Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l'étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

Résumé

Ce protocole décrit l'isolement et la culture de cellules intestinales petites souris mixtes. Ces cultures primaires intestinales permettent l'étude des voies de signalisation sous-jacents sécrétion de peptide de l'intestin en utilisant un certain nombre de techniques.

Résumé

L'intestin est le plus grand organe du système endocrinien du corps, avec l'hormone sécrétant des cellules entéro-endocrines situées le long de la longueur de l'épithélium gastro-intestinal. En dépit de leur importance physiologique, les cellules endocrines ne représentent qu'une petite fraction de la population des cellules épithéliales et dans le passé, leur caractérisation a présenté un défi considérable qui entraîne une dépendance à l'égard des modèles de lignées cellulaires. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement et la culture de cellules intestinales petites souris mixtes. Ces cultures primaires ont été utilisées pour identifier les voies de signalisation qui sous-tendent la stimulation et l'inhibition de la sécrétion de peptide intestinal en réponse à un certain nombre de nutriments et neuropeptides ainsi que des agents pharmacologiques. En outre, en combinaison avec l'utilisation de souris transgéniques reporter fluorescentes, nous avons démontré que ces cultures primaires devenir un outil puissant pour l'examen des cellules entéro-endocrines marqués par fluorescence dans letracellular niveau, en utilisant des procédés tels que le serrage de la pièce et le calcium-cellule unique et d'imagerie cAMP-FRET.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est d'isoler les cellules intestinales murins mixtes et de culture pour permettre l'étude de la sécrétion de peptide intestinal et l'imagerie des cellules vivantes des cellules endocrines. Une première version de cette procédure a été publiée en 2008 par Reimann et al. ¹ et a depuis constitué la base de 20 autres publications de notre groupe. Pour ce manuscrit, nous avons choisi de mettre l'accent sur les petites cultures intestinales car ils sont plus difficiles à établir que les cultures du côlon.

Des cellules entéro - endocrines sécrètent une matrice de peptides intestinaux , y compris le peptide de type glucagon 1 (GLP-1), insulinotrope dépendant du glucose peptide (GIP), la cholécystokinine (CCK) et le peptide YY (PYY) ^2. Ces peptides intestinaux ont un rôle physiologique important dans l'organisation des réponses postprandiale telles que le ralentissement du transit intestinal, potentialisation de la libération d'insuline stimulée par le glucose et l'induction de la satiété. GLP-1 a mimétiquesnd médicaments qui inhibent la dégradation sont actuellement homologués pour le traitement du diabète de type 2 et il est en cours d' évaluation du potentiel thérapeutique de stimuler la sécrétion endogène de ce peptide ^3. Une meilleure compréhension de la physiologie entéroendocrine et les mécanismes par lesquels la sécrétion est soit stimulée ou inhibée est donc d'une importance capitale.

Gut sécrétion de peptide peut être étudiée en utilisant une variété de modèles in vitro et ex vivo expérimentaux, chacun des avantages et des inconvénients (pour une revue récente complète qui couvre également l'utilisation de modèles in vivo voir Svendsen et al. ^4). Techniques ex vivo , tels que les intestins perfuses isolés ⁵ et ⁶ des chambres de Ussing sont actuellement utilisés pour explorer la sécrétion de peptide de l' intestin en réponse à diverses substances. Le principal avantage de ces méthodes,par rapport à des cultures primaires, est que l'environnement immédiat des cellules entéro-endocrines reste largement intact et, surtout, la polarité des cellules est préservée. Par conséquent, il est possible d'obtenir des informations au sujet de laquelle la surface cellulaire un sécrétagogue agit sur ^6. Cependant, ceux-ci sont généralement des techniques à faible débit et la qualité des données qui en découlent repose en grande partie sur l'intégrité et la viabilité du tissu intestinal, qui diminuent inévitablement au fil du temps.

