.
  16. À l’aide du système de perfusion, commencer l’écoulement de ES-0Ca2+ contenant 1,5 mM de Ca2+ dans la chambre de bain. S’assurer que la chambre est complètement remplie de solution, du bas vers le haut, et que la masse est entièrement immergée dans la solution. Continuer à rincer la chambre 4 à 5 fois.

5. Dissection de la rétine et isolement des ommatidies : option 2

Remarque : effectuer toutes les étapes suivantes sous le microscope stéréoscopique à zoom, en utilisant un grossissement adapté à une observation correcte de la préparation (voir Figure 1).

  1. Préparez un fragment de lame de rasoir et son support. Cassez et fixez un petit fragment triangulaire de lame de rasoir à l’aide d’un support pour lame de rasoir (Figure 1).
  2. Préparez un bloc ou platine de dissection en silicone conformément aux instructions du fabricant (voir la Table des Matériaux).
  3. Pour la dissection, déposez une goutte importante (<0,5 mL) de solution ES sur le bloc de dissection en silicone. Ajoutez deux gouttes « réservoir » (~50 µL chacune) de solution TS dans une boîte de Pétri de 60 mm.
  4. Immobilisez une mouche récemment éclosue (<2 h après l’éclosion) dans un tube en verre placé sur de la glace, puis saisissez-la par les ailes à l’aide de pinces. À partir de ce moment, effectuez toutes les manipulations rapidement et sous une lumière rouge tamisée à 20 ±1 °C.
  5. Tenant la mouche avec les pinces, sectionnez la tête à l’aide du fragment de lame de rasoir fixé sur son support. Saisissez une épingle à insecte (12 mm de long, 0,1 mm de diamètre) avec les pinces et transpercez la tête entre les yeux.
  6. Immergez brièvement la tête dans de l’éthanol à 70 % ; cela empêche la formation de bulles d’air à la surface de la tête ou des yeux. Épinglez la tête sous la goutte de solution ES sur la platine de dissection en silicone.
  7. Sectionez les deux yeux à l’aide du fragment de lame de rasoir en effectuant un mouvement de scie le long de la marge frontale de l’œil.
  8. Saisissez fermement le bord d’une cornée avec des pinces fines.
  9. Prélève la rétine à l’aide du curetage.
    NOTE : À l’issue de cette étape, la cornée restera vide et intacte, séparée d’une rétine intacte.
  10. Sans endommager la rétine, utilisez les pinces et le curetage pour retirer délicatement les sacs aériens adhérents et les excès de tissu cérébral.
    NOTE : La préparation de rétines isolées est également utile pour des analyses par immunotransfert de protéines non spécifiques des rétines11, pour l’histologie en montage entier et l’imagerie de la rétine entière. Des enregistrements par électrode en configuration patch peuvent également être réalisés sur les photorécepteurs de la rétine entière12.
  11. Prenez la pipette de trituration ayant le diamètre le plus grand, connectez-la au tube, puis remplissez-la en arrière à l’aide d’une petite quantité de solution TS provenant d’une des gouttes réservoir dans la boîte de Pétri, par aspiration douce (i.e. par la bouche). Effectuez cette étape à chaque fois qu’une nouvelle pipette de trituration d’ommatidies est utilisée.
  12. Expulsez doucement la solution TS sur les deux rétines à l’aide de la bouche, puis aspirez délicatement les rétines isolées dans la pipette par une aspiration douce. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air n’entre dans la pipette.
  13. Transférez les rétines isolées dans la boîte de Pétri en formant une petite goutte (~20 µL), puis rincez-les une ou deux fois avec la solution TS provenant d’une des gouttes réservoir.
  14. Incubez les rétines à l’abri de la lumière pendant 20 à 25 minutes.
  15. Remplacez la pipette de trituration d’ommatidies par une pipette ayant une ouverture de diamètre plus petit (en utilisant une solution TS fraîche provenant d’une des gouttes réservoir, comme à l’étape 4.6, pour remplir la pipette en arrière).
  16. Aspirez et expulsez rapidement les deux rétines dans une petite goutte (~20 µL) pour amorcer la séparation des ommatidies isolées.
    NOTE : Au stade initial, les cellules gliales pigmentées environnantes devraient se désagréger, laissant apparaître de petits débris visibles dans la solution.
  17. Lorsque de nombreux petits débris se sont accumulés, mais avant que de nombreuses ommatidies ne se soient séparées, utilisez une solution TS fraîche provenant d’une des gouttes réservoir et transférez les rétines vers une nouvelle petite goutte.
  18. Sélectionnez une pipette de trituration de diamètre plus petit, remplissez-la en arrière, puis poursuivez la trituration.
    NOTE : À mesure que les ommatidies commencent à se séparer, leurs formes allongées doivent devenir clairement visibles au fort grossissement du microscope stéréoscopique. Si nécessaire, continuez à changer les pipettes de trituration pour des diamètres de plus en plus petits jusqu’à obtenir un bon rendement d’ommatidies visibles.
  19. Lorsqu’un rendement satisfaisant d’ommatidies est visible et que la goutte n’est plus translucide, remplissez la pipette avec l’ensemble de la goutte contenant les ommatidies isolées, puis expulsez doucement la goutte au fond de la chambre de bain préremplie de solution ES.
  20. Attendez environ 1 minute pour permettre aux ommatidies isolées de couler et de se déposer au fond de la chambre de bain.
  21. À l’aide du système de perfusion, démarrez l’écoulement de la solution ES dans la chambre de bain. Assurez-vous que la chambre est entièrement remplie de solution, du bas vers le haut, et que la masse est complètement immergée. Continuez à rincer la chambre 4 à 5 fois.
    NOTE : Par la suite, une perfusion continue n’est pas nécessaire, bien que la chambre doive être brièvement rincée avant d’introduire une nouvelle pipette de patch.

