Article de méthode

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained Tribolium castaneum embryons

DOI :

10.3791/55629

⸱

28 avril 2017

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1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Dans cet article

Résumé

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L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum est devenu un important organisme modèle d'insectes en génétique du développement et de la biologie évolutive du développement. L'observation des embryons Tribolium par microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière présente de multiples avantages par rapport à grand champ classique et la microscopie par fluorescence confocale. En raison des propriétés uniques d'un microscope à base de feuille de lumière, images en trois dimensions de spécimens vivants peuvent être enregistrés avec des taux élevés de signal sur bruit et considérablement réduit photo-blanchiment, ainsi que la photo-toxicité ainsi que de multiples directions sur des périodes qui durent plusieurs journées. Avec plus de quatre années de développement méthodologique et une augmentation continue des données, le temps semble approprié d'établir des procédures normalisées d'exploitation pour l'utilisation de la technologie de feuille de lumière dans la communauté Tribolium, ainsi que dans la communauté des insectes en général. Ce protocole décrit trois techniques de fixation appropriées fou des buts différents, présente deux nouveaux faits sur mesure lignes Tribolium transgéniques approprié pour l' imagerie en temps réel à long terme, suggère cinq colorants fluorescents pour étiqueter les structures intracellulaires d'embryons fixe et fournit des informations sur le post-traitement de données pour l'évaluation en temps opportun des données enregistrées. Les résultats représentatifs se concentrent sur l'imagerie en temps réel à long terme, le sectionnement optique et l'observation de l'embryon même le long de multiples directions. Les ensembles de données respectifs sont fournis en tant que ressource téléchargeable. Enfin, le protocole discute des contrôles de qualité pour les tests d'imagerie en direct, les limites actuelles et l'applicabilité des procédures décrites à d'autres espèces d'insectes.

Ce protocole est principalement destiné aux biologistes du développement qui cherchent des solutions d'imagerie qui surclassent matériel de laboratoire standard. Elle favorise la tentative continue de combler l'écart entre les laboratoires de type technique / communautés, qui se développent et affinent micro-ordinateurscopier méthodologiquement, et les laboratoires de sciences de la vie / communautés, qui exigent des solutions « plug-and-play » aux défis techniques. En outre, il soutient une approche axiomatique qui déplace les questions biologiques dans le centre d'attention.

Introduction

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Le tribolium rouge Tribolium castaneum, qui appartient à la grande famille des ténébrions (Tenebrionidae), a une longue histoire dans les sciences agricoles et de la vie et est le deuxième meilleur étudié organisme modèle d'insecte modèle après la mouche Drosophila melanogaster. Au cours des quatre dernières décennies, il est devenu un organisme modèle d'insecte puissant et populaire en génétique du développement, en biologie du développement et de l'évolution, au cours des vingt dernières années, dans la morphogenèse embryonnaire pour diverses raisons:

Drosophile et Tribolium appartiennent tous deux à la Holometabola, mais il y a divergé environ 300 millions d' années 1, 2, 3, 4. Alors que le développement embryonnaire de la drosophile est généralement considérée comme hautement dérivée, Tribolium montre un mode plus ancestral develpement qui se trouve dans une proportion beaucoup plus importante d'espèces d' insectes 5, 6, 7, 8, 9. Tout d' abord, Tribolium présente le développement de tête non involution, à savoir ses pièces buccales et des antennes apparaissent déjà pendant l' embryogenèse 10, 11, 12, 13, 14, 15. En second lieu , Tribolium suit les principes de développement à court germe, à savoir les segments abdominaux sont ajoutés séquentiellement à partir d' une zone de croissance postérieure au cours de l' élongation de germband 16, 17, 18, 19. Troisièmement, Tribolium se développe et plus tard se dégradedeux membranes extra-embryonnaires à savoir l'amnios, qui couvre seulement l'embryon ventralement et la séreuse, qui enveloppe complètement l'embryon 20, 21, 22. Les deux membranes jouent un morphogénétique essentiel 23 ainsi que le rôle de protection contre les micro - organismes 24, 25 et 26 dessication. En quatrième lieu , les jambes en développement sont pleinement fonctionnelles embryonnairement au cours de la phase de la vie larvaire et servent de primordia pour les jambes des adultes pendant la métamorphose des chrysalides 27, 28, 29, 30, 31.

