Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Résumé

Nous présentons une solution logicielle pour le suivi semi automatisé de la concentration relative de protéines sur toute la longueur des protrusions cellulaires dynamiques.

Résumé

Filopodia sont des protrusions cellulaires dynamiques, semblables à des doigts associées à la migration et à la communication cellule-cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes de signalisation complexes sous-jacents à l'initiation filopodiale, à l'allongement et à la stabilisation ou à la rétraction ultérieure, il est crucial de déterminer l'activité spatio-temporelle de la protéine dans ces structures dynamiques. Pour analyser la fonction des protéines dans filopodia, nous avons récemment développé un algorithme de suivi semi-automatisé qui s'adapte aux changements de forme filopodique, permettant ainsi une analyse parallèle de la dynamique de protrusion et de la concentration relative de protéines sur toute la longueur de la filopodie. Nous présentons ici un protocole détaillé étape par étape pour la gestion optimisée des cellules, l'acquisition d'images et l'analyse de logiciels. Nous fournissons également des instructions pour l'utilisation de fonctionnalités facultatives lors de l'analyse d'image et de la représentation des données, ainsi que des directives de dépannage pour toutes les étapes critiques en cours de route. Enfin, nous incluons également une comparaison de la dLogiciel d'analyse d'image écrited avec d'autres programmes disponibles pour la quantification de filopodia. Ensemble, le protocole présenté fournit un cadre pour une analyse précise de la dynamique des protéines dans les protubérances filopodiales à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image.

Introduction

Le contrôle spatio-temporel des protéines régulatrices d'actine est associé à la dynamique du filopodium ^{1 , 2} . Le suivi de la concentration de protéines spatialement résolue tout au long de la longueur filopodiale dans le temps est donc crucial pour faire progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'initiation, l'allongement, la stabilisation ou l'effondrement de ces structures dynamiques ^{3 , 4} . Contrairement à l'analyse des protéines dans le cytosol, où de nombreux changements de forme cellulaire se produisent....

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Culture HeLa ou cellules COS dans le milieu Eagle Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 4,5 g / L de D-glucose, dipeptide L-alanine-L-glutamine, pyruvate, 10% de sérum bovin fœtal et 10 unités / ml de pénicilline / streptomycine. Les neurones de la culture dans les milieux de culture sans L-glutamine, l'acide glutamique ou l'acide aspartique, additionnés de 0,5 mM de dipeptide L-alanine-L-glutamine, de suppléments neuronaux exempts de sérum et 10 unités / ml de pénicilline / streptomycine.
2. Une fois que la concentration de 40% est atteinte, transférez les cellules avec des constructions de choix en utilisant un ....

Résultats

En utilisant des cellules COS transfectées avec un marqueur pour l'actine filamenteuse (f-tractine ¹⁸ , rouge) et une référence cytosolique (vert), nous avons trouvé des protrusions filopodiales riches en actine ( figure 3A , panneau supérieur). Les séries chronologiques ont montré que les filopodes se prolongent et se rétractent rapidement ( figure 3A , panneau central). En utilisant le logiciel d.......

Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour le suivi de la dynamique de croissance filopodiale et l'analyse des concentrations protéiques relatives dans ces structures dynamiques via l'algorithme de coque convexe. En utilisant le logiciel, jusqu'à 3 canaux peuvent être comparés par paire dans une seule opération, de sorte que les concentrations relatives de deux canaux ( c'est-à-dire les protéines) sont déterminées tout au long du cycle d'extension / rétractation et stockées sous forme de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Life Technologies	31966-021
10 % sérum de veau fœtal	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-027
1 % pénicilline/streptomycine	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium Life	Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (solution mère 1M)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Institut DSMZ	ACC-60
3T3 cellules	Institut Leibniz DSMZ	ACC-59
Microscope	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Ultra
Confocal Unit	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvate	Gibco	31966-021