Fractionnement des membranes cérébrales: une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche pour évaluer la localisation des protéines sous-synaptiques

Xavier Morató; Marc López-Cano; Paula M. Canas; Rodrigo A. Cunha; Francisco Ciruela

doi:10.3791/55661

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Article de méthode

Fractionnement des membranes cérébrales: une

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DOI :

10.3791/55661

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12 mai 2017

Xavier Morató^*¹^,² , Marc López-Cano^*¹^,² , Paula M. Canas³ , Rodrigo A. Cunha³ , Francisco Ciruela¹^,²

¹Unitat de Farmacologia, Departament Patologia i Terapèutica Experimental, Facultat de Medicina, IDIBELL, Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, ²Institut de Neurociències, Universitat de Barcelona, ³Center for Neurosciences of Coimbra, Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Coimbra

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques.

Résumé

L'évaluation de la composition et de la fonction de la protéine synaptique constitue un défi important en neuroscience. Cependant, il n'est pas facile d'évaluer la neurotransmission qui se produit dans les synapses car elle est fortement réglementée par des interactions protéines-protéines dynamiques et des événements de phosphorylation. Par conséquent, lorsqu'une méthode est utilisée pour étudier la transmission synaptique, un objectif majeur est de préserver ces modifications physiologiques transitoires. Ici, nous présentons un protocole de fractionnement de la membrane du cerveau qui représente une procédure robuste pour isoler les protéines appartenant à différents compartiments synaptiques. En d'autres termes, le protocole décrit une méthodologie biochimique pour effectuer l'enrichissement en protéines à partir de compartiments présynaptiques, postsynaptiques et extrasynaptiques. Tout d'abord, les synaptosomes, ou les terminaux synaptiques, sont obtenus à partir de neurones qui contiennent tous les compartiments synaptiques au moyen d'un gradient discontinu de saccharose. Il est à noter que la qualité de cette préparation initiale de la membrane synaptique est cRitical. Par la suite, l'isolement des différents compartiments sous-synaptiques est obtenu avec une solubilisation légère à l'aide de détergents doux à des conditions de pH différentiel. Cela permet une séparation par gradient et centrifuges isopyciques. Enfin, l'enrichissement en protéines dans les différents compartiments sous - synaptiques ( c'est-à-dire les fractions membranaires pré, post et extrasynaptiques) est validé au moyen d'une analyse par immunoblot en utilisant des marqueurs de protéines synaptiques bien caractérisés (SNAP-25, PSD-95 et synaptophysine, Respectivement), ce qui permet une évaluation directe de la distribution synaptique de toute protéine neuronale particulière.

Introduction

La transmission synaptique repose sur l'intégrité physique de la synapse, concept qui a été envisagé dès 1897 par Foster et Sherrington ¹ . Ainsi, la compréhension de la distribution de composants clés de neurotransmission ( p. Ex., Canaux ioniques, récepteurs, etc. ) est essentielle pour élucider la fonction synaptique, tant dans des conditions normales que pathologiques. La microscopie électronique (EM) a énormément contribué à la notion ultrastructurale actuelle des synapses prototypiques du système nerveux central (SNC). De telle manière, EM a établi avec précision les différences entre les densités pré et postsynapti....