6. Enregistrement en cellule entière

Installation d'électrophysiologie avec microscope et équipement électronique pour l'enregistrement des signaux neuronaux.
Figure 2 : Aperçu du dispositif électrophysiologique et optique. L'installation comprend une cage de Faraday en fer, peinte en noir (F). Le côté avant est recouvert d'un rideau noir intégrant une trame de cuivre à l'intérieur. Cette configuration permet d'isoler complètement le préparat de toute lumière parasite et convient à l'enregistrement de pics spontanés en conditions de noirceur. Le microscope à fluorescence inversé (A) est fixé sur une table anti-vibrations (E). L'appareil d'enregistrement des photorécepteurs est constitué d'une chambre bain en plexiglas fabriquée maison (O), dotée d'une entrée de perfusion (Q), d'une pipette d'aspiration (S) et d'une masse en argent-chlorure d'argent (P). La chambre bain est montée sur la platine du microscope (T) à l'aide d'un adaptateur fabriqué maison. La pipette d'enregistrement est reliée, par un fil en argent-chlorure d'argent, à un support en plexiglas, lui-même connecté à l'étage d'entrée de l'amplificateur (C). Cet étage d'entrée est fixé sur un micromanipulateur grossier, lui-même monté sur un micromanipulateur mécanique fin XYZ (B). Le système de perfusion (D) est composé d'un ensemble de seringues, tandis que le débit du liquide est contrôlé par des vannes pince (H). Le bâti est relié électriquement à la même masse centrale à laquelle sont connectés tous les équipements situés à l'intérieur de la cage de Faraday, et comprend un amplificateur de patch-clamp (N), un oscilloscope (J), un générateur d'impulsions ou de fonctions (K), un convertisseur analogique-numérique (L), un contrôleur de perfusion (I), ainsi qu'un contrôleur de roue à filtres et d'obturateur (M). Pour les expériences d'imagerie, une caméra CCD refroidie (-110 °C, voir le Tableau des matériaux) est connectée via un port latéral (G). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

REMARQUE : Pendant toutes les étapes suivantes, utilisez uniquement un éclairage rouge tamisé et veillez à ce que l'exposition des ommatidies à la lumière soit minimale (c.-à-d. travaillez rapidement et éteignez la source lumineuse du microscope stéréoscopique ainsi que l'éclairage rouge de la chambre utilisé pour observer les ommatidies lorsque vous effectuez des tâches ne nécessitant pas de visualisation de l'ommatidie). En outre, effectuez toutes les étapes suivantes conformément au protocole électrophysiologique standard.

