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Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l'aide de la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale

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DOI :

10.3791/55637

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21 juillet 2017

1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

Dans cet article

Résumé

Ici, la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d'autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Résumé

L'autophagie est une voie catabolique dans laquelle des composants cellulaires normaux ou dysfonctionnels qui s'accumulent pendant la croissance et la différenciation sont dégradés via le lysosome et sont recyclés. Au cours de l'autophagie, la protéine LC3 cytoplasmique est lipidée et recrutée sur les membranes autophagosomales. L'autophagosome se fusionne alors avec le lysosome pour former l'autolysosome, où se produit la décomposition de la vésicule autophagose et son contenu. La protéine associée à l'ubiquitine p62, qui se lie à LC3, est également utilisée pour surveiller le flux autophagique. Les cellules subissant une autophagie devraient démontrer la co-localisation des marqueurs p62, LC3 et lysosomaux. La microscopie contre l'immunofluorescence a été utilisée pour identifier visuellement les molécules LC3 puncta, p62 et / ou les lysosomes par cellule. Cependant, une évaluation objective et statistiquement rigoureuse peut être difficile à obtenir. Pour surmonter ces problèmes, une cytométrie de flux d'imagerie multispectrale a été utilisée avec une caractéristique analytique qui compare le brillant deImages de queue de trois marqueurs d'autophagie (LC3, p62 et LAMP lysosomale) et quantifie leur co-localisation, en combinaison avec le comptage de points LC3 pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Introduction

La macroatophagie, appelée ci-après autophagie, est une voie catabolique dans laquelle des composants endommagés ou dysfonctionnels, des protéines à longue durée de vie et des organites sont dégradés via le lysosome et sont recyclés 1 . Autophagy est un processus dynamique et à plusieurs étapes impliquant la formation d'un autophagosome; La fusion de l'autophagone avec le lysosome, formant l'autolysosome; Et la dégradation du contenu de l'autolysosome 2 . Le marqueur biologique crucial utilisé pour identifier l'autophagie dans les systèmes de mammifères est la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules, qui constitue la membrane autophagosomale. Au cours de l'autophagie, le LC3-1 cytosolique est conjugué à la phosphatidyléthanolamine pour former LC3-II; LC3-II est ensuite incorporé dans la membrane autophagosomale 3 . Un autre marqueur largement utilisé pour le flux autophagique est le récepteur d'autophagie séquestresome 1 (SQSTM1, p62) qui physiquement liNk freins autophagiques à la membrane autophagique 4 , 5 .

Les méthodes traditionnellement utilisées pour mesurer l'autophagie sont Western Blots et microscopie à fluorescence 7 . Cependant, aucune de ces méthodes n'est considérée comme la «norme-or», 2 , 6 car il existe des défis associés à ces deux techniques. Les transferts de Western ne donnent qu'une moyenne parce qu'ils utilisent un échantillon homogénat, de sorte que les observateurs ne peuvent pas voir ce qui se passe dans les cellules individuelles. D'autre part, la microscopie à fluorescence donne une information d'observateur au niveau d'une seule cellule, mais elle manque de capacités de débit, ce qui rend difficile l'obtention d'évaluations objectives et statistiquement rigoureuses. Au cours des dernières années, la mesure de LC3 et p62 par cytométrie de flux d'imagerie multispectrale (MIFC, voir la Table des matériaux ) a été en train de gagner en popuEn raison de son pouvoir quantitatif, de ses capacités élevées, de son potentiel de multiplexage et de sa capacité à imaginer chaque cellule. L'une des méthodes les plus utilisées pour mesurer l'autophagie à l'aide de MIFC, ainsi que son logiciel d'analyse complémentaire (voir la Table des matières ), est le comptage ponctuel de LC3 puncta ou autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Cependant, une augmentation des autophagosomes ne signifie pas nécessairement une augmentation de l'autophagie, car elle pourrait également représenter un blocage dans le processus 2 . Le renouvellement du LC3-II est un paramètre utile pour mesurer le flux autophagique en analysant les cellules en présence etAbsence d'inhibiteur de dégradation lysosomale, comme la chloroquine. La chloroquine inhibe la fusion de l'autophagosse au lysosome, permettant ainsi la quantification de la formation d'autophagonesome comme mesure du degré d'autophagie en arrêtant le flux autophagique avant que la dégradation lysosomale puisse se produire 18 . En outre, la p62 est dégradée principalement par autophagie, et si la dégradation lysosomale de l'autophagosome et son contenu est bloquée, une accumulation de p62 est attendue 17 , 19 .

Autophagy est un processus à plusieurs étapes, et la mesure de LC3 ou de p62 seule ne fournit pas une image complète de ce qui se passe dans les cellules. Des publications récentes ont souligné la nécessité d'examiner la formation simultanée de l'autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC estCapable de mesurer de manière unique la formation de l'autolysosome par imagerie de la co-localisation de l'autophagone au lysosome 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . En outre, la co-localisation de p62 et LC3 utilisant MIFC a également été explorée pour mesurer le flux autophagique 5 . Dans le logiciel d'analyse référencé, la "fonctionnalité" qui mesure la co-localisation s'appelle "Bright Detail Similarity R3" (BDS) et a été spécialement conçue pour comparer les détails d'image petite et lumineuse de deux images. BDS est le coefficient de corrélation Pearson transformé en log de points lumineux localisés avec un rayon de 3 pixels ou moins; En d'autres termes, BDS calcule le degré deVerlapping pixels à partir de deux canaux fluorescents différents. Les points lumineux sont soit corrélés ( c.-à-d., Même emplacement spatial) ou non corrélés ( c'est-à-dire différents emplacements spatiaux). Par conséquent, le coefficient de corrélation varie entre 0 (non corrélé) et 1 (corrélation parfaite). Le coefficient est log-transformé pour augmenter la portée entre zéro et l'infini 26 , 27 . BDS seul peut ne pas être suffisant; Rajan et al. Ont constaté que l'utilisation uniquement de SDE pourrait entraîner des résultats faussement positifs ou faussement négatifs 21 . BDS évalue la co-localisation de deux marqueurs d'autophagie mais ne considère pas le nombre d'autophagosomes. Pour tenir compte du nombre d'autophagosomes, Rajan et al. Inclus le comptage local de la LC3 puncta 21 . Rajan et al. Proposé en utilisant un diagramme de dispersion bivariée du nombre de points LC3 par rapport aux SDE. À l'aide de ce complot bivarié, deux populationsE identifié pour la première fois: un avec des cellules présentant un niveau élevé de taches de LC3 et une avec des cellules présentant un faible niveau de taches de LC3. La population de points LC3 a été classée en deux populations: les cellules ayant une faible localisation ( c. -à- d. L' accumulation d'autophagosomes) et les cellules ayant une co-localisation élevée ( c. -à- d. L' accumulation d'autolysosomes). Cette parcelle bivariée permet de distinguer les cellules avec très peu d'autophagosomes et de cellules avec une accumulation d'autophagosomes et / ou d'autolysosomes 21 .