Organites sont maintenant de plus en plus Intestinal utilisés comme modèles in vitro pour l'étude de la fonction des cellules entéroendocrine et le développement ^7. Organites, qui peuvent être dérivées à la fois de souris et les tissus humains, ont l'avantage de former des structures « cryptiques-like » 3D qui maintiennent la polarité des cellules en culture. Cependant, les cellules endocrines organoïdes dérivées doivent encore être pleinement caractérisés et leur ressemblance avec natif L cells reste largement inconnu. Les cultures primaires ont l'avantage d'être un pas de plus vers la mise physiologique, que les cellules endocrines ne sont pas maintenues et différenciées dans des conditions artificielles pour des périodes de temps prolongées.

Procédé de culture primaire de remplacement qui a été utilisée pour l'évaluation de la sécrétion de peptide intestinal est l'isolement des cellules intestinales de rat foetal ⁽⁸⁾ de FRICS. Cependant, la culture du tissu intestinal adulte a rencontré moins de succès et quelques différences ont été observées dans la réactivité des FRICS contre les cellules intestinales de souris adultes (par exemple de glucose ^8).

Des lignées de cellules entéro - endocrines de type (par exemple GLUTag, SC-1 et NCI-H716) ont traditionnellement été utilisés pour distinguer directe vs. des effets indirects sur les cellules entéro-endocrines et pour disséquer mécanismes moléculaires sous-jacents stimulus couplage à la sécrétion; voir Kuhre et al . ⁹ pour la production de peptide et de la sécrétion par les cellules en forme de L 'lignées cellulaires immortalisées. Cela a été nécessaire que les cellules endocrines, disséminées le long du tractus gastro - intestinal, constituent un peu moins de 1% des cellules épithéliales intestinales ¹⁰ et cellules triées, entre nos mains, ne survivent pas dans la culture ^1. Les lignées cellulaires restent des outils utiles en raison du fait qu'ils sont une population cellulaire largement homogène qui est propice à des manipulations génétiques telles que la neutralisation des gènes. Par conséquent, il est facile d'étudier le rôle des protéines qui ne peuvent pas être ciblés sur le plan pharmacologique, lorsque des souris transgéniques ne sont pas disponibles. Cependant, les lignées cellulaires ne sont pas toujours des modèles valides de cellules primaires. Bien qu'il existe de nombreuses similitudes, les résultats des cultures primaires ont parfois mis en évidence des différences dans les voies de signalisation activées par certains nutriments dans les cellules primaires L par rapport aux cellules GLUTag, par exemple (par exemple. Peptones 11). Fondamentalement, en combinaison avec des souris transgéniques reporter fluorescentes, le modèle de culture primaire permet un examen détaillé de cellules entéro-endocrines primaires individuels au niveau intracellulaire. Les cellules L par fluorescence marqués au sein de cultures primaires ont été utilisés par notre groupe pour le patch de serrage ^{1, 12} études et de calcium des cellules individuelles ^{11, 13} et de l' adénosine cyclique imagerie monophosphate-FRET ¹⁴ études, qui ont donné des avancées significatives dans le domaine de entéroendocrine physiologie.

Le protocole suivant est optimisée pour réaliser des expériences de sécrétion, en utilisant une plaque à 24 puits ou pour la préparation d'un maximum de 16 plats d'imagerie, à partir d'une section de 10 cm de l'intestin grêle à partir d'une seule souris adulte. Le protocole peut être facilement modifié pour l'étude des cellules du côlon en augmentant les temps de digestion et coconcentration llagenase.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvées par l'Université de Cambridge et du bien-être animal du corps examen éthique et conformées aux animaux (procédures scientifiques) de la Loi de 1986 Règlement Amendement (SI 2012/3039).

