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Article de méthode

Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

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DOI :

10.3791/55628

⸱

9 juin 2017

 ,  , 
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Dans cet article

Résumé

Les neurones auditifs du tronc cérébral des oiseaux et des mammifères sont spécialisés pour l'encodage neuronal rapide, un processus fondamental pour les fonctions auditives normales. Ces neurones proviennent de précurseurs distincts du cerveau postérieur embryonnaire. Nous présentons des techniques utilisant l'électroporation pour exprimer des gènes dans le cerveau postérieur d'embryons de poulet pour étudier la fonction des gènes pendant le développement auditif.

Résumé

L'électroporation est une méthode qui introduit des gènes d'intérêt dans des organismes biologiquement importants comme l'embryon de poulet. Il est établi depuis longtemps que l'embryon de poulet est un modèle de recherche efficace pour l'étude des fonctions biologiques de base du développement du système auditif. Plus récemment, l'embryon de poulet est devenu particulièrement utile dans l'étude de l'expression des gènes, de la régulation et de la fonction associée à l'ouïe. L' électroporation in ovo peut être utilisée pour cibler les régions auditives du tronçon vertébral responsables de fonctions auditives hautement spécialisées. Ces régions comprennent le noyau de poulet magnocellularis (NM) et le noyau laminaris (NL). Les neurones NM et NL proviennent de précurseurs distincts des rhombomères 5 et 6 (R5 / R6). Ici, nous présentons dans l'ovo l' électroporation de gènes codés par un plasmide pour étudier les propriétés liées aux gènes dans ces régions. Nous montrons une méthode de contrôle spatial et temporel de l'expression des gènes qui favorise soit le gain, soit la perte de phénotypes fonctionnelsEs. En ciblant les régions de progéniteurs neuronaux auditifs associés à R5 / R6, nous montrons une transfection de plasmide dans NM et NL. La régulation temporelle de l'expression des gènes peut être réalisée en adoptant un système vectoriel tet-on. Il s'agit d'une procédure induite par un médicament qui exprime les gènes d'intérêt en présence de doxycycline (Dox). La technique d'électroporation in ovo - avec des analyses fonctionnelles biochimiques, pharmacologiques ou in vivo - offre une approche innovante pour étudier le développement des neurones auditifs et les phénomènes pathophysiologiques associés.

Introduction

Le codage neural rapide du son est essentiel pour les fonctions auditives normales. Ceux-ci comprennent les capacités de localisation du son 1 , la discographie dans la discrimination de bruit 2 et la compréhension d'autres signaux de communication pertinents au comportement 3 . Les neurones analogues situés dans le tronc cérébral auditif des oiseaux et des mammifères sont hautement spécialisés pour un codage neural rapide 4 . Ceux-ci incluent le noyau de poulet magnocellularis (NM), le noyau laminaris (NL) et leurs analogues de mammifères, le noyau cochléaire antéroventral (AVCN) et l'olive supérieure médiale (MSO), respectivement 5 . Cependant, les mécanismes de développement régulant le codage rapide des neurones sont mal compris dans le tronc cérébral auditif. Par conséquent, il est avantageux d'étudier des gènes spécifiques qui sont responsables de l'encodage neural rapide afin de mieux comprendre leur expression, leur régulation et leur fonction au seinDéveloppement de l'école.

L'embryon de poulet en développement est un outil de recherche efficace et bien établi pour étudier les questions biologiques fondamentales du développement du système auditif 6 , 7 . Des avancées moléculaires récentes ont abordé ces questions biologiques dans l'embryon de poulet en développement en exprimant ou en abaissant les gènes d'intérêt afin d'analyser la fonction de gène in vivo 8 , 9 . L'étude du rôle réglementaire des gènes spécifiques est un progrès important dans la compréhension des pathologies associées aux déficits auditifs. Ici, nous présentons dans l' électroporation ovo de gènes codés par plasmide dans le tronc cérébral auditif de poulet où un codage neural rapide du son se produit 10 . En ciblant les régions de progéniteurs neuronaux auditifs associés aux rhombomères 5 et 6 11 , 12 (R5 /R6), nous montrons un contrôle spatial de la transfection du plasmide dans NM et NL. En outre, nous montrons une régulation temporelle de l'expression en adoptant un système vectoriel tet-on. Il s'agit d'une procédure induite par un médicament qui exprime les gènes d'intérêt en présence de doxycycline (Dox) 8 .