En raison de leur petite taille et modestes exigences, la culture de Tribolium dans le laboratoire est assez simple. Les cultures de type sauvage (WT) des souches ou des lignées transgéniques se composent typiquement d'environ 100 à 300 adultes et peut être maintenue dans des bouteilles en verre d' un litre (empreinte 80 cm 2) remplie de trois à quatre centimètres (environ 50 g) avec un milieu de croissance qui se compose de blé pleine fleur la farine complétée par la levure sèche inactive. Un approvisionnement en eau n'est pas nécessaire. Cela permet même de petits laboratoires de garder des dizaines de cultures de coléoptère dans les petites ou moyennes pépinières d'insectes disponibles dans le commerce. Stades de développement ultérieurs de Tribolium (larves après environ le quatrième stade, les nymphes et les adultes) sont facilement séparées du milieu de croissance par tamisage. embryons synchronisés sont obtenus en incubant les adultes pour une courte période sur un milieu de ponte. Pour un développement rapide, les cultures de dendroctones sont maintenus à 32 ° C (environ quatre semaines par génération), tout en maintenant des actions est généralement réalisée à 22-25 ° C (environ dix semaines par génération).

Dans la dernière décennie, de nombreux tec standardsLes techniques ont été progressivement adaptées et optimisées pour Tribolium , résumées dans les livres des Organismes Emergents 32 . Les méthodes génétiques avancées, telles que les cellules embryonnaires 33 , les larves 34 , 35 ou les générations parentales 36 , 37 , les anomalies à l'ARN, la transformation de la ligne germinale avec le système PiggyBac 38 , 39 ou Minos 40 transposase et le génome CRISPR / Cas9 Ingénierie 41 . En outre, le génome de Tribolium a été séquencé il y a environ une décennie 42 , et est maintenant dans la troisième version de l' assemblage du génome 43 , qui permet une identification efficace et génomique et une analyse systématique des gènes 44 ou d' autres éléments génétiques 45, 46. De plus, les génomes de quatre autres espèces de Coléoptères sont disponibles pour les approches génétiques comparatives 47, 48, 49, 50. En association avec le génome séquencé, deux analyses génétiques à grande échelle ont été réalisées, à savoir un écran de mutagenèse insertionnelle 51 et un écran knockdown de gène à base d' interférence d'ARN systématique 52, 53.

Imagerie en temps réel de la fluorescence avec grand champ, ou la microscopie confocale à base de feuille de lumière (LSFM) permet d'observer la morphologie embryonnaire de Tribolium en fonction du temps ( par exemple la morphogenèse) dans un contexte multi-dimensionnelle (Tableau 1). En microscopie Widefield et fluorescence confocale, la EXCITation et de la lumière d'émission est guidé par la même lentille d'objectif. Dans les deux approches, l'échantillon entier est éclairé pour chaque enregistrement plan en deux dimensions. Par conséquent, les échantillons sont soumis à des niveaux d'énergie très élevés. Dans LSFM, seuls les fluorophores dans le plan focal sont excités en raison d'un découplage de l' éclairage et la détection à l'aide de deux lentilles d' objectif disposées perpendiculairement (figure 1). LSFM est disponible en deux implémentations canoniques - le microscope d'éclairage seul plan (SPIM) et le microscope de fluorescence à base de feuille de lumière laser balayé numérique (DSLM, Figure 2) - et offre plusieurs avantages essentiels par rapport aux approches traditionnelles: (i) la capacité de sectionnement optique intrinsèque, (ii) une bonne résolution axiale, (iii) a fortement réduit le niveau de photo-blanchiment, (iv) une très faible photo-toxicité, (v) rapport signal-bruit, (vi) la vitesse d'acquisition relativement élevée, (vii) imagerie le long de multiples directions et (viii) la pénétration des tissus plus profonds en raison de l'utilisation de lentilles d' objectif d'illumination faible ouverture numérique 54, 55, 56.

LSFM a déjà été appliquée avec succès dans Tribolium pour documenter presque toute la morphogenèse embryonnaire 57 et d'analyser les principes de la rupture de la membrane extra-embryonnaire au début de la fermeture dorsale 23. Pour augmenter l'attractivité de LSFM dans la communauté Tribolium et pour la science des insectes en général, il est d' une grande importance d'établir des procédures normalisées d'exploitation et d'améliorer les méthodes, les protocoles et le bassin de ressources à un niveau où le microscope devient une facilité de -utiliser outil standard dans les laboratoires de biologie du développement, et les questions biologiques restent au centre de l'attention.