Jusqu'à présent, la co-localisation simultanée de LC3, p62 et LAMP1 (marqueur lysosomale) n'était pas possible en utilisant un seul «Type d'entité» dans le logiciel d'analyse complémentaire MIFC (voir la Table des matières ). Cependant, une nouvelle fonctionnalité, récemment introduite dans la version 6.1, s'appelle Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compare les images détaillées lumineuses de chacune des trois images (dans ce cas LC3, p62 et LAMP1) et quantifie la co-localisation des trois sondes ( c.-à-d. LC3, p62 et LAMP1). La fonction BDC3 calcule le coefficient de corrélation de Pearson modifié pour s'étendre à trois images. Étant donné que les points lumineux des trois images sont corrélés ou non corrélés, le coefficient de corrélation varie entre 0 (non corrélé) et 1 (corrélation parfaite). Le coefficient est log-transformé pour augmenter la plage dynamique entre 0 et l'infini. En décalant la fonctionnalité BDS avec la fonctionnalité BDC3, la méthode d'analyse présentée par Rajan et al. Peuvent maintenant incorporer les trois marqueurs les plus utilisés pour mesurer l'autophagie dans un même système en même temps. La capacité de co-localiser ces trois marqueurs d'autophagie dans un seul essai pourrait conduire à de nouvelles idées sur l'induction et la régulation de l'autophagie. Le protocole suivant décrit les étapes pour induire l'autophagie dans les cellules Jurkat; Étiqueter les cellules avec des anticorps LC3, p62 et LAMP1; Acquérir des données sur un multispCytomètre de flux d'imagerie ectral; Et analyser les données pour évaluer le flux autophagique.

Protocole

1. Préparation d'un inhibiteur de milieu de culture et de dégradation lysosomale

  1. 1.1. Faire ~ 500 mL de 1x milieu de culture RPMI. Ajouter 5 ml d'acides aminés non essentiels MEM (100x), 5 mL de pyruvate de sodium (100 mM), 5 mL de pénicilline-streptomycine-glutamine (100x) et 25 mL de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 mL Bouteille de RPMI - 1640 1x medium. Le milieu doit être préparé dans un cabinet de prévention des risques biotechnologiques. Conserver le milieu de culture RPMI à 2-8 ° C. Chauffer le milieu de culture RPMI à 37 ° C avant de l'ajouter aux cellules Jurkat.
  2. Faire 100 mM de chloroquine, l'inhibiteur de dégradation lysosomale. Pesez 0,05 g de sel de diphphosphate de chloroquine et ajoutez-le à 1 ml d'eau de culture cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 ml. Vortex jusqu'à dissolution de la chloroquine.

2. Culturing of Cells

  1. Culture 80 ml de cellules de Jurkat clone E6-1 dans du milieu de culture RPMI à 37 ° C et 5% de CO 2 .
    REMARQUE: lors de la culture des cellulesOu en travaillant avec les cellules Jurkat avant la fixation, tous les travaux devraient être effectués dans le cabinet de prévention des risques biotechnologiques.
  2. Avant d'induire l'autophagie, comptez les cellules Jurkat en utilisant un hémocytomètre ou un autre dispositif de comptage cellulaire pour déterminer les cellules / ml.

3. Induire l'autophagie dans les cellules

  1. Prendre les cellules Jurkat en phase de croissance exponentielle et les diviser en quatre échantillons de 20 ml chacun dans des tubes centrifuges de 50 ml. Étiquetez les tubes comme "Contrôle", "Contrôle + Chloroquine", "Faim", "Faim ou Chloroquine".
    NOTE: Les cellules Jurkat devraient avoir une concentration de 2,5-5 x 10 5 cellules / mL.
  2. Lavez les cellules en ajoutant 30 mL de solution équilibrée de sel de Hank sans Ca 2+ ou Mg 2+ (HBSS) à chaque échantillon. Centrifuger à 250 xg pendant 10 min. Verser le surnageant dans un bécher à déchets.
  3. Remettre en suspension les échantillons de contrôle dans 20 mL de milieu de culture RPMI en pipetant vers le haut et vers le bas à l'aide d'un 25 mL sPipette jetable au terape suivie d'un vortex léger. De même, résorber les échantillons affamés dans 20 ml de la solution équilibrée de sel de Earle sans Ca 2+ ou Mg 2+ (EBSS).
  4. En utilisant une pipette jetable stérile de 25 ml, transférez le témoin et les échantillons affamés dans des flacons T75 qui ont été étiquetés «Contrôle», «Contrôle + Chloroquine», «Faimés» et «Faimés + Chloroquine».
  5. Ajouter 20 μL de chloroquine 100 mM aux 20 ml de milieu de culture cellulaire dans les flacons "Control + Chloroquine" et "Starved + Chloroquine". Mélanger dans la chloroquine en faisant tourner doucement le flacon. Placez tous les flacons dans un incubateur de 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 h.

