Article de méthode

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l'ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d'échantillons biologiques

7K vues

⸱

DOI :

10.3791/55634

⸱

10 mai 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les méthodes permettant la caractérisation et l'isolement des populations de cellules souches à partir d'échantillons biologiques sont essentielles pour l'avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.

Résumé

Le cancer est une maladie à base de cellules souches et l'éradication de ces cellules est devenue un objectif thérapeutique majeur. La déchiffrement des vulnérabilités des cellules souches cancéreuses (CSC) et l'identification de cibles moléculaires appropriées reposent sur des méthodes permettant leur discrimination spécifique dans des échantillons hétérogènes tels que les lignées cellulaires et le tissu tumoral ex vivo . La cytométrie de flux / FACS est une technologie puissante pour disséquer de manière paramétrique des échantillons biologiques au niveau de la cellule unique et date de la méthode de choix pour récupérer les cellules vivantes pour les analyses en aval. Les marqueurs de surface tels que CD44 et CD133 ainsi que la détection de l'activité enzymatique de l'aldéhyde déshydrogénase ont souvent été utilisés pour définir et trier les CSC à partir d'échantillons de tumeurs par FACS. Une approche complémentaire, illustrée ici en détail méthodologique, utilise l'extrusion fonctionnelle de colorant par les transporteurs de médicaments ABC, qui identifie une population distincte de cellules fluorescentes-dim communément appelées population latérale (SP). SP; Les cellules cancéreuses présentent des caractéristiques canoniques de cellules souches et peuvent être abrogées et confirmées fonctionnellement en utilisant des agents qui inhibent le transporteur de médicament extrudant de colorant (le plus souvent ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338). En outre, le test SP est compatible avec d'autres évaluations cytométriques en flux telles que la coloration des antigènes de surface, la détection des aldéhydes déshydrogénases et la discrimination des cellules mortes ( p. Ex . Avec 7-AAD ou iodure de propidium (PI)). Ainsi, nous décrivons une méthode valable et largement applicable pour l'identification, l'isolement et la sous-caractérisation CSC mécaniquement basée sur un paramètre fonctionnel, plutôt que phénotypique. Bien que, initialement, exécuté avec Hoechst 33342 en tant que colorant déclencheur, nous nous concentrons ici sur le phénotype SP Violet à base de colorant plus récent qui résolue sur tout cytomètre de flux équipé d'une source laser violette.

Introduction

L'efficacité des thérapies primaires contre le cancer s'est considérablement améliorée au cours de la dernière décennie en raison de progrès convaincants dans la compréhension génétique et moléculaire de la maladie et l'avènement de médicaments ciblés tels que les anticorps thérapeutiques et les inhibiteurs de petites molécules. En revanche, la maladie métastatique et récurrente est encore généralement incurable et la morbidité et la mortalité restent élevées dans ces milieux cliniques. Les CSC représentent une sous-population distincte dans les tumeurs et sont dotés de propriétés canoniques de cellules souches telles que la clonogénicité / tumorigénicité, la résistance aux médicaments multiples et la division cellulaire asymétrique 1 , 2 . Ainsi, les CSC non seulement entraînent une progression métastatique et une hétérogénéité des tumeurs, mais persistent également pendant le traitement pour prédisposer le patient à la rechute. L'élimination thérapeutique du SCC est donc un besoin médical important pour prévenir la récidive de la maladie et permettre un traitement à long terme du cancer 3 .