Ce protocole commence par les bases de Tribolium </ em> la culture, à savoir l' entretien, la reproduction et la collecte d'embryons. Ensuite, deux stratégies expérimentales sont illustrées: (i) de formation d'image en direct de lignées transgéniques sur mesure et (ii) l' imagerie d'embryons fixes qui ont été colorées avec des colorants fluorescents (tableau 2). Par la suite, trois techniques de montage avec des fins légèrement différentes sont expliqués en détail (figure 3 et tableau 3): (i) la colonne d' agarose, (ii) l'hémisphère agarose et (iii) le nouveau support de toile d' araignée. Le protocole explique ensuite la procédure d'acquisition de données avec LSFM. modalités d'imagerie et considérations clés sont décrites. Enfin, la recherche sur l'embryon est expliqué et suggestions pour le traitement des données de base sont fournis. Dans les résultats représentatifs, les données d'imagerie en direct de deux nouveaux faits sur mesure et les lignées transgéniques Glie bleu 58 sont représentés et les ensembles de données d'imagerie respectifs sont fournis en tant que ressource téléchargeable. De plus, l'imagedonnées d'embryons fixes qui ont été colorés avec une variété de colorants de fluorescence sont présentés. La discussion porte sur le contrôle de la qualité, les limites actuelles de l'approche d'imagerie en direct et l'adaptation du protocole à d'autres espèces.

Le protocole est écrit pour microscopes à fluorescence à base de feuilles de lumière qui sont équipés d'une chambre d'échantillon et un mécanisme de serrage pouvant tourner pour les détenteurs normalisés d'échantillons 54, 59, 60, qui sont typiquement des éléments en forme de cylindre en métal, en plastique ou en verre ayant un diamètre dans l'ordre du millimètre. Le protocole est également approprié pour les deux implémentations canoniques, soit SPIM et DSLM, ainsi que pour une configuration avec deux ou plusieurs bras d'illumination et de détection 61, 62, 63. Les résultats représentatifs montrent les données dans deux canaux spectraux, vert (illumination avec un laser de 488 nm, la détection à travers un filtre passe-bande 525/50) et rouge (illumination avec un laser 561 nm, détection à travers un filtre passe-bande 607/70), mais le protocole peut être étendu à trois ou quatre canaux spectraux.

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Protocole

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1. Élevage des cultures Tribolium

REMARQUE: Les conditions standard sont définies comme une température d'incubation de 25 ° C et 70% d'humidité relative dans un 12 h / 12 h lumineux de cycle sombre. Pour plus d' informations sur l' élevage Tribolium, les lignes directrices respectives sont disponibles 64. Ce protocole nécessite deux supports à base de farine différentes, qui peuvent être préparées en quantités de kilogramme et stockées pendant plusieurs mois.

  1. Avant de travailler avec de la farine et la levure sèche inactive, stocker les paquets non ouverts à -20 ° C pendant 24 h, puis laissez-les réchauffer à la température ambiante. Cette procédure élimine les agents pathogènes potentiels.
  2. Passer la farine complète de blé de grain et inactive levure sèche à travers un tamis avec une taille de maille de 710 pm, puis préparer un milieu de croissance en complétant la farine de grain entière tamisée avec 5% (p / p) de levure sèche inactive tamisée.
  3. Passer 405 farine de blé et la levure sèche inactive à travers un tamis de 250 & #181; m taille de maille, puis préparer le milieu de ponte en complétant la tamisé 405 farine de blé avec 5% (p / p) de levure sèche inactive tamisée.
  4. Passez la culture Tribolium respective par un tamis avec 800 pm de taille de maille. Jeter le milieu de croissance restant. Transfert des larves, pupes et adultes dans un grand plat en verre.
  5. Si aucune culture de la descendance existe, transférer environ 80 larves et / ou pupes à une nouvelle bouteille en verre pour établir une nouvelle culture de la descendance. Si aucune larves et / ou chrysalides sont présents, prendre environ 40 adultes à la place. Ajouter 50 g de milieu de croissance et laisser incuber dans des conditions normales.
  6. Recueillir environ 300 adultes (500-700 mg) dans un nouveau flacon de verre pour établir la culture de formation d'image. Ajouter 50 g de milieu de croissance et laisser incuber dans des conditions normales. Permettre à la culture de formation d'image à régler pendant au moins 24 h dans le milieu de croissance frais avant le prélèvement de l'embryon.
  7. Remplacez le milieu de croissance de la culture d'imagerie au moins tous les deux nousEKS, qui peut être fait conjointement avec la collecte d'embryons (voir 3.2). Après deux à trois mois, remplacer la culture d'imagerie complètement par les nouveaux adultes de la culture de la descendance.
  8. Si une lignée transgénique non homozygote est utilisé, souvent les cultures curate de descendance en supprimant les animaux non transgéniques. Idéalement, générer des lignes homozygotes si le transgène respectif n'est pas mortelle ou provoque la stérilité quand elle est présente sur les deux chromosomes. cultures homozygotes ont généralement un niveau de fluorescence moyenne plus élevée et les conditions expérimentales globales sont plus étroites, car un seul génotype est présent.