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Northwestern et ont été réalisées conformément aux Lignes directrices nationales sur les soins de santé et à l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Manutention des œufs

  1. Achetez des œufs fécondés d'un fournisseur local. Conserver les œufs à 13 ° C dans un réfrigérateur pendant plus de 5 jours avant l'incubation. La viabilité des embryons diminue significativement après 1 semaine.
  2. Éponger chaque oeuf avec 70% d'éthanol avant de mettre dans l'incubateur.
  3. Réglez 1-2 douzaines d'oeufs sur leurs côtés dans un incubateur avec une température réglée à 38 ° C à ~ 50% d'humidité. Cela garantit un positionnement correct de l'embryon pour l'électroporation et une viabilité optimale, respectivement.
    REMARQUE: Après 48-52 h d'incubation, les oeufs seront au stade Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 et prêts à l'électroporation.

2. Préparation

  1. Plasmid MiXing
    1. Ajouter 1 μL de 0,1% de vert rapide (0,1% dans H 2 O désionisé 18 MΩ désionisé et distillé pour chaque 7 μl de mélange d'ADN.
    2. Pour la co-électroporation de plasmides multiples, mélanger les plasmides dans un rapport 1: 1. La concentration finale en ADN devrait être de 5 à 8 μg / μL.
  2. Pipette à injection de remplissage
    1. Tirez les pipettes sur un extracteur à micropipettes. Remplissez la pipette avec 1-2 μL de plasmides à l'aide d'une aiguille de seringue 28G.
    2. Faites passer la pointe de la pipette à 10 à 20 μm à l'aide d'une pince. Utilisez un microscope pour aider à déterminer la taille de la pointe de la pipette cassée. Fixez la pipette sur le porte-pipette du picospritzer.

3. Roulant

REMARQUE: la procédure de fenêtrage a été publiée avant 13 . Voir la référence 13 pour des informations visuelles supplémentaires.

  1. Essuyez tous les instruments et la zone de travail avec 70%L'éthanol.
  2. Prenez le nombre souhaité d'oeufs fixés hors de l'incubateur (entre 6-10), laissez-vous à température ambiante, et égouttez les oeufs avec 70% d'éthanol à nouveau. Les œufs restent viables pendant au moins 2 h après l'enlèvement de l'incubateur.
  3. Placez l'oeuf sur un illuminateur lumineux pour identifier le positionnement de l'embryon. Entourez le centre de la zone sombre ( c'est-à-dire l' embryon) avec un crayon.
  4. En utilisant une aiguille 19G, piquez un trou dans l'extrémité émoussée de l'œuf.
  5. Poussez un autre trou près du cercle dessiné sur le côté pointu de l'oeuf. Retirez un petit morceau de coquille d'oeuf extérieur (environ 16 mm 2 ) avec l'aiguille 19G, puis enlevez une petite partie de la coquille d'oeufs interne (environ 8 mm 2 ) avec une pince.
  6. Avec une seringue de 3 mL munie d'une aiguille 19G, retirez 1,5 à 2,5 ml d'albumine de l'oeuf à travers le trou à extrémités franches. Assurez-vous d'incliner l'aiguille à 45 °.
  7. Couvrez le trou à extrémités franches avec un petit morceau de ruban adhésif (1 cm x 1 cm). Couvrez le cercle tiré etD le deuxième trou avec un ruban adhésif (2,5 cm x 4 cm).
  8. Avec des ciseaux courbes (tranchant = 2,5 cm), couper une fenêtre dans le cercle. Les ciseaux doivent être parallèles à la coquille d'oeuf et le diamètre de la fenêtre doit être inférieur à 2 cm.