4. Préparation des tampons pour la fixation et l'étiquetage de LC3, LAMP1 et p62

  1. Préparer 10 ml d'une solution de fixation au formol à 4% dans du PBS. Ajouter 4 mL de stock de 10% de formol à 1 mL de 10x Dulbecco's Phosphate-BufferedSolution saline sans Ca 2+ ou Mg 2+ (PBS) et 5 mL d'eau ultrapure dans un tube centrifuge de 15 mL.
    REMARQUE: ATTENTION. Formaline / formaldéhyde est toxique si inhalé ou avalé; Est irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau; Et peut provoquer une sensibilisation par inhalation ou contact avec la peau. Il y a un risque de dommages sérieux aux yeux. C'est un cancérogène potentiel.
  2. Préparer 10 ml d'une solution de suspension de formol finale à 1% dans du PBS. Ajouter 1 mL de stock de formol à 10% à 9 mL de 1x PBS dans un tube de centrifugation de 15 mL.
  3. Préparer 500 ml de tampon de lavage en ajoutant 10 ml de FBS dans une bouteille de 500 ml de 1x PBS.
  4. Préparer 50 ml de tampon de perméabilisation dans un tube centrifuge de 50 ml en ajoutant 0,5 ml de Triton X-100 à 10% au tampon de lavage 49,5 ml préparé à l'étape 4.3.
  5. Préparez une solution de traitement anti-anticorps anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) / tampon de perméabilisation en ajoutant 5 μL de anti-SQSTM1 / p62-AF488 à 495 μL du tampon de perméabilisation effectué dans sTep 4.4. Assurez-vous que la concentration finale en anticorps est de 5 μg / mL.
    REMARQUE: Effectuez une solution de traitement du tampon de perméabilisation des anticorps juste avant de l'ajouter à l'échantillon. Protégez la solution de la lumière.
  6. Préparer une solution de traitement de tampon anti-LC3 / perméabilisation de souris en ajoutant 5 μL d'anti-LC3 de souris à 495 μl du tampon de perméabilisation préparé à l'étape 4.4. Assurez-vous que la concentration finale en anticorps est de 20 μg / mL.
    REMARQUE: Créez des solutions de traitement de tampon de perméabilisation d'anticorps juste avant de l'ajouter à l'échantillon. Protégez la solution de la lumière.
  7. Préparez une solution de travail de tampon de perméabilisation anti-souris-Alexa 647 (AF647) / tampon de perméabilisation en ajoutant 5 μL d'IgG anti-souris à doigts marqués AF647 à 495 μL du tampon de perméabilisation préparé à l'étape 4.4. Assurez-vous que la concentration finale en anticorps est de 20 μg / mL.
    REMARQUE: Effectuez la solution de traitement du tampon de perméabilisation des anticorps juste avant de l'ajouter à l'échantillon. Protéger tLa solution de la lumière.
  8. Préparer une solution de traitement de tampon d'immunodéficience d'anticorps CD107a (LAMP1) -PE anti-humain par ajout de 25 μL de anti-CD107a (LAMP1) -PE à 475 μL du tampon de perméabilisation préparé à l'étape 4.4. Assurez-vous que la concentration finale d'anticorps est de 21 μg / mL.
    REMARQUE: Effectuez la solution de traitement du tampon de perméabilisation des anticorps juste avant de l'ajouter à l'échantillon. Protégez la solution de la lumière.
  9. Préparez 10 fois la tache nucléaire DAPI en ajoutant 4 μL de 5 mg / mL de DAPI et 100 μL de 10% de triton X-100 à 896 μL de 1x PBS.

5. Étiquetage des cellules Jurkat avec LC3, LAMP1 et p62

  1. Supprimez 2 x 10 6 cellules par échantillon (comptez les cellules comme à l'étape 2.2). Placez chaque échantillon dans un tube centrifuge de 15 ml qui a été étiqueté avec le nom de l'échantillon approprié ( c.-à-d., Control, Control + Chloroquine, Starved, ou Starved + Chloroquine).
    1. Ajouter un tampon de lavage pour que jeVolume total de 15 ml dans chaque tube centrifuge de 15 ml. Centrifuger les échantillons à 250 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant.
  2. Ajouter 100 μL de solution de fixation au formol à 4% à chacune des pastilles cellulaires. Remise en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette P200. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Pendant l'étape de fixation, transférez les échantillons à des tubes de microcentrifugeuse de polypropylène marqués et siliconés.
    REMARQUE: Ne réparez pas trop les cellules; Cela pourrait entraîner de mauvais résultats d'étiquetage.
  3. Après l'étape de fixation de 10 min, ajouter 1 mL de tampon de lavage à chaque échantillon. Pipetter vers le haut et vers le bas avec une pipette P1000 pour mélanger l'échantillon. Centrifuger à 250 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
  4. Ajouter 100 μL de solution de traitement anti-anticorps anti-SQSTM1 / p62-AF488 / tampon de perméabilisation à chaque échantillon. Remise en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette P200. Incuber pendant 30 minutes dans l'obscurité à température ambiante.
  5. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL deTampon de perméabilisation à chaque échantillon. Pipetter vers le haut et vers le bas avec une pipette P1000 pour mélanger l'échantillon. Centrifuger à 250 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
  6. Répétez les étapes 5.4-5.5 pour chacune des solutions de travail d'anticorps.
    NOTE: Les solutions de travail d'anticorps sont une solution de travail de tampon anti-LC3 / perméabilisation de souris, une solution de travail de tampon de perméabilisation anti-souris et anti-souris - anti-souris - AF647 / solution de traitement de tampon de perméabilisation et une solution de traitement de tampon de perméabilisation CD107a (LAMP1) - PE. Chaque anticorps doit être effectué séparément et dans l'ordre indiqué. L'ordre a été choisi pour minimiser la réactivité croisée indésirable entre les anticorps.
  7. Ajouter 100 μL de solution de formol à 1%. Remise en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette P200. Ajouter 10 μL de la tache nucléaire DAPI 10x à chaque échantillon. Vaporiser légèrement chaque échantillon pour mélanger. Incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité à température ambiante avant d'exécuter l'un des échantillons sur l'instrument.
    NOTE: À ce stade, l'échantillon peut soit bE exécuté sur le MIFC ou protégé contre la lumière à 2-8 ° C pendant une semaine.

6. Étiquetage des contrôles à une seule couleur

  1. Pour chaque contrôle de couleur unique ( c.-à-d., AF488, PE, AF647 et DAPI), prenez 1 x 10 6 cellules Jurkat, qui peuvent provenir de l'une des populations d'échantillons. Mettez 1 x 10 6 cellules dans des tubes de centrifugation de 15 ml étiquetés soit AF488, PE, AF647, soit DAPI.
  2. Ajouter un tampon de lavage de sorte qu'il y ait un volume total de 15 mL dans chaque tube de centrifugation de 15 mL. Centrifuger les échantillons à 250 xg pendant 10 min. Aspirer le surnageant.
  3. Ajouter 100 μL de tampon de lavage aux tubes AF488, PE et AF647.
    REMARQUE: Pour le tube DAPI, passez à l'étape 6.8.
    1. Remise en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette P200. Transférer dans des tubes de 1,5 mL.
  4. Ajouter 5 μL d'anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE ou anti-CD45-AF647 aux tubes AF488, PE ou AF647, respectivement. Mélanger en vortexing lIghtly.
  5. Incuber les tubes AF488, PE et AF647 pendant 30 min dans l'obscurité à température ambiante.
    NOTE: D'autres marqueurs peuvent être utilisés, tels que les anticorps LC3, P62 et LAMP-1 au lieu des anticorps anti-CD45. Cependant, CD45 est un marqueur fiable pour les contrôles à une seule couleur.
  6. Lavez les cellules AF488, PE et AF647 en ajoutant 1 mL de tampon de lavage à chaque échantillon.
    1. Pipetter vers le haut et vers le bas avec une pipette P1000 pour mélanger l'échantillon. Centrifuger à 250 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
  7. Ajouter 100 μL de solution de formol à 1%. Remise en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette P200.
    REMARQUE: à ce stade, l'échantillon peut être exécuté sur le MIFC ou stocké protégé de la lumière à 2-8 ° C pendant une semaine.
  8. Ajouter 100 μL de solution de fixation au formol à 1% au tube DAPI.
    1. Remise en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette P200. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
    2. Ajouter 101; L de 10 fois la tache nucléaire DAPI à l'échantillon DAPI. Légèrement vortex à mélanger. Incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité à température ambiante avant de courir sur l'instrument.
      REMARQUE: à ce stade, l'échantillon peut être exécuté sur le MIFC ou stocké protégé de la lumière à 2-8 ° C pendant une semaine.