L'identification des vulnérabilités et l'élucidation des stratégies pour éradiquer les CSC dépend fortement des méthodes qui permettent leur purification à partir d'échantillons biologiques pour le profilage d'expression et / ou l'investigation fonctionnelle subséquente. À leur tour, de telles méthodes reposent sur des marqueurs de surface, intracellulaires ou fonctionnels spécifiques à ces cellules. Les marqueurs de surface spécifiques au CSC incluent, mais sans s'y limiter, CD44, CD133, CD24 et CD90, et ont été utilisés pour identifier les populations de CSC dans une variété d'entités tumorales, y compris le cancer du sein et le cancer du côlon 4 . Un autre marqueur, l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH), montre une localisation intracellulaire et peut être détecté fonctionnellement en fournissant un substrat respectif dont la conversion enzymatique produit de la lumière. En utilisant ce test, les populations du SCC ont également été identifiées dans diverses entités tumorales 5 . Une méthode complémentaire, communément appelée analyse SP et représentée ici en m Détail éthodologique, exploite l'efflux de colorant actif par les transporteurs de médicaments ABC pour identifier de petites populations de cellules fluorescentes de type tige faible 6 , 7 , 8 . Pour ce faire, un échantillon donné est incubé en présence d'un fluorophore lipophile qui lient de l'ADN qui pénètre dans toutes les cellules par diffusion passive et cible l'ADN nucléaire et mitochondrial pour la liaison. Les CSC non-dépourvus d'expression du transporteur de drogue ABC accumulent le colorant, ce qui entraîne une fluorescence brillante, tandis que les CSC extrudent activement le colorant qui réduit la fluorescence. L'inhibition pharmacologique de l'activité du transporteur de médicament abroge et confirme fonctionnellement le phénotype SP et doit être utilisée à des fins de contrôle. Les populations du CSC présentant des caractéristiques SP ont été révélées, entre autres, dans le cancer de l'ovaire 9 , 10 , le cancer de la prostate 11 ,> 12, cancer du sein 13 , cancer du poumon 14 , cancer de l'endomètre 15 , gliome 16 , 17 et sarcome de l'os 18 . Il est important de noter que le dosage SP est compatible avec les lignées cellulaires cancéreuses et les tissus tumoraux primaires, même si le matériau primaire pose des défis supplémentaires tels que l'exigence d'une stratégie spécifique de discrimination de cellules tumorales (certaines populations de cellules hôtes peuvent également présenter des caractéristiques de SP) 19 , 20 .

Les deux transporteurs de médicaments les plus reconnus sont les ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Cependant, d'autres transporteurs de médicaments peuvent également être un déterminant moléculaire du phénotype SP ( p. Ex . ABCB5) 22 . ABCB1Peut être bloqué efficacement avec le verapamil, alors que l'activité de l'ABCG2 peut être abrogée spécifiquement avec la fumétémorgin C (FTC) 6 , 19 . Une force particulière de l'analyse SP est qu'elle peut être combinée avec d'autres taches ( p. Ex. , Marqueurs de surface et ALDH) et qu'elle permet une récupération de cellules vivantes ainsi compatible avec les recherches fonctionnelles en aval. De plus, la détection de SP est largement applicable en raison de la grande conservation des transporteurs de médicaments ABC parmi les populations du SCC 9,23.

À l'origine, la détection de SP a été effectuée en utilisant le Hoechst 33342 comme colorant de déclenchement 24 . Ce colorant atteint une excellente résolution mais nécessite une excitation laser ultraviolet; De sorte que son applicabilité est naturellement limitée aux instruments cytométriques de flux haut de gamme. L'avènement de DyeCycle Violet (DCV) 25 a ouvert une nouvelle avenueEs pour l'analyse SP et a étendu l'applicabilité de cette méthode aux instruments cytométriques à flux standard dépourvus d'une source laser ultraviolette (une source laser violette suffit pour résoudre les cellules DCV-SP). Fait important, Hoechst 33342 et DCV partagent des spécificités communes de la pompe, indiquant que l'un ou l'autre colorant devrait identifier les mêmes populations de cellules.

Ici, nous fournissons un protocole expérimental détaillé de l'analyse SP à base de DCV pour une reproduction rapide et facile dans les laboratoires indépendants. Nous percevons donc notre article comme une ressource pour les chercheurs du SCC qui devrait contribuer à l'optimisation et à la normalisation de cette méthode biologique cellulaire utile.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Ce protocole est en pleine conformité avec les lignes directrices de la Commission d'examen éthique institutionnel. Si les tissus humains ou animaux sont étudiés en utilisant le protocole décrit ici, les chercheurs sont obligés d'obtenir l'approbation du comité d'examen pertinent de leur établissement ou de leur pays.

