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Article de méthode

Fractionnement des membranes cérébrales: une

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DOI :

10.3791/55661

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12 mai 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unitat de Farmacologia, Departament Patologia i Terapèutica Experimental, Facultat de Medicina, IDIBELL, Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 2Institut de Neurociències, Universitat de Barcelona, 3Center for Neurosciences of Coimbra, Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Coimbra

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques.

Résumé

L'évaluation de la composition et de la fonction de la protéine synaptique constitue un défi important en neuroscience. Cependant, il n'est pas facile d'évaluer la neurotransmission qui se produit dans les synapses car elle est fortement réglementée par des interactions protéines-protéines dynamiques et des événements de phosphorylation. Par conséquent, lorsqu'une méthode est utilisée pour étudier la transmission synaptique, un objectif majeur est de préserver ces modifications physiologiques transitoires. Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques. En d'autres termes, le protocole décrit une méthodologie biochimique pour effectuer l'enrichissement en protéines à partir de compartiments présynaptiques, postsynaptiques et extrasynaptiques. Tout d'abord, les synaptosomes, ou les terminaux synaptiques, sont obtenus à partir de neurones qui contiennent tous les compartiments synaptiques au moyen d'un gradient discontinu de saccharose. Il est à noter que la qualité de cette préparation initiale de la membrane synaptique est cRitical. Par la suite, l'isolement des différents compartiments sous-synaptiques est obtenu avec une solubilisation légère à l'aide de détergents doux à des conditions de pH différentiel. Cela permet une séparation par gradient et centrifuges isopyciques. Enfin, l'enrichissement en protéines dans les différents compartiments sous - synaptiques ( c'est-à-dire les fractions membranaires pré, post et extrasynaptiques) est validé au moyen d'une analyse par immunoblot en utilisant des marqueurs de protéines synaptiques bien caractérisés (SNAP-25, PSD-95 et synaptophysine, Respectivement), ce qui permet une évaluation directe de la distribution synaptique de toute protéine neuronale particulière.

Introduction

La transmission synaptique repose sur l'intégrité physique de la synapse, concept qui a été envisagé dès 1897 par Foster et Sherrington 1 . Ainsi, la compréhension de la distribution de composants clés de neurotransmission ( p. Ex., Canaux ioniques, récepteurs, etc. ) est essentielle pour élucider la fonction synaptique, tant dans des conditions normales que pathologiques. La microscopie électronique (EM) a énormément contribué à la notion ultrastructurale actuelle des synapses prototypiques du système nerveux central (SNC). De telle manière, EM a établi avec précision les différences entre les densités pré et postsynaptiques, qui sont séparées par une fente d'une distance assez uniforme (~ 25 nm) 2 . Il est intéressant de noter que l'appareil postsynaptique présente un épaississement relativement continu et densifié par des électrons en dessous de sa membrane plasmatique, la densité dite post-synaptique ou PSD 2 . À l'inverse, à l'appareil présynaptique,Le réseau de cytomatricies discontinues est disposé juste sous la membrane plasmique, ce qui est essentiel à l'alignement et à l'amarrage des vésicules synaptiques à la zone active de la membrane plasmatique 3 . Par conséquent, EM constitue l'approche expérimentale dorée pour enquêter sur la répartition des protéines dans les synapses du SNC structurellement préservées. Cependant, les informations fournies par les micrographies électroniques sont statiques. En effet, les preuves accumulées montrent que les synapses in vivo sont extrêmement dynamiques, connaissant ainsi des changements structurels spectaculaires lors de la transmission synaptique soutenue. En outre, la morphologie et la composition des synapses peuvent varier dans différentes régions du SNC et sur le développement, la maturation, le vieillissement et le développement de conditions neuropathologiques. Dans l'ensemble, un protocole axé sur l'isolement des protéines appartenant à différents compartiments synaptiques dans des conditions physiologiques représente un outil précieux pour une étude plus complète du fonctionnement synaptique.