2. Configuration de microscope et d'étalonnage

NOTE: L'embryon Tribolium a une longueur antérieure-postérieure de l' ordre de 600 à 660 um et un diamètre transversal d'environ 300-330 um. La plupart des caméras CCD modernes ont une taille de puce de capteur d'environ 9 mm x 7 mm, soit un diamètre de 11,4 um, et d' une distance de pixels de pixels de 6,45 um.Lorsqu'il est combiné avec une lentille d' objectif de grossissement 10X, l'embryon peut être imagé in toto avec un pas de pixel de 0,645 um. La plupart des appareils de sCMOS modernes ont une taille de puce de capteur plus grand d'environ 16 mm x 14 mm, soit un diamètre de 21,3 um, et d' une distance de pixels de pixels de 6,5 um. Lorsqu'il est combiné avec une lentille d' objectif de grossissement 20X, l'embryon peut être imagé in toto avec un pas de pixel de 0,325 um.

  1. Fixer les lentilles d'éclairage et objectifs de détection au microscope. Assurez-vous que les lasers et les filtres de fluorescence correspondent à l'absorption des fluorophores et des spectres d'émission très bien.
  2. Attacher la chambre d'échantillon au microscope. Remplir la chambre d'échantillon avec du PBS pH 7,4 ou tout autre tampon d'imagerie approprié.
  3. Allumer et calibrer le microscope. routines d'étalonnage complète et les directives de dépannage pour microscopes à base de feuilles de lumière sur mesure (plus particulièrement pour la mise en œuvre de DSLM) ont été publiés pr65 ans . Pour les appareils commerciaux, suivez attentivement les instructions du fabricant. Une mauvaise manipulation pourrait épuiser l'échantillon de la chambre du milieu et provoquer des ravages sur l'instrument ainsi que sur l'échantillon.

3. Collection d'embryons transgéniques ou WT

  1. Passez la colonie d'imagerie à travers un tamis avec une maille de 800 μm. Recueillir des coléoptères adultes dans une nouvelle bouteille en verre et ajouter 10 g de milieu de ponte. Incuber la culture de ponte d'oeufs pendant 1 h à 25 ° C et 70% d'humidité relative dans la lumière.
  2. Passez la culture d'oeufs à travers un tamis avec un maillage de 800 μm pour séparer les adultes du milieu de ponte, qui contient environ 30 à 100 embryons. Transférer les adultes dans une nouvelle bouteille en verre et ajouter soit l'ancien soit 50 g de milieu de croissance frais.
  3. Si l'observation commence à l'étape blastoderme uniforme (exemple de base de données DS0002), incuber le milieu de ponte pour 15 h à 25 ° C et 70% d'humidité relative. To commencer au début de la rétraction germband (par exemple des jeux de données de DS0001 et DS0003), incuber les embryons pendant 23 h à 32 ° C et 70% d'humidité relative. Si d' autres stades de développement sont souhaitées, se référer à la littérature respective 64, 65 et d' adapter le temps d'incubation et / ou la température selon les besoins.

4. Embryon dechorionation

NOTE: Le chorion est la couche externe de la coquille et est composée de protéines et de polysaccharides. Il est fortement absorbant la lumière, mais pas indispensable pour le bon développement et peut donc être éliminée chimiquement.

  1. Passer le moyen de ponte à travers un tamis d'ouverture de maille de 300 pm. Recueillir les embryons dans un tamis cellulaire avec une taille de maille de 100 um et jeter le moyen de ponte restant.
  2. Préparer une plaque à 6 puits de la manière suivante: remplir le A1, A2, A3 et B3 puits avec du PBS pH 7,4 10 ml et les puits B1 et B2 avec 9 ml de PBS. Ensuite, ajoutez soigneusement1 ml d'hypochlorite de sodium à B1 et B2. Observez les progrès des étapes 4.3 à 4.8 au microscope stéréo. ATTENTION hypochlorite de sodium est corrosif.
  3. Insérez le filtre cellulaire dans l'A1 et (PBS pH 7,4) et laver les embryons pendant une minute sous agitation douce. De plus grandes particules de farine devraient détacher des embryons.
  4. Transférer le tamis cellulaire au puits B1 (hypochlorite de sodium dans du PBS pH 7,4) et agiter vigoureusement la plaque pendant 30 s. Les particules de farine restantes devraient se détacher complètement des embryons.
  5. Transférer le tamis cellulaire à A2 puits (PBS pH 7,4) et laver les embryons pendant 1 min sous agitation douce.
  6. Pour dechorionation, transférer le tamis cellulaire au puits B2 (hypochlorite de sodium dans du PBS pH 7,4). Agiter la plaque vigoureusement jusqu'à ce que les ruptures de chorion et se détache des embryons. Le chorion ressemble à une fine membrane semi-transparente avec des bords lacérés, tandis que les embryons dechorionated ont une silhouette simple.
  7. transfert epassoire e cellulaire au A3 puits (PBS pH 7,4) et laver les embryons pendant 1 min sous agitation douce. Si des fragments de chorion sont encore attachés aux embryons après le lavage, répétez l'étape 4.6.
  8. Conserver les embryons dans le puits B3 (pH 7,4 PBS). Stockage pendant plusieurs heures ne nuit pas aux embryons, mais gardez à l'esprit que le développement se poursuit.
  9. Pour les lignées transgéniques non homozygotes, éliminer les embryons non fluorescents si possible. Pour la fixation et la coloration des embryons transgéniques ou WT, passez à l'étape 5. Pour l'imagerie en direct d'embryons transgéniques, passez à l'étape 6.