  1. Sous un microscope inversé (objectif 40X), inspectez soigneusement tous les ommatidies dans le bain et sélectionnez un ommatidie approprié pour l'expérience.
    1. Assurez-vous que la membrane externe de l'ommatidie est lisse et intacte, que son axe longitudinal forme approximativement un angle droit par rapport à la direction d'approche de l'électrode (comme indiqué dans la Figure 3A), et que la section distale de l'ommatidie n'est pas entourée de tissu excédentaire. Placez l'ommatidie sélectionné sur l'axe optique de l'objectif (au centre du champ de vision) afin d'assurer une illumination uniforme.
  2. Remplissez une pipette de patch avec la solution intracellulaire (IS1 ou IS2).
    REMARQUE : Pour mesurer la réponse d'intensité et effectuer l'analyse des « bumps », utilisez IS1. Pour mesurer le potentiel de renversement des canaux sensibles à la lumière, utilisez IS2.
  3. Montez la pipette de patch sur le porte-électrode.
  4. Soufflez dans la pipette par la bouche, à travers le tube relié au porte-électrode, de manière à y créer une pression positive. Fermez la vanne du tube pour maintenir la pression.
  5. À l’aide du micromanipulateur, insérez l’électrode dans la chambre de bain.
  6. Rapprochez l’électrode de la section distale de l’ommatidie, sans qu’il y ait contact entre l’électrode et l’ommatidie, jusqu’à l’apparition d’un petit affaissement (dû à la pression positive dans la pipette de patch) visible sur l’ommatidie.
  7. Ouvrez le logiciel d’enregistrement (voir la Table des Matériaux). Ouvrez le « module de test de membrane » pour appliquer des impulsions carrées continues de 2 mV à une fréquence de 100 Hz.
  8. Réglez le potentiel de jonction sur « zéro » en ajustant le bouton approprié de l’amplificateur de patch-clamp afin que la base de l’impulsion carrée corresponde à un courant nul.
    REMARQUE : Le dispositif électrophysiologique comprend une tête d’amplification (i.e. amplification de premier niveau) reliée à un amplificateur (i.e. amplification de second niveau). Le signal analogique amplifié est converti en signal numérique à l’aide d’un convertisseur A/N, contrôlé par un logiciel installé sur un ordinateur PC.
  9. Relâchez la pression positive dans la pipette en ouvrant la vanne du tube relié au porte-électrode. Créez délicatement une pression négative dans la pipette en aspirant par le tube, ce qui favorise l’adhésion de la pipette à la membrane cellulaire. Fermez la vanne du tube pour maintenir la pression.
  10. Assurez-vous que la résistance de l’électrode affichée sur l’écran de l’ordinateur augmente jusqu’à 100 - 150 MΩ. Relâchez ensuite la pression négative dans la pipette en ouvrant manuellement la vanne du tube relié au porte-électrode.
  11. Assurez-vous que la résistance de l’électrode augmente jusqu’à au moins 1-2 GΩ.
    REMARQUE : À ce stade, un scellement a été formé entre l’électrode et le photorécepteur.
  12. Compensez les courants capacitifs de la pipette en ajustant le bouton approprié de l’amplificateur de patch-clamp.
  13. Appliquez rapidement, brièvement et avec force des aspirations négatives dans l’électrode, en aspirant par la bouche à travers le tube relié au porte-électrode, afin de « percer » la membrane du photorécepteur et d’obtenir une configuration en tout-cellule. En alternative, utilisez le bouton « Zap » pour appliquer de courtes impulsions électriques rectangulaires, en commençant par une durée de « 0,1 ms », ou combinez les deux méthodes.
    REMARQUE : L’obtention de la configuration en tout-cellule se manifeste par une augmentation soudaine de la capacité de la pipette (généralement ~60 pF pour un photorécepteur R1-6 de type sauvage ; une capacité d’environ ~20 pF indique un enregistrement sur un photorécepteur R7 ; une capacité supérieure à ~90 pF indique un enregistrement sur deux photorécepteurs).
  14. Réglez manuellement, à l’aide du bouton approprié de l’amplificateur de patch-clamp, le potentiel de maintien du photorécepteur à la tension requise (généralement -70 mV).
    REMARQUE : Il est possible d’effectuer cette étape après l’obtention du scellement (étape 6.11) et avant d’atteindre la configuration en tout-cellule.
  15. Compensez les courants capacitifs et la résistance en série (une valeur mesurée de résistance en série supérieure à 25 MΩ indique un bouchage de la pipette d’électrode) et, si nécessaire (i.e. pour des courants plus importants), appliquez une compensation de la résistance en série à l’aide des boutons appropriés de l’amplificateur de patch-clamp.
  16. Fermez le rideau avant noir de la cage de Faraday afin d’obtenir une obscurité maximale et une isolation électrique optimale.
  17. Commencez le processus d’enregistrement à l’aide du logiciel et appliquez des stimuli lumineux et/ou des substances pharmacologiques selon le protocole expérimental souhaité.