1. Préparation à l'avance

1. Placer une aliquote de la matrice de la membrane basale (BMM) (~ 200 pi) sur la glace au dégel.
   NOTE: Le BMM se solidifie à température ambiante (RT).
2. Pré-chaud 50 ml Dulbecco stérile à haute glucose Modified Eagle Medium (DMEM) (sans additifs) et ~ 40 ml de milieu de culture stérile (DMEM riche en glucose additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U de pénicilline / ml et 0,1 mg / ml de streptomycine (P / S), et 2 mM de L-glutamine) dans des tubes de centrifugation de 50 ml dans un bain d'eau à 37 ^o C.
3. Pré-refroidissement du calcium et de magnésium contenant de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
4. Peser 15 mg de collagénase (XI brut), ajouter à un tube de centrifugation de 50 ml et le maintenir sur de la glace.
   1. ATTENTION: collagénase est nocif. Il provoque une irritation de la peau (H315) et irritation des yeux (H319). Il peut causer des symptômes d'allergie ou d'asthme ou des difficultés respiratoires par inhalation (H334). Il peut provoquer une irritation des voies respiratoires (H335). Utiliser un équipement de protection individuelle approprié, d'éviter la formation de poussière et éviter de respirer les poussières. Assurer une aération suffisante.

2. Collection de tissus

1. Ajouter ~ 20 ml de milieu L-15 à un tube de centrifugeuse de 50 ml et placez-le sur la glace.
2. Euthanasier une souris par dislocation cervicale, ou toute autre méthode annexe 1 approuvé.
   REMARQUE: le tissu intestinal est typiquement obtenu à partir de souris sur un fond C57BL6. Cependant, d' autres milieux génétiques ont également été utilisés , par exemple 129 / SvEv ^15. Des expériences d'imagerie nécessitent l'utilisation de souris rapporteurs fluorescents par exemple Glu-Venus ^1. Le tissu est obtenu à partir de souris adultes (2-6 mois) des deux sexes. Les souris sont logées dans individuacages ventilé lly avec ad libitum accès à l' eau et chow régulière. Cependant, des expériences pour tester l'effet d'un régime alimentaire riche en matières grasses, par exemple, sur la fonction cellulaire entéroendocrine ¹⁶ peut être réalisée si elle est soutenue par une licence de projet.
3. Disséquer et retirer doucement l'intestin de souris (de pylore et le début du rectum) à l'aide des pinces et des ciseaux de dissection. Conservez-le dans milieu L-15 sur la glace jusqu'à prêt à l'emploi.

3. Préparation des tissus

1. Placer le tissu intestinal dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant du PBS suffisant pour couvrir le tissu. Prendre 10 cm de tissu souhaité (par exemple , l' intestin grêle supérieur, haut, 10 cm de pylore distaux).
2. Rincer le contenu intestinal à l' aide d' une pipette Pasteur en matière plastique et PBS refroidi.
   1. En utilisant des pinces, délicatement préhension d'une extrémité du segment intestinal et placer la pointe d'une pipette Pasteur en elle. Rincez le contenu avec PBS refroidi. Répétez des deux extrémités jusqu'à ce que la majorité du contenu a été débusqué. Transfert à une boîte de Pétri contenant du PBS propre fraîches, réfrigérées.
3. En utilisant des pinces, enlever le tissu adipeux et méso, en prenant soin de ne pas retirer la couche musculaire en même temps.
4. Peler la couche musculaire off « comme une chaussette » sous un microscope à dissection en utilisant deux jeux de pinces fines.
   REMARQUE: Cette étape est pas indispensable mais est fortement recommandée. Il existe d'autres façons d'éliminer la couche musculaire à celle décrite ici. Par exemple, l'intestin peut être coupée longitudinalement ouverte en premier, avant l'enlèvement de la couche de muscle.
   1. Trouver un point de départ à l'extrémité proximale plus du tissu où il y a un volet visible du muscle. Tirez doucement loin une petite quantité de la couche musculaire tout autour de l'intestin.
      NOTE: Pour éviter la déchirure de la couche de muscle ou de l'épithélium intestinal, de réduire la force de tension par serrage d'une plus grande surface au lieu d'utiliser le tips des pinces fines.
   2. Fixer l'intestin et comme une grande partie du lambeau musculaire possible, tirez doucement en dehors et commencer à décoller la couche musculaire autour de l'intestin. Pour éviter de déchirer à la fois la couche musculaire et de l'épithélium, maintenir la position de réajustant la pince pour les garder proches. De cette manière, éliminer la couche musculaire de la totalité de la longueur du segment intestinal et le jeter.
5. Couper l'intestin ouvert longitudinalement et laver par tourbillonnant dans une boîte de Pétri propre avec du PBS frais, réfrigérés. Répétez si nécessaire pour éliminer toute chyme ou de mucus restant.
6. Mince tissu avec une lame de scalpel chirurgical pour réaliser des carrés de 1-2 mm ~ ² et les ajouter à ~ 20 ml de PBS refroidi dans un tube de centrifugation de 50 ml en utilisant une pipette Pasteur. Pour éviter les morceaux de tissu coller à la pipette, couper la pointe et mouiller la pipette par trituration avec du PBS.
7. Secouer doucement le tube pour laver davantage les morceaux de tissu. Laisser le tissu pour régler et verser ou pipette au large de la majorité du PBS et répéter avec du PBS frais jusqu'à ce que le PBS semble claire.