7. Démarrage et étalonnage du MIFC

  1. Assurez-vous que les récipients de la gaine, du réactif d'étalonnage du système (voir la table des matières ), du débobulteur, du nettoyant et du stérilisateur sont pleins et que le réservoir d'essence est vide. Sinon, remplir les conteneurs et vider le réservoir de déchets.
  2. Mettez le système en marche et double-cliquez sur le logiciel (voir l'icône Table of Material s) pour lancer l'application; Cela démarrera le logiciel MIFC.
  3. Cliquez sur le bouton de démarrage et assurez - vous que tous les étalonnages de démarrage et les tests est sélectionné. Cela évacue le système, la gaine de charge, le réactif d'étalonnage du système,Et étalonner le système.

8. Exécution des échantillons et des contrôles à une seule couleur sur le MIFC

  1. Chargez le modèle par défaut en allant dans l'onglet Fichier et sélectionnez Charger le modèle par défaut .
    REMARQUE: le modèle par défaut contient les matrices de point de pixel maximum brutes.
  2. Activez les lasers 488 nm, 405 nm, 642 nm et SSC en cliquant sur leurs boutons respectifs. Réglez la puissance du laser en entrant la puissance souhaitée à côté de chaque bouton laser. Voir la figure 1 .
    REMARQUE: pour cette expérience, les puissances laser sont de 200 mW, 20 mW, 150 mW et 5 mW (Ch06) pour les 488 nm, 405 nm, 642 nm et SSC, respectivement. L'amplification du modèle par défaut MIFC réglé sur 40X, la sensibilité par défaut est Hi , et tous les canaux sont activés.
  3. Confirmez que le curseur d'agrandissement est réglé sur 40X, le mode haute sensibilité est sélectionné et tous les canaux sont affichés dans la galerie d'images; Figure 1 montre les paramètres d'instruments utilisés dans cette expérience.
  4. Chargez l'échantillon "Starved + Chloroquine" en cliquant sur le bouton Charger et en chargeant le tube de 1,5 mL sur l'instrument.
    REMARQUE: Cet échantillon expérimental devrait avoir le signal le plus élevé de tous les échantillons pour AF488, PE et AF647 (le signal DAPI devrait avoir approximativement la même force de signal pour tous les échantillons expérimentaux, y compris l'échantillon "Starved + Chloroquine").
  5. Utilisez l'échantillon "Starved + Chloroquine" pour confirmer que les puissances laser appropriées pour les lasers 488 nm, 405 nm, 642 nm et SSC sont définies. Utilisez les diagrammes de points de pixels max crus dans le modèle par défaut pour ajuster les puissances laser afin que les signaux soient forts mais n'atteignent pas une valeur de pixel maximum brute de 4 096, ce qui saturerait la caméra CCD sur l'instrument. Utilisez ce paramètre laser pour tous les échantillons expérimentaux.
  6. Cliquez sur l'icône Create Dot Plots pour créer un nouveau tracé de points. Sélectionnez "Area_M01 "sur l'axe X et" Aspect Ratio_M01 "sur l'axe des Y pour la population" tout ". Cliquez sur l'icône Créer une région polygone . Dessinez une région autour des cellules. Nommez cette région" Cellule ".
    REMARQUE: les utilisateurs peuvent ajouter des parcelles et des régions supplémentaires pour réduire les cellules collectées. Un complot additionnel commun à ajouter serait Gradient RMS pour identifier les cellules qui sont en foyer.
  7. Définissez les paramètres d'acquisition. Spécifiez le nom du fichier et le dossier de destination, modifiez le nombre d'événements sur "5,000" et sélectionnez la population de collecte "Cell". Cliquez sur le bouton Acquérir pour acquérir le fichier. Après avoir collecté le fichier, retournez l'échantillon en cliquant sur le bouton Retour . Retirez le tube échantillon de l'instrument.
  8. Pour les trois échantillons suivants («Starved,« Control »et« Control + Chloroquine »), chargez l'échantillon, entrez le nom de l'échantillon, acheminez l'échantillon et renvoyez l'échantillon en utilisant les mêmes paramètres quePour l'échantillon "Starved + Chloroquine" ci-dessus.
  9. Une fois que les échantillons ont été acquis, exécutez les échantillons de contrôle de couleur unique et obtenez des données afin qu'une matrice de compensation puisse être établie. Éteignez le laser SSC en cliquant sur le bouton SSC . Éteignez les canaux lumineux en cliquant sur le bouton Brightfield et en sélectionnant OFF .
    REMARQUE: si les canaux ont été retirés de la galerie d'images pour l'acquisition de l'échantillon expérimental, réactivez tous les canaux. Alternativement, les contrôles à une seule couleur peuvent être obtenus en cliquant sur l'onglet Compensation et en sélectionnant Créer une matrice ; Cela ouvre l'assistant de compensation, qui parcourra l'étape consistant à collecter des fichiers et à créer une matrice de compensation.
  10. Chargez la commande de couleur unique DAPI en cliquant sur le bouton Charger et en chargeant le tube de 1,5 mL dans l'instrument. Entrez le nom de l'échantillon (DAPI uniquement), définissez la population de la collection sur «Tous» et modifiez le nombre d'événementsS à "500".
    1. Cliquez sur le bouton Acquérir pour acquérir le fichier de contrôle à une seule couleur.
    2. Lorsque la collecte du fichier est terminée, renvoyez l'échantillon en cliquant sur le bouton Retour . Retirez le tube échantillon de l'instrument.
    3. Après l'échantillon DAPI, charger 10% d'eau de Javel tout comme un échantillon en cliquant sur le bouton Charger et en chargeant 100 μL d'eau de Javel à 10% dans un tube de 1,5 mL. Laissez l'échantillon courir pour ~ 15 s. Cela éliminera tout DAPI résiduel du tube.
    4. Exécuter 100 μL de 1x PBS, comme fait en 8.10.3, pour éliminer l'eau de Javel résiduelle à 10%. L'instrument est maintenant prêt à exécuter les contrôles AF488, PE et AF647 à une seule couleur.
    5. Répétez les étapes 8.10-8.10.2 pour chacun des contrôles à une seule couleur ( c.-à-d. AF488, PE et AF647).
      REMARQUE: Il n'est pas nécessaire d'exécuter 10% d'eau de Javel ou de PBS entre ces échantillons, seulement après le contrôle de la couleur unique DAPI.