Attention: Les précautions standard pour la manipulation sécuritaire des échantillons biologiques s'appliquent à ce protocole. Cela comprend le port de gants et une blouse de laboratoire, et l'exécution du travail dans un coffret de sécurité biologique dans la mesure du possible.

1. Préparation des cellules

  1. Lignes cellulaires cancéreuses
    1. Culturez une lignée cellulaire cancéreuse humaine ou murine respective à 37 ° C dans 10 à 30 ml de milieu approprié ( p. Ex. , RPMI 1640 additionné de 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine) et de récolte Les cellules à la sous-confluence ( c.-à-d. 70-90%) en utilisant une digestion avec 0,05% de trypsine-EDTA ou un autre de-attProcédure d'entraide. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et une coloration au bleu trypan. La fraction de cellules viables devrait dépasser 85%.
      NOTE: Des exemples de lignées cellulaires cancéreuses humaines hébergeant des compartiments SP incluent MCF7 / HTB-22 et SKBR3 / HTB-30 (cancer du sein), A2780 et SKOV-3 / HTB-77 (cancer des ovaires) et A549 (cancer du poumon) 26 .
  2. Tumeur tumorale ex vivo
    1. Prenez un nouvel échantillon de tumeur chirurgicale ou, en variante, récoltez un tissu tumoral à partir d'un modèle de tumeur de souris transplantable ou génétiquement modifiée. Prendre 200-1 000 mg de tissu et générer une seule suspension de cellules par désagrégation mécanique ( p. Ex. , En utilisant des ciseaux ou un scalpel) et une digestion enzymatique ( par exemple , en utilisant un cocktail de collagénase / dispase / DNase).
    2. Filtrer l'échantillon à travers un filtre de coupe de 70 μm. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et trypan blUe coloration.
      NOTE: Les cocktails de digestion contiennent fréquemment 200 μg / mL de colagénase P, 0,8 U / mL de dispase et 25 μg / mL de DNase I, et les temps d'incubation varient habituellement de 20 à 50 min. Idéalement, la désagrégation des tissus est réalisée selon un protocole optimisé pour le tissu sous enquête 27 , 28 , 29 .

2. Échantillons de test

  1. Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 cellules / mL dans un milieu de culture frais (un véhicule contenant des nutriments est important car l'extrusion de colorant est un processus actif consommant de l'énergie). Enfin, transférez 1 mL d'échantillon dans un tube à fond rond de cytométrie à flux ordinaire / FACS (étiqueté «test»).
    REMARQUE: Pour des résultats optimaux, il peut être nécessaire que la concentration cellulaire soit titrée (par exemple, 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 cellules / mL), mais une concentration cellulaire inférieureCède une résolution plus élevée 19 . Seulement pour le tri des applications où un nombre maximum de cellules SP doit être récupéré, il est recommandé d'augmenter la concentration de cellules jusqu'à 1 x 10 7 cellules / mL.
  2. Ajouter 10 μM de DCV à l'échantillon et bien mélanger, soit par vortex ou rembourrage doux pendant 3-5x. Procéder aux contrôles d'inhibition.
    NOTE: Les résultats optimaux peuvent dépendre du titrage du colorant déclencheur (par exemple 2.5; 5; 10; 20 μM), mais une concentration de colorant plus élevée donne généralement une résolution plus élevée 19 .

3. Contrôle de l'inhibition

  1. Transférer 250 μL de la suspension de cellules contenant du colorant vers une nouvelle cytométrie de flux / tube à fond rond FACS (appelé «contrôle»). Ajouter 50 μM de verapamil ou 20 μM de FTC et bien mélanger par pipettage.
    REMARQUE: le Verapamil et le FTC sont les inhibiteurs les mieux établis pour l'analyse SP mais ont une spécificité de pompe à effluent différenteY: le Verapamil inhibe plusieurs transporteurs de médicaments ABC dont ABCB1 et ABCB5, alors que le FTC est spécifique à ABCG2 6 , 19 . Si l'état SP d'un échantillon individuel est inconnu, il est donc recommandé d'utiliser à la fois le verapamil et le FTC dans des tubes séparés.