7. Enregistrements simultanés en configuration whole-cell et imagerie du Ca2+

  1. Pour les indicateurs génétiquement codés de Ca2+, isoler les ommatidies comme décrit ci-dessus en utilisant des mouches D. melanogaster exprimant GCaMP6f13. Utiliser une caméra CCD (voir la Table des Matériaux) pour la mesure de fluorescence et s'assurer que le microscope est équipé de filtres d'excitation et d'émission appropriés ainsi que d'un miroir dichroïque (voir la Table des Matériaux)4.
  2. Pour l'utilisation d'un indicateur exogène de Ca2+ (Figure 4 ; voir la Table des Matériaux), isoler les ommatidies comme décrit ci-dessus. En outre, s'assurer que la solution dans la pipette contient un indicateur de calcium à une concentration de 20-100 µM.
  3. Utiliser le logiciel d'imagerie (voir la Table des Matériaux) pour acquérir des images à une fréquence de 40 Hz. Réaliser l'acquisition d'images pendant une période d'obscurité de 10 s suivie d'une stimulation lumineuse intense de 2 s.
  4. Utiliser le logiciel d'imagerie et définir une région d'intérêt (ROI). Mesurer l'intensité de fluorescence dans la ROI. Faire la moyenne de la fluorescence en obscurité (FD) et la soustraire des enregistrements de fluorescence durant la stimulation lumineuse (FL) (FL-FD). Normaliser ces mesures par rapport à l'intensité de fluorescence au début de la stimulation lumineuse (FL0).

Résultats

La méthode décrite a permis l'enregistrement précis des courants unitaires fondamentaux qui génèrent les pics quantiques spontanés et induits par la lumière, lesquels s'additionnent pour produire la réponse macroscopique à la lumière, dans des conditions définies. Elle a également permis la comparaison entre des mouches de type sauvage et des mouches mutantes présentant des défauts dans des molécules de signalisation critiques (Figures 3 et 5)14,15,16,17,18. De plus, la possibilité de mesurer le potentiel de retournement dans des conditions bi-ioniques a révélé des propriétés biophysiques fondamentales des canaux TRP et TRP-like (TRPL)18,19. Elle a également permis de mesurer les effets de substitutions d'acides aminés dans la région du pore de TRP, qui modifient sa perméabilité au Ca2+20.

La réponse à la lumière obtenue par des enregistrements en configuration whole-cell en mode patch-clamp dépend linéairement de l'intensité lumineuse sur au moins quatre ordres de grandeur. Ceci n'aurait pu être mis en évidence à l'aide des méthodes d'enregistrement par ERG et par électrode intracellulaire. Ainsi, une série de réponses à des éclairs brefs d'intensité croissante, ainsi qu'un tracé de la fonction réponse-intensité, ont révélé une linéarité stricte de la réponse à l'éclair en fonction de l'intensité lumineuse croissante. Cette linéarité stricte est valable jusqu'à au moins plusieurs centaines de pA, mais il est discutable de savoir si, au-delà, c'est la linéarité ou le contrôle du clamp qui se détériore (Figure 6). Ces résultats suggèrent que les réponses macroscopiques à la lumière correspondent à une sommation linéaire des réponses unitaires à la lumière (i.e. les « quantum bumps »).

Il est bien établi, grâce à des enregistrements de tension, que la stimulation par une lumière faible induit des fluctuations discrètes de la tension (à savoir des « sursauts quantiques ») chez la plupart des espèces d'invertébrés. Chez D. melanogaster, les sursauts quantiques résultent de l'ouverture concertée d'environ 15 canaux TRP et d'environ 2 canaux TRPL au sommet du sursaut18. Chaque sursaut est généré par l'absorption d'un unique photon, tandis que la réponse macroscopique à des lumières plus intenses correspond à la sommation de ces réponses élémentaires14,21. Les sursauts varient considérablement en latence, en cinétique et en amplitude, même lorsque les conditions du stimulus sont identiques. La génération des sursauts est un processus stochastique décrit par des statistiques de Poisson, selon lequel chaque photon effectivement absorbé déclenche un seul sursaut. La relation « un photon – un sursaut » implique que chaque étape de la cascade comprenne non seulement un mécanisme d'activation efficace, mais aussi un mécanisme d'inactivation tout aussi efficace. L'avantage fonctionnel réside dans la production d'un compteur de photons très sensible, doté d'une réponse transitoire rapide, particulièrement adaptée à la fois à la sensibilité et à la résolution temporelle requises par le système visuel. La nécessité d'un mécanisme d'inactivation efficace apparaît lorsque le pigment photoactif actif (à savoir la métarhodopsine, M) ou sa cible, la Gqα, ne parvient pas à s'inactiver, entraînant une production continue de sursauts longtemps après l'extinction de la lumière (Figure 3)15,22,23,24.