9. Analyse des données dans le MIFC AnLogiciel d'analyse

  1. Lancez le logiciel d'analyse MIFC (voir la table des matières ).
  2. Cliquez sur Démarrer l'analyse pour commencer l' Assistant Fichier ouvert . Sélectionnez le fichier de données à ouvrir en parcourant le fichier d'image brut "Starved + Chloroquine" (.rif). Sélectionnez le fichier et cliquez sur le bouton Ouvrir . Cliquez sur Suivant .
    1. Appliquer une compensation. Sélectionnez une matrice de compensation créée précédemment et cliquez sur Suivant . Sinon, créez une nouvelle matrice de compensation en cliquant sur le bouton Nouvelle matrice .
      REMARQUE: Les étapes 9.2.1.1-9.2.1.2 sont les étapes pour créer une nouvelle matrice.
      1. Ajoutez les fichiers de contrôle à une seule couleur ( c'est-à-dire uniquement DAPI, AF488, PE uniquement et AF647 uniquement) dans la liste des fichiers de contrôle en cliquant sur Ajouter des fichiers , en sélectionnant les fichiers et en cliquant sur le bouton Ouvrir . Cliquez sur Suivant .
      2. La fenêtre Créer une matrice de compensation apparaîtra pour cette expérience. EnsurE que Ch02, Ch03, Ch07 et Ch11 sont sélectionnés et cliquez sur Suivant . La matrice de compensation sera créée. Cliquez sur Terminer pour enregistrer la matrice de compensation. Ajoutez le fichier de compensation à l' Assistant Fichier ouvert et cliquez sur Suivant .
    2. Appliquer le modèle d'analyse. À ce stade, il n'y a pas de modèle d'analyse à appliquer, alors cliquez sur Suivant .
      REMARQUE: pour les autres fichiers expérimentaux, ce fichier "Starved + Chloroquine.daf" peut être utilisé comme modèle.
    3. Nommez le fichier (les noms de fichiers qui correspondent aux noms "rif" sont automatiquement générés) et cliquez sur Suivant . Définissez les propriétés d'affichage de l'image en sélectionnant les canaux "02," "03", "07" et "11"; Les chaînes 01, 06 et 09 sont présélectionnées. Cliquez sur Suivant .
  3. À la fin de l' Assistant Fichier ouvert , sélectionnez l' Assistant Apoptosis . Cliquez sur l'icône de l' Assistant Apoptosis , puis surLe bouton Sélectionner un assistant pour ouvrir l' assistant d'apoptose .
    1. Sélectionnez le canal d'image nucléaire (Ch07) et cliquez sur Suivant . Placez les cellules au mieux. Cliquez sur l'icône Créer une zone de ligne et dessinez une région sur Gradient RMS_M01_Ch01 de 60 à 90. Nommez cette région «Focus», cliquez sur OK , puis cliquez sur Suivant .
    2. Placez les cellules individuelles. Cliquez sur l'icône Créer une région polygone . Dessinez une région autour des cellules individuelles, nommez la région "Simple", cliquez sur OK , puis cliquez sur Suivant . Cliquez sur Non pour "Voulez-vous analyser les sous-populations?"
    3. Placez les cellules nucléées. Cliquez sur l'icône Créer une zone de ligne et dessinez une région qui inclut toutes les cellules nucléées. Nommez la région "Nucleated". Cliquez sur OK et Suivant .
    4. Garez les cellules apoptotiques. Cliquez sur l'icône Créer une région polygone . Dessiner une région autour des cellules apoptotiques; Ce sont des cellulesAvec une faible concentration de zone nucléaire_50% et contraste de haute luminosité. Cliquez sur Terminer . Ajoutez une deuxième région en cliquant sur l'icône Créer une région polygone et en dessinant une région autour des cellules non apoptotiques; Appelez cette région "Cellules".
  4. Sélectionnez les cellules positives pour LAMP1, p62 et LC3. Cliquez sur l'icône Building Blocks , sélectionnez Fluorescence Positives - One Color , puis sélectionnez la population "Cells" et Intensity_MC_Ch03 . Étiquetez l'axe X "Intensity LAMP1". Dessinez une région qui comprend des cellules avec des intensités supérieures à 10 000 en cliquant sur l'icône Créer une zone de ligne et en dessinant la région. Étiquettez cette région "LAMP1 +". Suivez les mêmes étapes que dans 9.4 pour sélectionner les cellules positives pour p62 et LC3.
    1. Pour p62 + sélectionnez la population "LAMP1 +" et Intensity_MC_Ch02 . Étiquetez l'axe X "Intensity p62" et la région des cellules p62 + "LAMP1 + / p62 +".; Pour le LC3 +, sélectionnez la population "LAMP1 + / p62 +" et Intensity_MC_Ch11. Étiquetez l'Intensité LC3 de l'Axe X et la région des cellules LC3 + "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Utilisez cette population "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" pour le reste de l'analyse.
  5. Créez une fonction de prise en compte pour compter les points LC3.
    REMARQUE: cela devrait être créé à l'aide de l'échantillon "Starved + Chloroquine".
    1. Cliquez sur l'onglet Analyse et sélectionnez Masque . Cliquez sur le bouton Nouvelle , puis sur le bouton Fonction . Sous Fonction , sélectionnez Peak ; Masque , sélectionnez M11 ; Et Canal , sélectionnez Ch11 . Réglez le rapport de fond Spot to Cell à 4 . Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre Définir Masque et OK pour l'ajouter à la liste Masque . Cliquez sur Fermer pour quitter le Mask Manager .
    2. Cliquez sur l'onglet Analyse et sélectionnez Caractéristiques. Cliquez sur le bouton Nouveau . Sous Type d'entité , sélectionnez Spot Count et sous Mask , sélectionnez Peak (M11, Ch11, Bright, 4). Tapez "Spot Count LC3" pour le Nom et cliquez sur OK et Fermer pour quitter le Feature Manager .
      REMARQUE: L'assistant Spot peut également être utilisé pour créer une fonction de détection de spot. La caractéristique de prise en compte utilisée dans cette expérience peut ne pas être appropriée pour d'autres expériences et / ou une ligne cellulaire. L'utilisateur doit tester plusieurs masques / fonctionnalités spot-count lors de la décision sur un masque / fonctionnalité pour un ensemble de données spécifiques. Pugsley 2017 dispose de plus de détails sur le comptage des points en utilisant le logiciel d'analyse MIFC 26 .
    3. Cliquez sur l'icône New Histogramme . Sélectionnez la population "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Sélectionnez la fonction Spot Count LC3 et cliquez sur OK .
  6. Créez la fonctionnalité BDC3.
    1. CLèche l'onglet Analyse et sélectionnez Caractéristiques . Cliquez sur le bouton Nouveau . Sous Type d'entité , sélectionnez Cologisation des détails brillants 3 ; Masque , sélectionnez MC ; Image 1 , sélectionnez Ch02 (p62); Image 2 , sélectionnez Ch03 ( LAMP1 ); Et je mage 3 , sélectionnez Ch11 (LC3). Tapez "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" pour le Nom et cliquez sur OK et Fermer pour quitter le Gestionnaire de fonctionnalités .
    2. Cliquez sur l'icône New Histogramme . Sélectionnez la population "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Sélectionnez la fonction BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 et cliquez sur OK .
  7. Cliquez sur l'icône New Scatterplot . Sélectionnez la population "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Sélectionnez BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pour l'axe X. Sélectionnez la fonction Spot Count LC3 pour l'axe des Y. Cliquez sur OK .
  8. Save thE "Starved + Chloroquine" fichier. Cliquez sur Fichier et sélectionnez Enregistrer le fichier d'analyse des données (.daf) . Cliquez sur Enregistrer et sur Oui pour remplacer la version précédente du fichier; Ce fichier peut maintenant être utilisé comme modèle.
  9. Ouvrez le fichier "Contrôle". Cliquez sur Fichier , puis sur Ouvrir . Sélectionnez le fichier "Control.rif" et cliquez sur Ouvrir . Sélectionnez la matrice de compensation à partir de l'étape 9.2.1 et le fichier "Starved + Chloroquine.daf" comme modèle. Cliquez sur OK .
  10. Créer des régions pour l'accumulation d'autophagosomes et l'accumulation d'autolysosomes en utilisant l'échantillon "Contrôle" pour définir les régions.
    1. Cliquez sur l'icône Créer une région de rectangle . Dessinez une région à partir de coordonnées X de -0,1 à 3 et de coordonnées Y de 1,5 à -0,3. Nommez cette région "Low Spots". Clique sur le Créer une icône Région rectangulaire . Dessinez une région à partir des coordonnées X de -0.1 à 1 et Y-coordinDe 17,5 à 1,5. Nommez cette région "High Spot / Low BDC3".
    2. Cliquez sur l'icône Créer une région de rectangle. Dessinez une région à partir des coordonnées X de 1 à 3 et des coordonnées Y de 17,5 à 1,5. Nommez cette région «High Spots / High BDC3».
  11. Enregistrez le fichier "Contrôle". Cliquez sur Fichier et sélectionnez Enregistrer le fichier d'analyse des données (.daf ) . Cliquez sur Enregistrer et sur Oui pour remplacer la version précédente du fichier; Ce fichier peut maintenant être utilisé comme modèle.
  12. Ouvrez le fichier "Contrôle + Chloroquine" en cliquant sur Fichier , puis sur Ouvrir . Sélectionnez le fichier "Control + Chloroquine.rif" et cliquez sur Ouvrir . Sélectionnez la matrice de compensation à partir de l'étape 9.2.1 et le fichier "Control.daf" comme modèle. Cliquez sur OK . Répétez ceci pour les fichiers «Faimés» et «Faimés + Chloroquine».
    REMARQUE: la fonction de lot dans le logiciel d'analyse peut également être utilisée pour appliquer la compensaMatrice de génération et / ou modèle aux autres fichiers. La stratégie de fermeture finale est illustrée à la Figure 2 .