4. Injection de plasmide

  1. Allumez le picospritzer. Réglez la pression à 18 psi et la durée à 5 μs. Allumez le réservoir d'air et la lampe pour le microscope à dissection.
  2. Faire une solution stock de 30 ml d'une dilution 1:10 d'une encre indienne achetée en magasin mélangée à une solution salée stérile tamponnée au phosphate (PBS). Conserver à 4 ° C. L'injection d'encre indienne est une étape importante pour obtenir une meilleure visualisation de l'embryon de poulet.
    1. Remplissez une seringue de 1 ml avec la solution diluée d'encre indienne. Fixez une aiguille 27G et élevez toutes les bulles qui sont présentes dans la seringue.
    2. Insérez l'aiguille juste sous la membrane de jaune ~ 2 - 3 mm de l'embryon et injectez doucement 0,2 ml d'encre indienne sous l'embryon. FaireNe pas injecter plus de 0,5 ml de l'encre indienne, car cela pourrait diminuer la survie des embryons.
  3. Placez l'oeuf fenêtré sur un porte-oeufs sous le microscope à dissection. Utilisez le grossissement le plus élevé pour une meilleure visualisation du site d'injection de plasmide.
  4. À l'aide d'une pince, retirez la membrane sur la zone d'injection. Les régions d'intérêt auditives du tronc cérébral ( c.-à-d . NM et NL) proviennent de Rhombomeres 5 et 6 (R5 / R6). R5 / R6 sont situés à côté des otocystes (une structure embryonnaire chez les vertébrés qui se développent dans l'oreille interne) qui servent de repères pour les injections de plasmides R5 / R6.
  5. Abaissez la pipette remplie d'ADN dans le tube neural recouvrant la région R5 / R6 et entre les otocystes à l'aide du micromanipulateur. Un schéma de placement idéal est illustré à la figure 1A .
  6. Appliquer la pression d'air (18 psi, 5 μs de durée) du picospritzer pour éjecter l'ADN dans le tube neural.

5. Electroporation

  1. Allumez tLe stimulateur courant / tension.
  2. Remplissez une seringue de 3 mL avec du PBS et fixez le filtre à seringue. Ajouter 1-2 gouttes de PBS sur l'embryon.
  3. Abaisser l'électrode bipolaire à l'embryon en utilisant le micromanipulateur avec l'électrode négative au-dessus du site d'injection (médiale) et l'électrode positive latérale au R5 / R6 ( Figure 1A ). Évitez le contact direct avec l'embryon. Utilisez des électrodes bipolaires où le matériau de l'électrode est de l'iridium platine. Ajustez l'espacement entre les pointes à 0,5 mm avec une pince.
  4. En utilisant un stimulateur courant / tension, appuyez 20 fois à 50 V pendant 1 ms à intervalles de 1 s.
  5. Après l'électroporation, ajouter une goutte de PBS sur la zone exposée. Retirez doucement l'électrode et nettoyez-la avec un tissu de laboratoire et 70% d'éthanol. Fermez la fenêtre en exposant l'embryon avec du ruban adhésif.
  6. Étiqueter la coquille d'oeuf avec le type de plasmide injecté et la date d'éclosion.
  7. Placez les œufs dans l'incubateur avec le côté fenêtre vers le haut. Incuber à 38 ° C avec 50% D'humidité jusqu'à ce que le stade de développement souhaité soit atteint.
  8. Si un vecteur tet-on est électroporé pour le contrôle temporel de l'expression des gènes, appliquer Doxycycline (Dox) toutes les 24 h pour induire l'expression du gène (voir la Section 6).

6. Système Tet-on pour le contrôle temporel de l'expression génétique

  1. Utilisez les plasmides suivants:
    PCAGGS-T2TP: un plasmide exprimant la transposase.
    PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plasmide qui exprime de manière stable la protéine de liaison Dox.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: un plasmide qui contient une expression efficace du promoteur tet-on bidirectionnel (TRE) du journaliste EGFP et un second gène d'intérêt.
    NOTE: Les trois plasmides ci-dessus doivent être co-électroporés dans un rapport 1: 1: 1.
  2. Préparation de la solution stock:
    1. Dissoudre Dox dans du PBS stérile pour produire une solution mère de 1 mg / ml. Stocker à -20 ° C.
  3. Application Dox:
    1. Pour induire l'expressioN du gène d'intérêt pendant certaines étapes de développement, appliquer Dox toutes les 24 h.
    2. Lorsque vous appliquez Dox, prenez l'œuf, ouvrez la fenêtre, faites pipeter 50 μL de Dox sur la membrane chorioallointoïque, fermez la fenêtre et remettez l'oeuf dans l'incubateur.