La bosse représente l'activité coopérative des canaux TRP/TRPL dans un microvillosité. En tant que telle, toute hypothèse sur l'activation des canaux doit également expliquer l'activation coopérative des canaux. Récemment, Hardie et ses collègues ont démontré que la lumière provoque des contractions rapides des photorécepteurs, suggérant que les canaux sensibles à la lumière (TRP/TRPL) pourraient être activés mécaniquement25. Cette activation mécanique, conjuguée à la libération observée de protons par l'hydrolyse du PIP2 médiée par la PLC, favorise l'ouverture des canaux TRP/TRPL et explique la nature coopérative de la formation des bosses26. Actuellement, les photorécepteurs de D. melanogaster constituent l'un des rares systèmes dans lesquels la signalisation par les phosphoinositides et les canaux TRP peuvent être étudiées in vivo, ce qui fait des processus de phototransduction chez D. melanogaster et de la méthodologie développée pour étudier ce mécanisme un système modèle particulièrement précieux.

Diagrammes de réponse des photorécepteurs ; électrophysiologie, diverses mutations ; comparaison de l'activité synaptique.
Figure 3 : La protéine inaCP209 et inaDP215 Des mutants révèlent une terminaison lente de la réponse macroscopique à la lumière et des bosses quantiques uniques. (ALa préparation d'ommatidie isolée avec une micropipette de patch remplie du colorant fluorescent Lucifer Yellow CH (excitation : 430 nm ; émission : 540 nm) est présentée durant un enregistrement en configuration whole-cell. On observe que le colorant fluorescent s'est diffusé et a marqué le corps cellulaire d'un unique photorécepteur, les corps cellulaires des photorécepteurs étant détachés de leurs axones allongés mais conservant encore leur viabilité. Cette préparation convient aux expériences combinant simultanément des enregistrements en configuration whole-cell et de l'imagerie.B-D) Panneaux supérieurs : réponses des bosses quantiques enregistrées en configuration whole-cell en voltage clamp à une lumière faible continue (barre ouverte) chez les WT, inaCP209, et inaDP215 mouches mutantes. Une terminaison lente des bosses est observée dans inaCP209 et inaDP215 mutants par rapport aux mouches de type sauvage. L'encart ci-dessous montre la forme agrandie de bosses individuelles. Panneaux inférieurs : réponses macroscopiques normalisées enregistrées en configuration whole-cell en réponse à une impulsion lumineuse de 500 ms (1,5 x 105 photons par s) des mouches sauvages et mutantes ci-dessus. (E-G) Panneaux supérieurs : Réponses photoélectriques unitaires enregistrées en configuration whole-cell en voltage clamp, obtenues après une stimulation lumineuse brève (1 ms) et faible, induisant des réponses à un seul photon chez le type sauvage, arr23, et ninaCP235 mouches mutantes. Remarquez la série de bosses observées dans arr23 et ninaCP235 mouches mutantes en réponse à l'absorption d'un photon unique. Panneaux inférieurs : réponses normalisées en régime de blocage voltage en cellule entière à une impulsion lumineuse de 500 ms (1,5 x 104 photons/s) dans les mutants correspondants. Remarquer la terminaison lente des réponses macroscopiques observée dans arr23 et ninaCP235 mouches mutantes par rapport au type sauvage. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Microscopie à fluorescence résolue en temps entre WT et Cpn1% sous différentes durées de lumière ; analyse d'émission.
Figure 4 : La dynamique intracellulaire du Ca2+ suite à une entrée de Ca2+ induite par un signal est modifiée par la calphotine.  Séries temporelles d'images de photorécepteurs de mouches de type sauvage et Cpn1% montrant la fluorescence de l'indicateur de Ca2+ pendant la stimulation lumineuse. Les images d'intensité brutes sont représentées à l'aide d'un codage en fausses couleurs (barre = 10 µm ; les flèches indiquent la pipette). Figure reproduite avec autorisation de Weiss et al.4. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique d'électrophysiologie des courants enregistrés chez des mouches de type sauvage et mutantes trp ; protocole de palier de tension.