4. Préparation de la plaque à revêtement BBM / Plats et Digestion moyen
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire (avec les étapes d'incubation dans un bain d'eau à 37 ° C).

1. Préparer une solution BMM 2% dans du DMEM frais (sans additions). Tout en travaillant, maintenir la solution sur la glace. Pour une solution à 2%, ajouter 140 uL décongelé BMM à 7 ml de DMEM (suffisamment pour préparer une plaque à 24 puits).
   1. Ajouter 250 uL de 2% solution BMM par puits (plaque 24 puits) ou par boîte d'imagerie à fond de verre.
   2. Incuber les plaques / plats couchés pendant au moins 30 min dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une polymérisation suffisante de la BMM.
2. Ajouter le DMEM (sans additions) de la collagénase 15 mg préchauffé 50 ml ( à partir étapes 1,2 et 1,4) pour former une solution à 0,3 mg / mL et inverser la dissolution.
   1. SurCE complètement dissous, en utilisant une seringue de 20 ml, on filtre la solution de collagénase à travers un filtre stérile de 0,2 um dans un nouveau tube de centrifugation stérile de 50 ml. Étiquette ce que le milieu de la digestion.

5. La digestion des tissus

1. Retirer les morceaux de tissu de la PBS en utilisant une pipette sérologique de 10 ml et ajouter à un tube de centrifugation stérile de 50 ml contenant du DMEM stérile frais (sans additions), tourbillon, puis retirer DMEM.
   REMARQUE: Pour éviter de coller le tissu à la pipette sérologique, humide par trituration avec DMEM avant le contact avec le tissu.
2. 1 et 2 « Digest »: Elimination des débris cellulaires et des cellules individuelles
   1. Ajouter milieu de digestion 7 ml aux morceaux de tissu et de donner le tube un tourbillon.
   2. Incuber pendant 5 min dans un bain-marie à 37 ° C.
   3. Secouer doucement (non tourbillonner) pour le tube ~ 3 s.
   4. Laisser le tissu à établir et à rejeter le milieu de la digestion, réservant unepetit volume à regarder sous le microscope.
      REMARQUE: Surtout lors du démarrage, il est fortement recommandé d'inspecter un petit volume de chaque « digérer » (~ 30 pi) sous le microscope pour évaluer les progrès du processus de digestion. Si plusieurs cryptes sont observés à ce stade, l'agitation peut être trop forte. Pour des images représentatives de ce que les différentes étapes « digérer » présentera comme suit , reportez - vous à la figure 1.
   5. Répétez les étapes 5.2.-5.2.4 (avec un milieu de digestion frais).
3. ' Les résumés de 3 à 5: Collection de fragments cryptiques
   1. Ajouter milieu de digestion 7 ml au tissu.
   2. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
      1. Au cours de l'incubation, agiter toutes les 5 min pour 10-12 s.
         NOTE: L'agitation est plus vigoureuse que l'agitation pendant « » digestions 1 et 2.
   3. Laisser les tissus non digérés de régler et de recueillir le milieu de la digestion dans un tube de centrifugation de 15 ml. Sile tissu est accidentellement recueilli avec le milieu, le laisser décanter, éliminer à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et le transférer vers le tube de centrifugeuse de 50 ml contenant le tissu non digéré.
   4. Centrifugeuse moyen / surnageant recueilli à la température ambiante pendant 3 min à 100 x g.