Résultats

Cette méthode d'analyse utilise des fonctionnalités multiples pour évaluer le flux autophagique. Afin de bien comprendre l'intrigue finale bivariée, les caractéristiques d'analyse individuelles doivent d'abord être étudiées. Le comptage des autophagosomes est un moyen logique de mesurer l'autophagie; Cependant, la taille / la forme / la luminosité de LC3 puncta peuvent varier drastiquement entre les cellules. La variation peut rendre difficile la comptabilisation manuelle des autophagosomes ou l'utilisation d'une fonction de prise en compte dans le logiciel d'analyse. Par conséquent, aucune caractéristique de détection spot ne sera parfaite en raison de cette grande variabilité dans les autophagosomes. Cependant, une bonne fonction de compte à vue fonctionnera sur la plupart des cellules 26 . La figure 3 montre des exemples de masquage ponctuel de LC3 puncta dans les cellules Jurkat en utilisant différents masques ponctuels. La fonction de prise en compte sélectionnée pour cet ensemble de données est Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, ce qui signifie que la fonctionnalité spot-count a compté les spots que le peMasque ak identifié dans le masque de canal 11 par défaut (M11) sur le canal 11 (Ch11-LC3-AF647) avec un rapport de fond de 4 couleurs (Bright, 4). La figure 4 montre les histogrammes de compte à vue et les images représentatives pour le nombre moyen de points pour les cellules Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine Jurkat marquées avec anti-LC3-AF647. Le nombre moyen de contrôle et de Starved ne sont pas significativement différents; Avec l'addition de chloroquine, il existe une grande différence dans la moyenne de la Chloroquine Contrôle + par rapport à la Famine + Chloroquine.

La prochaine caractéristique à étudier est BDC3. BDC3 est une mesure de la co-localisation de trois marqueurs / sondes, dans ce cas, LC3, p62 et LAMP1. La figure 5A - 5D montre les histogrammes BDC3 pour les cellules Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine Jurkat marquées avec anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE et anti-LC3-AF647. Il y a un décalage entre le moyen de contrôle par rapport à la moyenne fortifiée, ainsi que la moyenne témoin + Chloroquine à la moyenne de Starved + Chloroquine. Cependant, en regardant les images des cellules à partir des scores BDC3 moyens de la figure 5E - 5H , il y a une différence plus grande entre les échantillons que les histogrammes peuvent conduire à croire. C'est parce que BDC3 ne considère pas le nombre d'organelles autophagiques qui co-localisent, ce qui entraîne une grande variabilité du nombre d'autophagosomes pour le même score BDC3. Dans la plupart des cas, il existe un chevauchement entre les trois sondes car, même au niveau basal, p62, LAMP1 et LC3 devraient, dans une certaine mesure, co-localiser ou résider dans des régions similaires dans les cellules. En contraste, un exemple de trois sondes qui ne doivent pas co-localiser sont les colorants nucléaires anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 et DAPI pour l'échantillon Starved + Chloroquine, montrés à la Figure 6.

Lorsque la fonctionnalité spot-count et la fonctionnalité BDC3 sont combinées, la présence de différentes sous-populations qui améliorent la capacité de distinguer les différents échantillons / conditions est évidente. La figure 7 montre le graphique bivarié du nombre de points de LC3 par rapport à BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pour les quatre échantillons: contrôle, contrôle + chloroquine, affamés et affamés + chloroquine. L'échantillon de contrôle a été utilisé pour définir la stratégie de déclenchement pour trois populations: points faibles, points élevés / faible BDC3 et points élevés / BDC3 élevé. Les échantillons témoins ont démontré que plus de 98% des cellules avaient 1 point ou moins. La limite entre les High Spots / Low BDC3 et High Spots / High BDC3 a été réglée sur un score BDC3 de 1, car plus de 91% de l'échantillon Control avait un score BDC3 inférieur à 1. Un résumé des résultats pour les parcelles bivariées Est présenté dans le tableau 1 .