Ici, nous décrivons ce type d'approche expérimentale complémentaire, qui permet l'enrichissement biochimique préparatif des différents compartiments de membrane synaptique, à savoir les domaines de membrane extra, post-post-synaptique. Cette méthode de fractionnement de la membrane, décrite d'abord par Philips et al . (2001) 4 , est basé sur un changement de pH qui affaiblit les interactions adhésives se produisant dans l'appareil pré et post-synaptique. Tout d'abord, en utilisant des détergents doux à pH 6,0, il est possible de discerner la jonction adhérente qui détient l'appareil pré et post-synaptique et qui est maintenue à partir du domaine de la membrane extrasynaptique, qui est solubilisé et peut ainsi être extrait des contacts synaptiques. Par la suite, l'élévation du pH de 6,0 à 8,0 en présence de détergents doux affaiblit la résistance de la jonction adhérente qui maintient la zone active présynaptique étroitement liée à la densité postsynaptique. Par conséquent, le compartiment présynaptique est tellementLubilisé et peut être séparé de la densité postsynaptique, qui est principalement conservée car la concentration de détergent utilisée ne favorise pas sa solubilisation 4 . Fait intéressant, l'efficacité de fractionnement, éventuellement supérieure à 90%, peut être confirmée par différents marqueurs subsynaptiques: i ) protéine 25 synaptosomale associée (SNAP-25), de la zone active présynaptique; Ii ) la synaptophysine, à partir de la fraction extrasynaptique ( c'est-à-dire à l'extérieur de la zone active et incluant les microsomes); Et iii ) la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95), à partir de la densité postsynaptique. Notamment, cette méthode de fractionnement de la membrane du cerveau a été utilisée avec succès. En conséquence, il a été possible de déterminer précisément la localisation sous-synaptique de différents récepteurs, tels que les récepteurs de l'alpha-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) 5 , le récepteur de l'adénosine A 1 (A 1 R) 6 ,Les récepteurs de l'adénosine A 2A (A 2A R) 7 , les récepteurs P2 de l'adénosine triphosphate (ATP) 8 , les sous-unités du récepteur nicotinique de l'acétylcholine 9 et le récepteur GPR37 10 associé à la maladie de Parkinson. Cependant, un certain nombre de limitations peuvent entraver l'évaluation correcte de la distribution synaptique d'une protéine neuronale particulière. Ainsi, dans cette procédure, nous décrivons non seulement entièrement l'intégralité du protocole, mais nous mettons également en évidence certains points critiques à considérer, tels que la quantité de tissu assez importante nécessaire, le faible rendement en protéines et l'obligation obligatoire de valider l'efficacité de Chaque séparation avant d'effectuer l'expérience définie.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales animales ont été approuvées par le Comité d'utilisation et de soins des animaux (CEEA) de l'Université de Barcelone, conformément aux directives décrites dans le Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire 11 et à la suite de la Communauté européenne, loi 86/609 / CCE, FELASA et ARRIVE. Ainsi, les souris sont logées dans des cages standard, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau, et sont maintenues dans des conditions standard contrôlées (12 h de cycle sombre / léger à partir de 7 h 30, température de 22 ° C et 66% d'humidité).

1. Obtenir des synaptosomes du cerveau de la souris à l'aide d'un gradient de saccharose discontinue

Note: Cette méthode a déjà été rapportée 10 .