Figure 5 : Propriétés électrophysiologiques des mutants de type sauvage, trp et trpl. (A) Enregistrements en clampage de tension en configuration tout-cellulaire des bosses quantiques en réponse à une lumière faible continue (barre ouverte) chez des mouches de type sauvage, trpl302 et trpP343 (mutants nuls). Des amplitudes fortement réduites des bosses quantiques de trpP343 sont observées. Inset : Des bosses quantiques individuelles agrandies des mouches de type sauvage et du mutant nul trpP343 sont présentées. (B) Enregistrements en clampage de tension en configuration tout-cellulaire en réponse à une impulsion lumineuse de 3 s chez le type sauvage et les mutants correspondants. La réponse transitoire en régime permanent du mutant trpP343 est observée. Inset : Des réponses lumineuses agrandies du type sauvage et du mutant trpP343 sont présentées. (C) Une famille de courants induits par la lumière, superposés, des souches de mouches mentionnées ci-dessus, déclenchés en réponse à une impulsion lumineuse de 20 ms, à des paliers de tension de 3 mV, mesurés autour du potentiel de renversement (Erev). (D) Un histogramme représentant la moyenne de Erev du type sauvage et des différents mutants. Les barres d'erreur correspondent à l'erreur standard de la moyenne (S.E.M.). Le potentiel de renversement (Erev) du type sauvage se situe entre le Erev positif de trpl302, qui exprime uniquement TRP, et le Erev du mutant nul trpP343, qui exprime uniquement TRPL. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Graphique de la réponse aux photons montrant une sommation linéaire avec le courant en picoampères et le nombre de photons.
Figure 6 : La réponse à l'éclat lumineux est strictement linéaire avec l'intensité lumineuse croissante.
Série de réponses en courant à des éclairs lumineux brefs d'intensité croissante et représentation graphique de la dépendance de l'amplitude maximale de la réponse lumineuse par rapport à l'intensité croissante des éclairs lumineux brefs. Cette relation met en évidence une linéarité stricte entre la réponse à l'éclat lumineux et l'intensité lumineuse croissante. Cette linéarité stricte est valable jusqu'à au moins plusieurs centaines de pA, l'intensité lumineuse couvrant plus de quatre ordres de grandeur, bien qu'il soit discutable de savoir si c'est la linéarité ou le contrôle du clamp qui se dégrade au-delà. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

pH7,15 (ajuster avec NaOH)
RéactifConcentration (mM)
NaCl120
KCl5
MgCl24
TES10
Proline25
Alanine5
Conserver à -20 °C.
Remarque : Cette solution est nominalement Ca2+ gratuit mais ne contient pas de Ca2+ tampons ajoutés et auront donc environ 5 - 10 µM Ca en traces2+. Solution extracellulaire (ES) = ES-0Ca2+ avec 1,5 mM de CaCl2, préparé en ajoutant du CaCl2 à partir d'une solution mère de 0,5 ou 1 M vers ES-0Ca2+.

Tableau 1 : Solution extracellulaire (ES) sans Ca+2. Description chimique et quantités spécifiques nécessaires pour préparer une ES sans Ca+2.

RéactifQuantité
FBS15 mL
sucrose1,5 g
Répartir en aliquots de 150 µL dans des flacons de 1,5 mL et conserver à -20 °C.
Solution de trituration (TS)Remplir un flacon de 150 mL de la solution mère avec 1 350 mL de ES ou de ES-0Ca2+, afin d'obtenir une solution identique à celle utilisée pendant la dissection.

Tableau 2 : Soluté stock de sérum bovin fœtal (SBF) + saccharose. Description chimique et quantités spécifiques nécessaires pour préparer le soluté stock de sérum bovin fœtal (SBF) + saccharose.

pH7,15 (ajuster avec KOH)
RéactifConcentration (mM)
Gluconate de potassium (Kglu)140
MgCl22
TES10
Sel magnésique de l'ATP (MgATP)4
Sel sodique du GTP (Na2GTP)0,4
β-nicotinamide adénine dinucléotide hydraté (NAD)1
Conserver à -20 °C.