5. Vitelline perméabilisation de la membrane, la fixation et Staining

NOTE: La membrane vitelline est la couche interne de la coquille d'oeuf. Il est imperméable à des colorants fluorescents et doit donc être chimiquement perméabilisées avant la coloration.

  1. Remplir un flacon de scintillation avec fixation / solution de perméabilisation (1,5 ml de 4% (p / v) de paraformaldehyde dans du PBS pH 6,9 unend n-heptane 1,5 ml). Transfert des embryons avec un pinceau aux flacons. des flacons de couvrir de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière et incuber pendant 30 minutes sur un agitateur oscillant, à 50 tours par minute. ATTENTION paraformaldehyde est toxique et corrosif, le n-heptane est inflammable et toxique.
  2. Éliminer la solution de fixation et de traiter les embryons trois fois pendant 15 minutes dans 3 ml de 0,1% (v / v) de Triton X-100 dans du PBS pH 7,4, puis une fois pendant 15 minutes dans 3 ml de 1% (v / v) de Triton X-100 dans PBS pH 7,4 sur un agitateur oscillant, à 50 tours par minute. ATTENTION Triton X-100 est corrosif.
  3. Enlever la solution de perméabilisation et ajouter la solution de coloration de 0,5 ml dans le flacon. Des exemples de solutions de coloration sont fournies dans le tableau 2. embryons de taches pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur oscillant, à 50 tours par minute. Pour les colorants proposés dans le tableau 2, le lavage n'est pas nécessaire.

6. Préparation de montage Agarose

  1. Ajouter 1 g faible point de fusionagarose à pH 7,4 100 ml de PBS et on chauffe le mélange pendant 2-3 min dans un four à micro-ondes à 800 W. Si de petites particules d'agarose sont encore présentes, répéter le processus de chauffage en intervalles de 30 secondes jusqu'à ce que les particules se dissolvent complètement. L'agarose de montage n'a pas besoin d'être fraîchement préparé chaque fois, peut être re-liquéfier l'agarose solidifiée par chauffage comme décrit ci-dessus. Ce processus peut être répété 5-6 fois avant de trop d'eau se soit évaporée.
  2. Laisser l'agarose à refroidir à environ 40 à 45 ° C, puis remplir deux tubes de réaction de 1,5 ml avec de l'agarose chauffée et maintenir les tubes à 35 ° C dans un thermobloc.