Age = "1"> figure-results-1
Figure 1: Paramètre de l'instrument MIFC. Une capture d'écran des paramètres de l'instrument MIFC utilisés pour cette expérience, décrite à l'étape 8 du protocole. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-2
Figure 2: Stratégie de gestion des logiciels d'analyse. Une capture d'écran du schéma de verrouillage du logiciel d'analyse, décrite à l'étape 9 du protocole. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Fig3.jpg "/>
Figure 3: masquage de points LC3. Les images et les masques de la cellule Jurkat utilisés pour créer la fonction de prise en compte. On peut voir BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) et Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Le masque qui a fonctionné le mieux pour toutes les cellules montré était Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-3
Figure 4: Histogrammes LC3 Spot-count. En utilisant la fonction de détection spot Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 et les histogrammes de comptage spot LC3-AF647 pour Control ( A , bleu clair), Control + ChloroquinE ( B , bleu), Starved ( C , rose) et Starved + Chloroquine ( D , rouge). Le point moyen compte pour Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine sont respectivement de 0,07, 1,13, 0,10 et 2,77. BF, LC3-AF647 (rouge), le colorant nucléaire DAPI (bleu) et un composite des images LC3-AF647 et DAPI des cellules représentatives pour le nombre moyen de taches sont indiqués pour Control ( E , 0 spots), Control + Chloroquine ( F , 1 point), Starved ( G , 0 points), et Starved + Chloroquine ( H , 3 points). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-4
Figure 5: Histogrammes BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. Histogrammes BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pourR Control ( A , bleu clair), Control + Chloroquine ( B , bleu), Starved ( C , rose) et Starved + Chloroquine ( D , rouge). Le score moyen de BDC3 pour Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine est respectivement de 0,57, 0,82, 0,74 et 0,98. BF; P62-AF488 (vert); LAMP1-PE (jaune); LC3-AF647 (rouge); Et un composite des images p62-AF488, LAMP1-PE et LC3-AF647 de cellules représentatives pour la moyenne BDC3 sont présentés pour Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) et Starved + Chloroquine ( H ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-5
Figure 6: Histogrammes BDC3 de p62 / LC3 / DAPI pour l'échantillon Starved + Chloroquine. ( A ) L'histogramme BDC3 p62 / LC3 / DAPI pour l'échantillon Starved + Chloroquine est montré. Le score moyen de BDC3 est de 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (vert); LC3-AF647 (rouge); DAPI (bleu); Et un composite des images p62-AF488, LC3-AF647 et DAPI de cellules représentatives pour le BDC3 moyen est représenté pour l'échantillon Starved + Chloroquine. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-6
Figure 7: parcelles bivariées de LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Placements bivariés du nombre de points LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pour les cellules Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (vert); LAMP1-PE (jaune); LC3-AF647 (rouge); Et un composite des images p62-AF488, LAMP1-PE et LC3-AF647 de trois régions ( c'est-à-dire Low Spots, High Spots / Low BDC3 et High Spots / High BDC3) sont indiqués pour l'échantillon Starved + Chloroquine. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nombre de cellules Colocation brillante des détails 3 Moyenne Nombre horaire LC3 Mean % Low Spot % High Spot / Low BDC3 % High Spot / High BDC3
Contrôle 439 0,57 0,07 98.2 1.8 0.0
Contrôle + Chloroquine 1432 0,82 1.13 68,9 19,5 11.7
Affamé 1204 0,74 0,10 98.4 0,6 1.0
Faim + Chloroquine 1811 0,98 2.77 32.1 36,9 31.0

Tableau 1: Résumé de Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariée Plot

Discussion

Lorsque vous effectuez cette analyse, il y a quelques points à considérer. Il est important d'avoir des échantillons de contrôle appropriés. Pour cette expérience, deux contrôles différents ont été utilisés: Control and Control + Chloroquine. L'échantillon de contrôle a été utilisé pour définir le seuil pour les régions. Il représente le niveau basal de l'autophagie sans arrêter la dégradation lysosomale et est le contrôle de l'échantillon mort. Cependant, l'échantillon de contrôle n'est pas un contrôle approprié pour comparer avec les résultats de l'échantillon Starved + Chloroquine car la chloroquine influe lui-même sur l'échantillon témoin. Par conséquent, il fallait avoir un échantillon Control + Chloroquine.

Avant d'effectuer toute analyse pour l'autophagie, il est important d'analyser uniquement les cellules individuelles qui sont concentrées ( c'est-à-dire un gradient RMS supérieur à 60), car les résultats pourraient être affectés s'il y a plus d'une cellule ou que les images sont flou. Il est crucial que l'autophagosomEs et les lysosomes sont concentrés pour un comptage local correct et une analyse BDC3. Les cellules apoptotiques doivent être enlevées avant l'analyse autophagique, car elles peuvent fausser les résultats et ne doivent pas être incluses. Il devrait y avoir une coloration appropriée pour les trois marqueurs ( c.-à-d., LC3, p62 et LAMP1). Par exemple, les trois marqueurs sont intracellulaires et devraient avoir un signal ponctuel; Si le signal n'est pas ponctuel, ou s'il se trouve à la surface de la cellule, la coloration ne convient pas et l'expérience / la coloration doit être refaite. En outre, pour BDC3 pour être précis, il est essentiel de passer des cellules brillantes pour les trois marqueurs fluorescents d'intérêt. L'activation des événements positifs est nécessaire pour empêcher la mesure de BDC3 sur les liaisons non spécifiques, les artefacts d'image et / ou le bruit. Ceci est crucial, car BDC3 peut potentiellement amplifier des artefacts qui ne sont pas des signaux vrais. Étant donné que BDC3 ne peut être effectué que sur des événements lumineux positifs, de nombreuses cellules peuvent ne pas être incluses dans l'analyse finale; Ceci est especPour les cellules témoins qui n'ont pas d'accumulation de LC3, p62 et / ou LAMP1. Ainsi, une limitation de ce dosage est que BDC3 examine uniquement les cellules positives pour les trois marqueurs, ce qui pourrait ne pas convenir à toutes les expériences d'autophagie.

Comme BDS, qui a été précédemment rapporté 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 seul ne tient pas compte du nombre d'organelles autophagiques qui co-localisent, ce qui entraîne un degré élevé De la variabilité du nombre d'autophagosomes. Par conséquent, l'approche bivariée présentée par Rajan et al. était employé. En regardant les parcelles bivariées, on pourrait se demander siLes cellules doivent être positives pour LC3, p62 et LAMP1; Pourquoi y a-t-il tant de cellules qui ont 0 points? Ceci est dû au fait que le signal LC3 pourrait être assez lumineux pour la co-localisation, mais il pourrait ne pas respecter le seuil défini par le masque de crête (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) nécessaire pour être considéré comme un place.