7. Préparation de la zone de dissection pour les tranches de tronc cérébral

REMARQUE: Les sections suivantes (7 à 9) et les procédures ont été publiées avant 14 . Veuillez consulter ces références pour des informations visuelles supplémentaires.

  1. Préparez une solution d'agar (40 mg / ml d'agarose, soit 4% dans ddH 2 O). Versez la solution d'agar dans une boîte de Petri et laissez-la solidifier à température ambiante. Stocker la plaque de gélose couverte dans le réfrigérateur pour une utilisation ultérieure pendant le tranchage du tissu cervical.
  2. Fluide rachidien cérébral artificiel à bulles continues (ACSF) avec 95% d'O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,2-7,4 et osmolarité: 295-310 mOsm / L).
  3. Nettoyez la zone de travail et vibratome avec 70% d'EtOH et rincez la lame avec de l'eau distillée.
  4. Placez un tampon d'absorption de fluide propre sur la zone de travail avec des outils de dissection appropriés.
  5. Retirez la plaque de gélose du réfrigérateur, coupez un petit cube d'agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Collez le bloc d'agar jusqu'à la phase d'une chambre à vibration avec une superglue disponible dans le commerce.

8. Isolation du tronc cérébral auditif du poulet

  1. Ouvrez l'oeuf au site de la fenêtre écrite. Percez le sac de membrane avec un scalpel et retirez la tête de l'embryon de poulet.
  2. Décapiter le poulet avec des ciseaux tranchants.
  3. Placez la pointe de la lame de rasoir légèrement postérieure aux yeux. Incise à travers le crâne à la ligne médiane rostrale-caudale. Appliquer une légère pression en fonction de l'âge de l'embryon. Les embryons plus âgés nécessitent plus de pression.
  4. Retirez doucement la peau et les plumes pour exposer le crâne et vérifiez la coupe de la ligne médiane.
  5. Application sTrong pression, couper la partie rostrale du crâne avec une lame de rasoir. Placez immédiatement la lame postérieure aux yeux et coupez tout le crâne et le tissu cérébral.
  6. Effectuez des incisions médian-latérales avec des ciseaux dans la région caudale du crâne, légèrement antérieur aux muscles du cou des deux côtés de la tête. Exposez le cerveau et le cervelet en retirant le crâne et l'excès de tissu.
  7. Couper les tissus attachés au tronc cérébral avec des ciseaux et enlever le tronc cérébral, qui se détache librement du crâne.