7. Embryon de montage et l'insertion dans la chambre d'échantillon

  1. Option 1: colonne d' agarose (figure 3A à C, première colonne, le tableau 3, deuxième colonne)
    1. Remplir une seringue 1,0 ml d'eau distillée et l'attacher à l'une des ouvertures capillaires en verre à l'aide d'un petit tuyau en caoutchouc.Remplissez le capillaire à mi-chemin avec de l'eau distillée.
    2. Choisir un embryon avec un pinceau et le placer sur le côté intérieur de l'autre ouverture capillaire en verre. Procéder rapidement à l'étape suivante avant que l'embryon se dessèche.
    3. Coller le capillaire dans l'agarose liquide et tirer lentement quelques ul d'agarose liquide le long de l'embryon dans le capillaire. Puis rapidement augmenter la force de traction de telle sorte que l'embryon est traîné en même temps que l'agarose. En fin de compte, quelques ul d'agarose doit être au-dessus et au-dessous de l'embryon. Réglez le capillaire de côté pendant quelques minutes et laisser l'agarose se solidifie.
    4. Raccourcir le capillaire avec un dispositif de coupe de verre de diamant à une longueur d'environ 5 mm. Le fragment restant doit être complètement rempli avec de l'agarose et l'embryon doit être comprise dans le deuxième quartile.
    5. Insérez le cylindre en acier avec la goupille dans la chambre d'échantillon, puis coller le fragment capillaire au-dessus de la broche. La colonne d'agarose doit dépasser quelques millimètres fROM Le fragment capillaire avec la partie qui contient l'embryon.
  2. Option 2: hémisphère Agarose (figure 3A à C, deuxième colonne, le tableau 3, troisième colonne)
    1. Tracer 200 ul d'agarose liquide dans une seringue de 1,0 ml, puis l'utiliser pour remplir le tube d'acier à partir du dessus avec de l'agarose jusqu'à formation d'un hémisphère à l'ouverture de fond. Le diamètre de l'hémisphère doit être égal au diamètre du tuyau. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que l'agarose solidifiée.
    2. Choisir un embryon avec un pinceau et réarranger à l'extrémité de la brosse de telle sorte que l'extrémité antérieure devient accessible. Tremper l'hémisphère agarose en agarose liquide à recouvrir d'un film mince.
    3. Placez l'embryon avec son extrémité antérieure droite sur le poteau de l'hémisphère agarose. Tourner le tube d'acier autour et corriger la position de l'embryon avec la brosse. Si nécessaire, stabiliser l'embryon en ajoutant 2 ul d'agarose à la frontière embryon / hémisphère. Idéally, à moins de la moitié de la surface de l'embryon doit être recouverte d'agarose et les flancs doit être aussi raide que possible.
    4. Insérer le tube d'acier à l'hémisphère et de l'embryon lentement dans la chambre d'échantillon.
  3. Option 3: Cobweb support (figure 3A à C, troisième colonne, le tableau 3, quatrième colonne)
    1. Choisissez un embryon avec un pinceau et le mettre de côté.
    2. Couvrir le trou oblong du support de toile d'araignée avec de l'agarose liquide 5-8 ul, puis éliminer la majeure partie de l'agarose jusqu'à ce que seule une couche mince d'agarose reste.
    3. Placer l'embryon sur le film d'agarose et d'ajuster sa position. Déplacez doucement l'embryon au centre x axe du trou à fente, et aligner son axe allongé antéro-postérieur à l'axe longitudinal du trou fendu.
    4. Insérez le support de toile d'araignée avec l'embryon monté lentement dans la chambre d'échantillon. Placez le support de toile d'araignée afin qu'il ne gêne pas l'excitation et d'émissionla lumière, à savoir 45 ° par rapport à l'axe des x et l' axe z.

8. Microscopie Fluorescence base Fiche-Light

  1. Décider combien de directions le long (et le long duquel des orientations) l'embryon doit être imagé. Quatre directions (le long des orientations 0 °, 90 °, 180 ° et 270 °) fournissent généralement un bon compromis entre la couverture et la charge énergétique.
  2. Mettre en place le nombre de canaux de fluorescence. Les principaux paramètres pour chaque canal sont la ligne de laser, le filtre de fluorescence, la puissance du laser et le temps d'exposition. Pour l'imagerie en direct à long terme, il est important que la charge énergétique intégrée ne dépasse pas la tolérance de l'embryon. Un temps d'exposition de 25 à 50 ms assure imagerie rapide, tandis qu'une puissance laser comprise entre 100 et 300 uW ne devrait pas affecter la viabilité de l'embryon. Pour les échantillons fixes, le temps d'exposition et la puissance du laser peut être au moins doublé.
  3. Pour les tests d'imagerie en direct, configurer le laps de temps. le compLete embryogenèse de Tribolium prend environ sept jours à température ambiante (23 ± 1 ° C) et un peu moins de trois jours à 32-35 ° C 64. Définir l'intervalle temporel en fonction des événements morphogénétiques qui doivent être observées. Pour les courts intervalles de temps, envisager d'abaisser le temps d'exposition et la puissance du laser (voir 8.2).
  4. Positionner l'embryon en mode de transmission de lumière le long de la x et y axes dans le centre du champ de vision sans l'exposer au laser. Faire pivoter l'embryon de 360 ​​° à 90 ° pour examiner l'embryon de tout dommage qui pourrait avoir eu lieu au cours du processus de montage.
  5. Faire pivoter l'embryon de manière appropriée autour de l'axe Y afin d' aligner les axes embryonnaires avec les axes microscope, par exemple l'axe latéral de l'axe des x, à savoir l'axe dorso - ventral avec l'axe z. Lorsque vous utilisez la technique du porte-toile d'araignée, l'alignement pourrait ne pas être possible.
  6. Dans le mode de fluorescence, définir le z-stack for chaque direction. Ajouter 25-50 um comme tampon spatial devant et derrière l'embryon. Y compris la mémoire tampon, le z-stack typique couvre environ 350 à 400 pm pour un embryon Tribolium. Définir également le z-espacement, qui doit être quatre fois l'espacement latéral, à savoir la distance le long de l'axe des x et des y des axes 66.
  7. Si deux ou plusieurs embryons sont imagés en parallèle, redémarrez à 8.4 avec l'embryon suivant.
  8. Pour l'imagerie à long terme, en sorte que la chambre d'échantillon est rempli avec du PBS pH 7,4 suffisant ou un autre tampon d'imagerie. couvrir également l'ouverture de la chambre d'échantillon.
  9. Démarrez le processus d'imagerie. Pour l'imagerie en direct à long terme, surveiller l'acquisition correcte ainsi que toutes les directions dans tous les canaux pour tous les embryons. vérifier de temps en temps au cours des prochains jours que les embryons sont vivants et dans la position appropriée.