Tableau 3 : Solution intracellulaire (IS1). Description chimique et quantités spécifiques nécessaires pour préparer la solution IS1, utilisée principalement pour les mesures de réponse d'intensité et des quantums bumps.

pH7,15 (ajuster avec CsOH)
RéactifConcentration (mM)
CsCl120
MgCl22
TES10
Sel magnésique de l'ATP (MgATP)4
Sel sodique du GTP (Na2GTP)0,4
β-nicotinamide adénine dinucléotide hydraté (NAD)1
Chlorure de tétraéthylammonium (TAE)15
Conserver à -20 °C.

Tableau 4 : Solution intracellulaire (IS2). Description chimique et quantités spécifiques nécessaires pour préparer la solution intracellulaire IS2, utilisée principalement pour les mesures du potentiel de renversement du courant induit par la lumière.

Discussion

L’application d’enregistrements de cellules entières aux photorécepteurs de D. melanogaster a permis la découverte et l’élucidation fonctionnelle de nouvelles protéines de signalisation, telles que les canaux TRP27, 28, 29 et la protéine d’échafaudage INAD30, 31, 32. Depuis l’introduction initiale de cette technique, elle a permis de résoudre des questions fondamentales à long terme concernant le mécanisme ionique et la dépendance en tension de la réponse lumineuse. Cela s’est produit en raison de la capacité conférée de contrôler avec précision la tension membranaire et la composition ionique extracellulaire et intracellulaire19,28.

Un obstacle majeur de la technique de clampage par patch chez D. melanogaster a été la fragilité de la préparation isolée des ommatidies. Des études détaillées ont révélé que l’intégrité de la machinerie de phototransduction dépend de manière critique de l’apport continu d’ATP, en particulier lors de l’exposition à la lumière, ce qui entraîne une grande consommation d’ATP. Malheureusement, le striping mécanique des cellules pigmentaires (c’est-à-dire gliales), qui est nécessaire pour atteindre la membrane photoréceptrice avec la pipette patch, élimine la principale source de métabolites nécessaires à la production d’ATP33. L’application d’ATP exogène dans la pipette d’enregistrement ne satisfait que partiellement à l’exigence de grandes quantités d’ATP. Une pénurie d’ATP conduit à l’activation spontanée des canaux TRP et à la dissociation de la machinerie de phototransduction des canaux activés par la lumière, provoquant une forte augmentation du Ca2+ cellulaire et l’abolition de la réponse normale à la lumière34,35. Cette séquence d’événements n’est pas due à des dommages aux photorécepteurs par la procédure de dissection, mais plutôt à l’épuisement cellulaire de l’ATP. Pour éviter que cette séquence d’événements ne se produise et pour maintenir des réponses lumineuses normales, les photorécepteurs ne doivent pas être exposés à des lumières intenses, qui consomment de grandes quantités d’ATP. De plus, le NAD doit être inclus dans la pipette enregistreuse, probablement pour faciliter la production d’ATP dans les mitochondries18,36. Pour les mesures de bosses spontanées et quantiques, la difficulté ci-dessus est minime car seules des lumières tamisées sont utilisées. En pratique, un enregistrement stable de cellules entières peut être maintenu pendant ~20-25 min, bien qu’il y ait une tendance à ce que la cinétique de réponse ralentisse pendant cette période. Une seule préparation d’ommatidies dissociées peut rester viable jusqu’à 2 h.