9. Préparation des tranches de contre-cœur pour l'électrophysiologie ou l'imagerie In Vivo

  1. Enrouler le tronc cérébral à travers la technologie optique.
  2. Retirez le cervelet en coupant les pédicules avec des ciseaux, en exposant le plancher du quatrième ventricule.
  3. À l'aide de pincettes, enlever tout tissu membranaire et les vaisseaux sanguins de la surface du tronc cérébral.
  4. Pour bloquer le tronc cérébral, faites une coupe horizontale à l'extrémité plus rose du plancher des quatreVentricule, juste caudal au cortex. Faire des coupures latérales perpendiculaires à travers la technologie optique pour isoler le tronc cérébral.
  5. Placez une petite quantité de super-colle sur le stade vibratome directement devant le bloc d'agar.
  6. Soulevez le tronc cérébral à la moelle épinière à l'aide de pincettes et placez-le sur la super-colle avec le côté rostral vers le bas et le côté dorsal vers la lame vibratome. Retirer l'excès de colle avec un papier de laboratoire ou un papier filtre.
  7. Versez l'ACSF oxygéné dans le stade vibratome. Réglez la lame vibratome à un angle de 20 à 22 °. Démarrez vibratome à une oscillation à amplitude maximale. Déplacez la platine vers la lame afin que le haut du tissu soit parallèle à la lame.
  8. Déplacez rapidement la lame vers le tissu du tronc cérébral. Ralentissez considérablement la lame avant le contact de la lame avec les tissus.
  9. Tranchez les tissus avec la vitesse d'avancement la plus lente possible. Une fois que la lame est traversée dans toute la section du tissu coronal, retirez doucement la tranche à l'aide d'une pipette de transfert.
  10. Abaisser le stade 200-300 μm et découper à nouveau. Répétez jusqu'à ce que les points de repère anatomiques des noyaux auditifs deviennent visibles, par exemple, la région distincte de neuropil dorsale / ventrale de NL et l'emplacement médian de NM par rapport à NL.
  11. Gardez soigneusement les tranches dans ACFS. Cela peut être effectué à température ambiante (22 ° C) ou à proximité de conditions physiologiques (~ 41 ° C) à l'aide d'un bain d'eau chaude. Notez l'ordre de découpe. La première tranche correspond à la région la plus caudale du tissu et la dernière tranche correspond à la région la plus montante. Cela représente à peu près l'organisation tonotopique du tronc cérébral auditif, respectivement des régions codantes de faible à haute fréquence.

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Résultats

Nous montrons ici que, dans ovo, l' électroporation permet l'expression des gènes dans un système biologique normalement développé. Les gènes codés par un plasmide sont injectés de manière focalisée dans le tube neural recouvrant R5 / R6. Un exemple schématique des emplacements des électrodes et des pipettes par rapport aux marqueurs anatomiques importants est illustré à la figure 1A . L'emplacement correct de l'injection de plasmide est confirmé...

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Discussion

Dans ovo, l' électroporation est une méthode d'expression ou de suppression des gènes d'intérêt afin d'analyser la fonction de gène in vivo 8 , 9 . Dans l'embryon de poulet, il s'agit d'une méthode innovante pour exprimer des gènes encapsulés en plasmides dans différentes régions du tronçonnage auditif 8 . Pour assurer une expression optimale, plusieurs étapes critiques sont requises. Tout d&#...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous tenons à remercier les Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria et Mme Ximena Optiz-Araya pour une assistance initiale avec la mise en place du protocole et pour la fourniture de plasmides. Ce travail a été soutenu par la subvention NIY / NIDCD DC013841 (JTS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Œufs de poule leghorn blanc fécondésSunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
PicospritzerParker Hannifin052-0500-900Picospritzer III, stimulateur de courant/tension à un ou deux canaux
Grass TechnologiesSD9SD9 Aiguilles
seringue MicrofilWorld Precision InstrumentsMF28G67-5Calibre 28, 67 mm de long, (paquet de 5)
Porte-électrodeWarner Instruments64-1280MP Series : Non-Electrical Pressure Applications
Microélectrodestimulante FHCPBSA1075PBSA1075
Réservoir d’air/régulateurNU Laboratory ServicesAir dry 300 CF
Fast greenSigma AldrichF7258-25GF7258-25G
Ruban en plastique transparentScotch191
Doxycycline hyclateSigma AldrichD9891-1G
Réfrigérateur à oeufsVissani Cave à13.3 - 16.1 ° ; C (56-61° ; F)
IncubateurHova-Bator38 ° ; C (100 ° ; F), ~50 % d’humidité
Lunette de dissectionZeiss4.35E+15SteREO Discovery, Microscope V8, 50.4X
Source de lumière froideZeiss4.36E+15CL6000
MicromanipulateursNarishige JaponModèle : MM-32 Micromanipulateurs
Tubes capillairesSutter InstrumentBF150-86-10Borosilicate à paroi épaisse (dimensions)
Seringues1 mL, 3 mL
AiguillesBD Precision Glide  ;27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
PinceStoeltingNo. 5 Super Fine Dumont
Egg Holdersur mesurefonctionne aussi bien Extracteur
micropipetteSutter InstrumentModel P-97
Filtre à seringueUltra Cruzsc-358811PVDF 0.22 &mu ; L
de vin LED La base en argile de

Références

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Réimpressions et autorisations

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