4. Coloration

  1. Capuchons les tubes "test" et "contrôle" et les incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 90 min, avec une agitation douce toutes les 15 min. La majeure partie de l'extrusion de colorant dans les cellules SP se produira dans les premières 45 minutes, mais l'accumulation de colorant dans les cellules non SP (contribuant à la résolution) n'est que maximale après 75-90 min 19 .
  2. Une fois la coloration terminée, laver les cellules dans 3-4 mL de PBS glacé et ré-endiguer la pastille dans un volume de 100 μL (PBS). Gardez les cellules dans l'obscurité et refroidissez sur de la glace, et procéder à la coloration des marqueurs supplémentaires. Alternativement, effectuez directement des analyses cytténiques de fluxLyse.

5. Coûts pour d'autres marqueurs

  1. Ajouter un panel désiré d'anticorps conjugués au fluorochrome aux cellules colorées au DCV, bien mélanger et incuber les cellules à 4 ° C dans l'obscurité pendant 20 à 30 minutes. Lavez les cellules dans 3 à 4 ml de PBS glacé et passez à la discrimination des cellules mortes.
    REMARQUE: les formats d'anticorps qui sont facilement compatibles avec DCV et pratiquement ne nécessitent pas de compensation incluent PerCP ou PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 et BV786 . Les formats compatibles avec DCV mais nécessitant une compensation incluent FITC, Alexa Fluor 488, PE et BV650. Les formats qui ne sont pratiquement pas compatibles avec DCV incluent BV421, V450 et V500.
  2. Ajouter 7-AAD (ou PI) aux cellules colorées au DCV à la concentration recommandée par le fabricant en particulier et incuber les échantillons pendant 5 à 10 minutes dans l'obscurité. Filtrer les échantillons à travers des filtres de coupure de 70 μm et procéder à une analyse cytométrique en flux.

6. Analyse cytométrique de flux

REMARQUE: Il est recommandé d'allumer l'instrument de cytométrie de flux respectif pendant le processus de coloration déjà afin que tout soit réglé dès que les échantillons sont prêts. Cela inclut également les procédures de maintenance standard telles que le suivi des performances du système et le remplissage des citernes.