Le protocole présenté ici a utilisé MIFC pour compter LC3 puncta et la co-localisation de trois marqueurs autophagiques pour mesurer le flux autophagique. Dans les conditions basales (échantillon témoin), le nombre d'autophagosomes était faible et peu de cellules ont été trouvées avec des "points élevés". Avec l'addition de la chloroquine, qui inhibe la fusion autophagosomère / lysosome, il y a eu une augmentation du nombre de points LC3. Puisque le lysosome est incapable de décomposer l'autophagosome et le p62, qui réside dans l'autophagone, cela entraîne une augmentation de la co-localisation de l'accumulation d'autolysosomes LC3, P62 et LAMP1. Cet effet a été amplifié sous l'effet de l'étoile en éléments nutritifsIon, ce qui induit l'autophagie. Cependant, sans l'ajout de chloroquine, il n'y a pas eu d'augmentation significative du nombre d'autophagosomes, probablement en raison d'une augmentation du taux de renouvellement autophagique. Lorsque les cellules ont été affamées en présence de chloroquine, il y a eu une augmentation de la localisation et du nombre d'autophagosomes, ce qui permet de conclure que la famine augmente le flux autophagique. EBSS est connu pour être un inducteur puissant d'autophagie. Par conséquent, on s'attend à ce que l'augmentation soit importante. Si une autre méthode, telle que l'induction du médicament, est utilisée pour induire une autophagie, la différence entre le contrôle et les échantillons traités peut être plus subtile.

Ce protocole particulier a été conçu pour mesurer l'autophagie dans les lignées cellulaires humaines, mais le dosage pourrait être adapté à d'autres espèces en passant à des anticorps pour cette espèce particulière. De plus, la méthode d'analyse pourrait être utilisée pour toute application intracellulaire nécessitant une co-localisationDe trois sondes / marqueurs.

Déclarations de divulgation

Je suis employé par MilliporeSigma, le fabricant de la marque Amnis ImageStream, qui a été utilisé dans cette étude.

Remerciements

J'aimerais remercier mes collègues de MilliporeSigma, Philip J. Morrissey et Sherree L. Friend, pour leur soutien et leur orientation au cours des années. Je voudrais également remercier Vidya Venkatachalam et Bryan R. Davidson pour leur aide avec la fonctionnalité BDC3 dans le logiciel IDEAS , Ryan P. Jessup pour l'aide pour l'édition de ce manuscrit, Raymond Kong pour l'aide le jour du tournage et un merci spécial Au maquilleur Cynthia Xamonthiene.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à centrifuger 15 mLFalcon352096
Tube à centrifuger 50 mLFalcon352070
AF647 étiqueté Âne anti-Souris - IgG  ;InvitrogenA-31571Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) d’âne, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
H4A3 de CD107a-PE (LAMP1)BioLegend(328607de Human Legend. Concentration 400 & micro ; g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
CD45- AF488BioLegend304017Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
CD45- PE anti-humain  ;BioLegend304008Clone HI30.  ; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-humain CD45-AF647  ;BioLegend304018Clone HI30.  ; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Humain) mAb clone 4E12MBL International CorporationM152-3Clone 4E+12.  ; Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anticorps anti-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - Marqueur d’autophagosome (Alexa Fluor 488)abcamab185015Clone EPR4844.  ; Concentration 0,5 mg/mL http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Sel de diphosphate de chloroquineSigma-AldrichC6628-25G
Nettoyant - Coulter Clenz ;Beckman Coulter8546931Remplissez le récipient avec 200 ml de nettoyant https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
teinture DAPI 5 mg/mLMilliporeSigma508741
http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 Debubbler - 70 % IsopropanolMilliporeSigma1.3704Remplir le récipient avec 200 mL de débulleur.  ; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s 10xMilliporeSigmaBSS-2010-B  ; Ca++Mg++ Gratuit  ;
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1xMilliporeSigmaBSS-1006-BPBS Ca++Mg++ Free  ;
Earle’s Balanced Salt Solution 1xGibco14155
Sérum de veau fœtalHyCloneSH30071.03
Formaldéhyde, 10 %, sans méthanol, Ultra PurePolysciences, Inc.04018C’est ce qui est utilisé pour le formol à 4 % et 1 %. ATTENTION : Formolo/Formaldéhyde toxique par inhalation et en cas d’ingestion. Irritant pour les yeux, les systèmes respiratoires et la peau. Peut provoquer une sensibilisation par inhalation ou par contact avec la peau. Risque de lésions oculaires graves. Risque potentiel de cancer. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Solution saline équilibrée de Hanks 1xGibco14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)ATCCTIB-152https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Acides aminés non essentiels 100xHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIMilliporeSigma100220Une caméra à 2 caméras ImageStreamX Mark II équipée des lasers 405 nm, 488 nm et 642 nm a été utilisée. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
logiciel d’analyse MIFC - IDEAS 6.2MilliporeSigma100220Le logiciel compagnon du MIFC (ImageStreamX MKII).  ; Logiciel MIFC IDEAS version 6.2
- INSPIREMilliporeSigma100220Il s’agit du logiciel qui exécute le MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0
PE anti-humain CD107a (LAMP-1) Clone d’anticorps H4A3BioLegend328608http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
solution de péniclline/streptomycine/glutamine 100xHyCloneSV30082.1
Rinçage - Eau ultrapure ou eau déminéraliséeNANAVous pouvez utiliser n’importe quelle eau ultra-pure ou eau déminéralisée. Remplissez le récipient avec 900 ml de rinçage.
RPMI-1640 Moyen 1xHyCloneSH30027.01
Gaine - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BC’est le même que le Saline tamponné au phosphate 1X de Dulbecco. Ca++MG++ gratuit.  ; Remplissez le récipient avec 900 mL de gaine.
Microtubes à centrifuger en polypropylène siliconéFisherbrand02-681-320Fisherbran Tubes à centrifuger siliconés à faible rétention 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
solution de pyruvate de sodium (100 mM)HyCloneSH30239.01
Stérilisateur - 0,4 - 0,7 % HypochloriteVWRJT9416-1Il s’agit généralement d’un agent de blanchiment Clorox à 10 % qui peut être fabriqué en éluant l’eau de Javel Clorox avec de l’eau. Remplissez le récipient avec 200 ml de stérilisateur.
Réactif d’étalonnage du système - SpeedBeadMilliporeSigma400041Chaque tube contient ~10 mL.  ; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav  ;
Fiole T75Falcon353136
TRITON X-100, détergent PROTEIN GRADE, solution à 10 %,MilliporeSigma648463-50MLhttp://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
eau, qualité culture cellulaire.HyCloneSH30529.03
clone

Références

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