Une autre lacune de la préparation d’ommatidies isolées est l’inaccessibilité des microvillosités, ce qui se traduit par l’inaccessibilité des canaux TRP et TRPL à la pipette enregistreuse, empêchant les enregistrements monocanaux. En utilisant une méthode qu’ils ont développée, Bacigalupo et ses collègues ont réussi à enregistrer directement l’activité d’un seul canal à partir du rhabdomere37. Cependant, cette activité du canal diffère de celle des canaux TRPL exprimés de manière hétérologue dans les cellules de culture tissulaire38 et de l’activité du canal TRP dérivée de l’analyse du bruit de tir obtenue à partir d’ommatidies isolées34. Vraisemblablement, la procédure de dissection a considérablement endommagé les cellules photoréceptrices lors de l’utilisation de cette méthode.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La partie expérimentale de cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation nationale des sciences US-Israël (à B.M. et I.L.), de la Fondation israélienne des sciences (ISF), de la Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (à B.M.), et du Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC Numéros de subvention : BB/M007006/1 et BB/D007585/1) à R.C.H.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
de 10 mL
Seringue
mL Seringue de 1 mL avec embout
Boîte de Pétri de60 mm
Filtres pour seringueMillex22 µ ; m Filtre PVDF  ;
Capillaires (pour la séparation des omatides)Verre, 1,2 x 0,68 mm (~7,5 cm chacun)
Tube en polyéthylèneBecton Dickinson1,57 x 1,14 mm (35 cm)
  ; 2 petits béchers50 mL ou moins
2 feuilles de film de paraffineParafilm M~5 x 5 cm
Chambre de bainfaite
Plaques de22 x 22 mm N° 0
Paraplast PlusSigmaMélange de paroftine et de polyisobutylènePour coller la lamelle sur le fond de la chambre de bain
BroyéWarner Instruments  ;64-1288Assemblage hybride Assemblage de fil Ag-AgCl Aiguille
micro dissection sans têteEntomologie, 12 mm
Porte-aiguille
Étau
2 pinces fines + 1 pince à épiler rugueuseDumont #5, Biologie  ;0,05 x 0,02 mm, longueur 110 mm, Inox
Microscope stéréoscopique à zoom  ;NikonSMZ-2B
Source de lumière froideSchottKL1500 Filtre LCD
(couleur) pour source de lumière froideSchottRG620
Essuie-glaces délicatsKimtechKimwipes
Porte-électrodeWarner InstrumentsQSW-T10Psérie Q Supports compatibles avec les amplificateurs Axon, corps droit style
fil d’argentWarner Instruments0,25 mm de diamètre, doit être chlorisé
MicromanipulateurSutter InstrumentsMP 85Micromanipulateur de style Huxley-Wall
Cage de FaradayfaitBlindage contre le bruit électromagnétique et rideau avant noir
Table anti-vibrationNewportVW-3036-OPT-01
OsilloscopeGWGOS-622G
Système de perfusionWarner InstrumentsVC-8PSystème de commande de soupape à manchon
Contrôleur de soupape de perfusionInstruments scientifiquesBPS-8
Système
AmplificateurDispositif moléculaireAxopatch-1D
Étage de têteDispositif moléculaireCV - 4Gain : x 1/100
A/D convertisseurDispositif moléculaireDigidata 1440A
ClampexDispositif moléculaire10logiciel
pCLAMPDispositif moléculaire10logiciel
Source lumineuse (lampe à arc au xénon)Sutter InstrumentsLambda LS
Détecteur de lumièrephototransistorfait
Contrôleur de roue à filtres et d’obturateurSutter InstrumentsLambda 10-2 avec obturateur
Filtres (filtre à densité naturelle)Chroma6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
Filtre (Couleur)SchottOG590, Filtre
Système de lampe flash au xénonDr. Rapp OptoElecftronicJML-C2
GuideQuartz  ;
Générateur d’impulsionsAMPIMaster 8
MicroscopeOlympusIX71, Filtre d’éclairage
(Microscope)RG630 / RG645 ø ; Objectif microscope 45mm
OlympusX60/0.9 UplanFL N air ou X60/1.25 UplanFI huile
Caméra CCDAndoriXon DU885K
NIS Element  ;Logiciel deréalité augmentée
Indicateur Ca+2InvitrogenVert calcium 5N
Filtres d’excitation et d’émission et miroir dichroïqueChroma19002 - AT - GFP/FITC Longpass set
Extracteur de pipette verticalNarishige  ;Modèle PP83Utilisez une extractrice verticale ou horizontale, selon vos préférences.
Extracteur de pipette horizontalSutter Instrument  ;Modèle P-1000 Tire-pipette flamboyant/brun
Seringue de 5allongémaison recouvrement dede micro dissection maison d’aspiration maisonUniblitzde bord de lumière rouge inversé Nikon Filament Sutter Instrument 3 mm en auge ou boîte carrée Capillaires Appareil de Harvard Capillaires en verre borosilicaté 1 x 0,58 mm

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Courants induits par la lumi recanaux TRPdissection de la r tinepipette de patchenregistrement lectrophysiologiqueisolation des ommatidiessolution extracellulaire sans calciumcolorant Lucifer Yellow

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