  1. Préparer un tampon d'isolement frais (IB), pH 7,4; 2 M de saccharose; 1 M de saccharose / CaCl 2 0,1 mM; Et CaCl 2 0,1 mM (voir tableau 1 ). Refroidir les solutions sur la glace.
  2. SaCrifice cinq souris par dislocation cervicale. Décapiter et éliminer rapidement le cerveau de chaque animal. Dissectez la région du cerveau d'intérêt (c.-à-d., L'hippocampe, 0,25 à 0,35 g de tissu frais) et placez-le dans un tube de verre Potter-Elvehjem de 5 ml sur de la glace avec 1 mL de IB.
  3. Homogénéiser le tissu à l'aide d'un agitateur d'homogénéisation (10 coups à 700 à 900 rotations par minute), préférentiellement dans un bain de glace pour empêcher le réchauffement de l'échantillon.
  4. Placez le tissu homogénéisé (1 ml) dans un tube de 15 ml contenant 6 ml de saccharose 2 M et 2,5 ml de CaCl2 0,1 mM à 4 ° C. Mélanger lentement en inversant le tube.
    Note: L'addition de calcium est essentielle au maintien des interactions adhésives entre les organites et donc à la préservation de la structure des différentes "densités".
  5. Mettre la solution dans un tube de centrifugation de 12 ml et ajouter lentement 2,5 ml de saccharose 1 M / CaCl 2 0,1 mM sur le dessus de chaque tube pour former le gradient de saccharose.
    Note: étiquetez la position oF l'interface dégradée sur le tube centrifuge à l'aide d'un marqueur permanent.
  6. Peser et équilibrer les tubes centrifuges avec une solution IB dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
  7. Centrifuger les tubes pendant 3 h à 100 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants. Remplissez complètement le rotor avec tous les supports d'acier (même vides, si nécessaire).
  8. Jeter la couche supérieure contenant de la myéline. Avec une pipette Pasteur, collectez la bague blanche entre l'interphase de saccharose 1.25-M et 1-M correspondant à la fraction de synaptosome.
  9. Diluer les synaptosomes avec 9 fois leur volume en utilisant un tube à centrifuger.
  10. Peser et équilibrer les tubes centrifuges avec une solution IB dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
  11. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 15 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants.
  12. Jeter le surnageant et ré-endiguerE granule avec 1,1 ml de solution d'IB. Recueillir 100 μL de cette solution synaptosomale et centrifuger pendant 5 min à 11 000 x g et 4 ºC.
  13. Remettre en suspension la pastille synaptosomale dans du dodécylsulfate de sodium à 5% (SDS) et stocker cet échantillon à -20 ° C.
    Note: Cet échantillon correspond à la fraction totale de synaptosome pour une analyse ultérieure de Western-blot. La fraction synaptosomale restante (~ 1 mL) peut être congelée à -20 ºC jusqu'à l'utilisation ou traitée pour le fractionnement subsynaptique subséquent. Les synaptosomes ou les synapses purifiées représentent entre 1 et 2% du volume total de l'hippocampe 12 .