9. Embryon et contrôle de la qualité de récupération

  1. Une fois l'imagerie terminée, retirez le porte-échantillon avecles embryons à partir de la chambre d'échantillon. Seuls les embryons provenant de tests d'imagerie en direct doivent être récupérées. embryons fixes et colorés peuvent être mis au rebut.
  2. Si un essai de formation d'image en temps réel a été effectuée, le transfert de l'embryon à un porte-objet. Pour la technique de la colonne d'agarose, extrait les embryons à partir du périphérique d'agarose avec un scalpel, micro-couteau ou d'une lame de rasoir. Pour la technique de l'hémisphère agarose, transfert de l'hémisphère avec le côté plat de la lame d'objet. l'enlèvement de Embryo n'est pas nécessaire. Pour la technique de support de toile d'araignée, descendre doucement les embryons à partir du film d'agarose avec un pinceau. Incuber la lame d'objet dans un petit plat en verre dans une atmosphère saturée d'humidité dans des conditions normales jusqu'à ce que l'éclosion des larves.
  3. Après l'éclosion, les larves transférer à des puits individuels d'une plaque à 24 puits et ajouter 500 mg de milieu de croissance dans chaque puits. Incuber dans des conditions normales. Comparez le temps total de développement et de la morphologie des larves imagé à WT non imagé et larv transgéniqueae (voir la discussion). Dans des essais qui caractérisent le développement du WT, pas des aberrations morphologiques évidentes devraient idéalement être perceptible.
  4. Une fois que les larves se développent à des adultes en bonne santé, leur fournir des partenaires appropriés WT de la même souche de fond. Au bout de deux semaines, vérifier la production de la descendance. Voir également vérifier la fertilité de la descendance en les accouplant inter pares. Seulement lorsque les embryons imagées se transforment en adultes fertiles qui produisent une descendance fertile, la procédure d'imagerie peut être considérée comme non-invasive.

10. Traitement de l'image de données

REMARQUE: Pour le traitement des données d'image, le logiciel de traitement d'image open source ImageJ 67 ou son dérivé FIDJI 68 sont recommandées. Les deux versions ainsi que la documentation complète se trouvent à www.imagej.net. Le format de fichier standard pour les données LSFM est le format de fichier image étiquetée (TIFF). L'option conteneur intrinsèque permet storage des piles d'images telles que des piles z ou série temporelle de projections maximales z dans un fichier unique qui peut être ouvert dans ImageJ ou FIJI par glisser-déposer.

  1. Si nécessaire, faites pivoter les piles z pour aligner l'axe antéro-postérieur de l'embryon avec l'axe des y (image → Transformer → Rotation). S'il vous plaît noter que les paramètres de rotation doivent être réglés individuellement pour chaque direction, mais pas pour le laps de temps et les canaux de fluorescence.
  2. Recadrer les piles z le long de la direction x, y et z axes de sorte que seul fond minimal (20 - 40 pixels le long des axes x et y, les axes 5 - 10 plans le long de l'axe z) reste (pour x - et y-axes, en utilisant l'outil de sélection rectangulaire, puis l'image → Crop, pour l'axe z, on utilise l'image → Piles → Outils → Slice garde). S'il vous plaît noter que les paramètres de culture doivent être réglés individuellement pour chaque direction, mais pas pour les points de temps et les canaux de fluorescence.
  3. Calculer la projection z maximale pour chaque z-stack(Image → → Z Stacks Projet, choisissez l'intensité maximum). des calculs de projection d'intensité sont des procédures de simplification des données qui éliminent une dimension spatiale.
  4. Pour les données d'imagerie en direct à long terme, envisager d' utiliser un ImageJ ou d'un script FIDJI qui effectue les étapes de traitement 10.1 à 10.3 pour toutes les directions, tous les points de temps et tous les canaux de fluorescence 65. Idéalement, concaténer les projections maximales z par canal et de la direction et les enregistrer sous forme d'une série temporelle dans un récipient TIFF. En variante, le plug-in BigDataViewer 69 pour FIJI peut être utilisé pour naviguer à travers des jeux de données téraoctets-large.
  5. Selon les modalités de ligne transgéniques et d'imagerie, des ajustements d'intensité dynamique des piles de temps pourraient être souhaitables en raison de photo-blanchiment et / ou les fluctuations d'expression de fluorophores. Soit la ImageJ- ou la fonction FIDJI intrinsèque Correction de blanchiment (image → Ajuster → Correction de l'eau de Javel, choisissez Concordance Histogramme) ou dedicalogiciel ted 65 sont proposées.
  6. Si l'embryon a été enregistré et / ou le long de plusieurs directions et dans plusieurs canaux de fluorescence, combinaison horizontale des directions (image → Stacks → Outils → Combiner) et fusion de canal (image → couleur Fusionner → canaux) sont recommandés.
  7. L' inscription et la fusion des piles z acquises le long de plusieurs directions 70, éventuellement en combinaison avec déconvolution 71, permet le calcul des images de qualité supérieure en trois dimensions d' une qualité uniforme et une résolution isotrope. Les deux plug-ins sont ouverts source et pré-installé en FIJI, mais ils nécessitent la présence de points de repère (microsphères fluorescentes, par exemple des billes) autour de l'échantillon.
  8. Cadres de logiciels open-source pour l' extraction de données quantitatives à grande échelle et d' analyse sont également disponibles, par exemple pour la segmentation et le suivi des noyaux cellulaires 72 ou cell reconnaissance de forme 73.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un cadre expérimental pour l' imagerie de fluorescence de la vie ou fixées et colorées avec des embryons Tribolium LSFM. En raison des faibles niveaux de photo-blanchiment et photo-toxicité, une conséquence directe de sa capacité de sectionnement optique, LSFM est particulièrement bien adapté pour l'imagerie en direct à long terme.