  1. Acquérir les cellules sur le cytomètre de flux et les placer sur un diagramme de points FSC / SSC bivarié (Figure 1B). Excluez les doublets et les agrégats en comparant les différents signaux de FSC ( c.-à-d. Hauteur, largeur, zone) (figure 1C).
    1. Si un marqueur de cellule morte a été inclus, portez sur la fraction de cellule viable ( par exemple , 7-AAD-négatif) ( Figure 1D ). Visualisez les cellules singulet viables sur un diagramme de points bivarié pour les émissions de DCV «bleu» et «rouge». À cette fin, affichez le canal de fluorescence "bleu" sur l'axe des y ( par exemple , 450/50) et le 'Canal de fluorescence rouge 'sur l'axe des abscisses ( p . Ex. 525/50).
    2. Commutez les deux canaux en mode linéaire et ajustez les tensions du détecteur de manière correspondante afin que le SP se situe sur le côté de l'intrigue dans le quadrant inférieur gauche. À l'inverse, le non-SP localise le quadrant supérieur droit de la parcelle reflétant la distribution du cycle cellulaire (G1 et G2). Garez le SP et arrêtez l'acquisition ( Figure 1E ).
      REMARQUE: les cellules SP définies par DCV peuvent être détectées à l'aide d'instruments cytométriques en flux équipés d'une source d'excitation laser violette ( c'est-à-dire d' une ligne laser 405 nm). Il s'agit d'une analyse spécifique de SP que la fluorescence émise est mesurée en mode linéaire et dans deux canaux séparés affichés sur un diagramme de points bivarié. L'émission "bleu" de DCV est mesurée à environ 450 nm ( par exemple , avec un filtre standard 450/40) et l'émission "rouge" de DCV est mesurée à environ 510-555 nm ( par exemple , avec un 510/50, a 525/50 ou un filtre 585/15) 19 . En raison de la chimie particulière du dosage, la séparation entre les cellules SP et non SP est généralement plus élevée dans le canal de fluorescence "rouge" 19 .
  2. Chargez le (s) contrôle (s) d'inhibition et obtenez les données. Les cellules SP ont maintenant disparu ou sont considérablement réduites ( figure 1F ). Si nécessaire, affiner la porte SP en fonction de ces données.
  3. Pour étudier l'expression du marqueur de surface par les cellules SP, laisser la fluorescence "rouge" de DCV sur l'axe des abscisses et afficher un canal de fluorescence respectif sur l'axe des y en mode logarithmique ( p. Ex . APC). Régler les tensions du détecteur de manière correspondante et laisser tomber la fraction de cellules SP positif pour le (s) marqueur (s) étudié (s) ( Figure 1G ). La co-expression d'un marqueur particulier par des cellules SP donne un signal respectif dans le quadrant supérieur gauche de l'intrigue 30 .
  4. Enregistrez leDes données et / ou trier les cellules SP.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L'invention concerne une analyse SP représentative des cellules A2780, une lignée cellulaire de cancer de l'ovaire humaine précédemment présentée pour abriter un SP représentant moins de 1% des cellules 9 . Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine et récolté à 85% de confluence en utilisant un traitement avec 0,05% de trypsine-EDTA. Les ce...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les progrès dans la gestion clinique du cancer dépendent également du développement de modalités de traitement ciblant les CSC. Les méthodes permettant l'isolement fiable des CSC à partir d'échantillons biologiques accéléreront l'identification des cibles appropriées et sont donc d'une importance cruciale dans cette entreprise. L'analyse SP est une technique établie et précieuse pour identifier les populations du SCC qui expriment les transporteurs de médicaments ABC et la mise en œuvre de DCV a éten...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer. Il n'y a pas non plus d'implication non-auteur dans la préparation du manuscrit.

Remerciements

Maximilian Boesch est soutenu par une bourse Erwin Schrödinger du FWF FTSA (numéro de délivrance J-3807).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vybrant DyeCycle VioletThermo Fisher ScientificV35003Prêt à l’emploi
Chlorhydrate de vérapamilSigma-AldrichV4629Dissous dans l’éthanol
Fumitremorgine CSigma-AldrichF9054Dissous dans le DMSO
7-AAD (ou iodure de propidium - PI)BioLegend420403Prêt à l’emploi
Réactifs de culture cellulaire standard ( par exemple , milieu, FBS, L-glutamine, antibiotiques, PBS, trypsine-EDTA, etc.)Différentsfournisseurs
Échantillon/cellules d’intérêt (par exemple , lignée cellulaire cancéreuse humaine ou murine, tissu tumoral humain ou murin)Différentsfournisseurs
Instrument de cytométrie en flux (FACS ; analyseur ou trieur de cellules)Différents fournisseursSource laser violette requise
Tubes FACS (à fond rond)Différents fournisseursTubes avec capuchon recommandés
70 & micro ; Filtres de coupureFournisseurs différents Facultatifmais recommandé
Mélange d’enzymes de digestion ( par exemple , collagénase/dispase/Dnase)Différents fournisseursUniquement pertinent pour la dissociation tissulaire
Anticorps conjugués au flurochrome contre les marqueurs de surface d’intérêtDifférents fournisseurs
ALDEFLUORTechnologies STEMCELL01700En option
Kit en option

Références

  1. Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
  2. Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
  3. Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
  4. Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
  5. Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
  6. Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
  7. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  8. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  9. Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
  11. Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
  12. Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
  13. Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
  14. Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
  15. Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
  16. Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
  17. Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
  18. Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
  19. Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389(2016).
  20. Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
  21. Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
  22. Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
  23. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  24. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  25. Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
  26. Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
  27. Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532(2015).
  28. Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633(2011).
  29. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088(2014).
  30. Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
  31. Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
  32. Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cytom trie en fluxextrusion de colorantstransporteurs ABCessai au colorant violetpurification cellulairemarqueurs de surfaceald hyde d shydrog naseprofilage de l expression g nique

Articles connexes