2. Isolation avant, post et extrasynaptique

  1. Préparer 2 fois de tampon de solubilisation fraîche, pH 6,0; 1x tampon de solubilisation, pH 6,0; Tampon de solubilisation, pH 8,0; Et CaCl 2 0,1 mM (voir tableau 1 ). Refroidir les solutions sur la glace.
    Note: Le pH de ces solutions devrait être préciséEt ajusté pour obtenir un bon fractionnement sous-synaptique.
  2. Diminuer lentement la fraction synaptosomale restructurée de 1 ml (voir étape 1.12) avec 5 mL de CaCl2 0,1 mM.
  3. Ajouter le même volume (5 ml) de tampon de solubilisation 2x glacé, pH 6,0, et incuber pendant 50 minutes sur de la glace sous forte agitation dans un bécher sur glace.
    Note: Alors que 1% de Triton X-100 à pH 6,0 solubilise toutes les protéines de la membrane plasmique, elle conserve les protéines dans les contacts synaptiques ou les jonctions ( c'est-à-dire les structures pré et post-synaptiques) 4 .
  4. Placez la solution dans un tube centrifuge. Pesez et équilibrez les tubes avec des volumes équivalents de 0,1 mM de solution de tampon de solubilisation CaCl 2 et 2x, pH 6,0, dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
  5. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 40 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants. Le surnageant résultant représente la fraction extrasynaptique,Et la pastille correspond aux jonctions synaptiques ( c.-à-d., Fractions pré et post-synaptiques).
  6. Concentrer le surnageant contenant la fraction extrasynaptique à un volume final de 200 μl en utilisant un tube de filtration de 15 mL 10K centrifugé à 4.000 xg et 4 ºC.
  7. Précipiter la fraction extrasynaptique concentrée résultante (200 μL) avec 5 volumes (1 ml) d'acétone pré-refroidie (-20 ° C) pendant une nuit à -20 ° C.
  8. Le lendemain, centrifuger la fraction extrasynaptique pendant 30 min à 18 000 x g et -15 ° C. Après centrifugation, jeter le surnageant d'acétone et sécher la pastille pour éliminer toute trace d'acétone.
  9. Enfin, remettez en suspension la pastille contenant les protéines extrasynaptiques avec 200 μL de SDS à 5%. Sonicate la pastille, si nécessaire.
  10. Sans le perturber, laver soigneusement le culot contenant les fractions pré et post-synaptique avec 2 ml de 1x tampon de solubilisation, pH 6,0. Jeter le tampon.
  11. ResuspendreLa pastille avec 10 ml de 1x tampon de solubilisation, pH 8,0, en utilisant une pipette Pasteur de verre.
    Note: Alors que 1% de Triton X-100 à pH 8,0 solubilise la spécialisation présynaptique, il conserve la densité postsynaptique insoluble 4 .
  12. Incuber la suspension pendant 50 minutes sur de la glace sous forte agitation dans un bécher sur glace.
  13. Placez la solution dans un tube centrifuge. Peser et équilibrer les tubes avec une solution tampon de solubilisation 1x, pH 8,0, dans leurs supports d'acier correspondants et avec leurs couvercles de fermeture.
  14. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 40 000 x g et 4 ° C à l'aide d'une centrifugeuse à rotor à godets oscillants; Le surnageant résultant correspond à la fraction présynaptique et à la pastille à la fraction postsynaptique.
  15. Traiter le surnageant contenant la fraction présynaptique, comme décrit aux étapes 2.6-2.9.
  16. Remettre en suspension la fraction postsynaptique contenant des pastilles avec 200 μL de SDS à 5%. Sonicate the pellet, iF requis.

3. Analyser les échantillons par immunotransfert pour valider le fractionnement de la membrane

  1. Déterminer la quantité de protéines dans chaque fraction ( c.-à-d., Les fractions totale, extra, pré et post-synaptique) en utilisant le dosage des protéines d'acide bicinchoninique.
  2. Prendre 20 μg de protéines de chaque fraction et la diluer jusqu'à un volume final de 50 μL dans un tampon d'échantillon de SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Faire bouillir pendant 5 min à 100 ° C.
  3. Séparez les protéines par électrophorèse SDS-PAGE 10%, avec un gel concentrant à 4% dans des conditions réductrices. Electrophorèse à tension constante de 80 V jusqu'à ce que le colorant entre dans le gel inférieur puis augmente la tension à 120 V.
  4. Transférer les protéines dans une membrane PVDF et bloquer avec une solution bloquant IB pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation continue.
  5. Incuber la membrane pendant une nuit à 4 ºC avec l'anticorps primaire indiqué ( c.-à-d. Anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptophysine ou anti-GPR37) dilué dans une solution de blocage d'IB sous agitation continue.
  6. Laver la membrane trois fois (10 minutes chacune) avec une solution de lavage IB pour éliminer l'anticorps primaire non lié.
  7. Incuber avec l'anticorps secondaire indiqué pendant 90 minutes dans des conditions sombres à température ambiante sous agitation continue.
  8. Laver la membrane trois fois (10 min chacune) avec une solution de lavage IB pour éliminer les anticorps secondaires non liés.
  9. Incuber la membrane avec un substrat chimioluminescent (préparer le mélange dans des conditions sombres et suivre la proportion 1: 1 de la solution A et B fournie par le fabricant).
  10. Analyser la membrane dans un dispositif de détection chimioluminescente.