Le nouveau AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 lignée transgénique exprima...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contrôle de qualité

Dans des essais de formation d'image en direct, la préparation et la procédure d' enregistrement doit être non invasive, à savoir ni la mécanique et la manipulation chimique (collecte, dechorionation, le montage sur le porte-échantillon) , ni la charge énergétique intégrée pendant l'observation devrait affecter la viabilité de l'échantillon. Pour les études qui caractérisent le développement WT, il est recommandé de ne utiliser de...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Contributions Auteur

FS et EHKS conçu la recherche. FS généré les lignes de AGOC transgéniques. imagerie de fluorescence à base de feuille de lumière a été effectuée par FS et SK. FS et EHKS écrit le manuscrit avec la participation de SK.

Remerciements

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Nous remercions Sven Plath pour le support technique. La lignée transgénique glie bleu était un cadeau genre de Gregor Bucher (Göttingen, Allemagne). La recherche a été financée par le Pôle d'excellence Frankfurt am Main complexes macromoléculaires (CEF-MC, EXC 115, Président Volker Dötsch) accordé en partie à EHKS à l'Institut Buchmann for Life Sciences moléculaires (BMLS, directeur Enrico Schleiff) au Goethe Universität Frankfurt am Main par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
farine de blé completDemeter e.V.1.13E+08US : farine de blé entier, Royaume-Uni : farine complète
405 farine de blé finDemeter e.V.1.13E+08US : farine pâtissière, Royaume-Uni : farine molle
levure sèche inactiveFlystuff / Genesee Scientific62-106
Saine tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010-023
hypochlorite de sodium, ~12 % actif ClSigma Aldrich425044-250MLAttention : l’hypochlorite de sodium est une agarose corrosive
à bas point de fusionCarl Roth6351.2
Plaque 6 puitsOrange Scientific4430500
Plaque 24 puitsOrange Scientific4430300
capillaires en verre, internes & Oslash ; 0,46 mmMarque GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020La préparation de la solution de coloration est expliquée dans le tableau 2
YOYO-1 IodureThermo Fisher ScientificY3601La préparation de la solution de coloration est expliquée dans le tableau 2
BOBO-3 IodureThermo Fisher ScientificB3586La préparation de la solution de coloration est expliquée dans le tableau 2
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379La préparation de la solution de coloration est expliquée dans le tableau 2
Alexa Fluor 546 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22283La préparation de la solution de coloration est expliquée dans le tableau 2
tamis, 800 & micro ; m mailleVWR International200.025.222-051
tamis, 710 µ ; maille mVWR International200.025.222-050pour la préparation du milieu de croissance (étape 1.1)
tamis, 300 & micro ; m maille VWRInternational200.025.222-040
tamis, 250 & micro ; m mailleVWR International200.025.222-038pour la préparation du milieu de ponte (étape 1.2)
plat en verre, Ø ; 100 mm × ; 20 mmSigma AldrichCLS70165102
passoire à cellules, 100 µ ; m mailleBD Biosciences352360
pinceau, tête & Oslash ; seringueVWR International149-2121
, 1,0 mLB. Braun Medical AG9166017V
flacons à scintillationSigma AldrichM1152-1000EA
paraformaldéhyde (PFA)Sigma Aldrich158127Attention : le paraformaldéhyde est toxique et corrosif
n-heptane &GE ; 99 %Carl Roth8654.1Attention : le n-heptane est inflammable et toxique
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLAttention : Trition X-100 est corrosif
de 2 mm

Références

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