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Résultats

La méthodologie décrite a été largement utilisée pour l'analyse sous-synaptique des protéines neuronales en général et pour l'isolement et la caractérisation biochimique des récepteurs synaptiques 5 , 6 , 7 , 8 , 9 en particulier. Fait intéressant, le résultat représentatif affiché ici montre l'utilité de cette pro...

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Discussion

Le protocole présenté ici constitue un outil biochimique puissant pour l’étude de la distribution sous-synaptique de protéines spécifiques au sein de n’importe quelle région du cerveau. Cependant, il existe quelques inconvénients inhérents à la technique qui méritent d’être soulignés ici. Par exemple, l’une des principales limitations est la quantité relativement importante de tissu nécessaire pour purifier une quantité raisonnable de protéines afin d’effectuer l’analyse immunoblot de toutes les fractions sous-synaptique...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Ministère de l'économie et de la compétitivité / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 et PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), Et Agentchap voor Innovatie porte Wetenschap en Technologie (SBO-140028) à FC En outre, X. M, VF-D. Et FC appartiennent au groupe de recherche accrédité "Neuropharmacologie et Douleur" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Le travail a également été soutenu par le "Investigateur Visitante Especial-Ciência Sem Fronteiras" de CAPES (Brésil) à FC

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
saccharosepancréatique ; mica SL, Barcelone, Espagne1 316 211 211
CaCl2Pancréac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne2 112 211 210
MgCl2· ; 6H2OPancréas Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne1,313,961,210
Cocktail d’inhibiteurs de protéase Set IIIMillipore, Darmstadt, Allemagne535140
Trizma BaseSigma, St. Louis, MO, USAT1503
Tris-HClPancréac ; mica SL, Barcelone, Espagne1,236,541,209
Triton X-100Sigma, St. Louis, MO, USAX100
SDSSigma, St. Louis, MO, USAL3771
GlycérolSigma, St. Louis, MO, USAG5516
Bromophenol BluePancréac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne1 311 651 604
DithiothreitolSigma, St. Louis, MO, USAD0632
Tween 20Sigma, St. Louis, MO, USAP2287
Lait
NaClPancréac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne1 216 591 211
KClPancréas Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne1 314 941 210
KH2PO4Merck4873
Na2HPO4Pancreac Quí ; mica SL, Barcelone, Espagne1,316,781,211
Basic 20 pHCrison, Alella, Espagne
Polytron VDI 12 Homogénéisateur adaptableVWR, Radnor, PA, États-Unis.
Tubes ultra-transparents (14x89mm)Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelone344059Les tubes doivent être remplis presque complètement lorsqu’ils sont utilisés pour éviter l’effondrement dû à l’ultracentrifugation.
Filtres centrifuges Amicon Ultra-15 Ultracel -10KMerck Millipore, Darmstadt, AllemagneUFC901008
Centrifugeuse 5430REppendorf, Hamburgo, Allemagne
Ultracentrifugeuse Optima L-90KBeckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600GE Healthcare Europe GmbH, Barcelone, Espagne
Verre jetable Pasteur Pippetes 230 mmVWR, Radnor, PA, USA612-1702
Balance compacte EK-610A& D, Tokyo, Japon
Pierce&trade ; Kit de dosage des protéines BCAPierce Biotechnology, Rockford, IL, États-Unis
Substrat pico-luminescent SuperSignal west ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis GR
200 Balance de précisionA& D, Tokyo, Japon
Anti-GPR37Anticorps anti-GPR37 fait maison produit et validé dans le laboratoire Francisco Ciruela.Les anticorps primaires utilisés à une concentration finale de 0,250 &mu ; g/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysineAbcam, Cambridge, Royaume-UniAnticorps primaires dilués 1:10 000
IgG de chèvre conjugués HRPThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis.Anticorps secondaire dilué 1:10 000
HRP chèvre anti-lapin IgGThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis.Anticorps secondaires dilués 1:30 000
écrémé en poudre

Références

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  2. Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
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