   5. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 milieu de culture préchauffée ml par trituration douce et mettre de côté.
   6. Inspecter un petit volume de la suspension cellulaire au microscope (voir note de l'étape 5.2.4).
      NOTE: Dans l'idéal, des fragments crypte commencent à apparaître dans « digérer » 3 ainsi que des débris cellulaires et des cellules individuelles. « » Les résumés 4 et 5 contiennent un nombre significativement plus élevé de fragments cryptiques avec les débris cellulaires réduite (Figure 1). Régler secouer l' intensité nécessaire à savoir si le tissu ne digère et des fragments de la crypte n'apparaissent pas, secouez plus vigoureusement.
   7. Répétez les étapes 5.3.1-5.3.6 jusqu'à 5 « » ont été DIGESTSterminé ou jusqu'à ce que la majorité du tissu a été digéré (un peut être nécessaire digest 6 ^e).
   8. Une fois que tous les surnageants de 3-5 'de digestion de (ou 6.3) ont été recueillies, centrifuger le produit de digestion surnageants à température ambiante pendant 3 minutes à 100 x g.
   9. Pour les expériences de sécrétion, combiner les surnageants de « digestions » 3-5 (ou 3-6) avant la centrifugation.
      REMARQUE: moins de tissu est nécessaire pour des expériences d'imagerie, donc choisir le surnageant de digestion qui est la plus propre (absence de débris cellulaires et des cellules individuelles) avec le plus grand nombre de fragments de la crypte. Ceci est généralement « digérer » 4 ou 5.
   10. Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot en triturant jusqu'à ce qu'aucun amas sont visibles. Remettre en suspension le culot dans du milieu de culture préchauffé additionné de 10 uM Y-27632 dichlorhydrate (pour empêcher anoikis ^17). Utilisez 5 ml pour les expériences de sécrétion et 2 ml de milieu de culture pour des expériences d'imagerie.
   11. Filtresuspension de cellules à travers un filtre de 100 um (pour éliminer tout tissu non digéré). Exécuter un supplément de 2 ml de milieu de culture préchauffé à travers le filtre de lavage (volume total: 7 ml et 4 ml pour la sécrétion et l'imagerie, respectivement).
       NOTE: Le filtrage est pas essentiel, cependant, des fragments de tissus plus grands tendent à ne pas adhérer à la plaque / plats.

Figure 1: Des images représentatives de « digestion » de la méthode de culture primaire petit intestin. (A) un matériau contenant typique de « digestion » 1 et 2 principalement des cellules individuelles et les débris cellulaires. (B) Un exemple de produits de « digérer » 3. Les flèches noires indiquent des fragments cryptiques apparaissant dans le matériau à digérer. (C) de type 'digest' 4 ou 5. Panneau (D) représente rassemblées digérer la matière à partir de« digestions » 3-5 passé à travers un filtre de 100 um pour éliminer les fragments de tissus indésirables observés dans les grandes (C). Toutes les images ont été prises à l'aide d'un microscope inversé numérique avec un objectif 20X. Les barres d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

6. Revêtement Cultures intestinales (enrichie pour les cellules des cryptes)

1. Retirer l'excès de solution BMM de la plaque ou de la vaisselle, et ajouter 250 pi de milieu de culture préchauffée par sécrétion bien.
   REMARQUE: Les plats imagerie sont laissés sans moyen donc passer à l'étape suivante rapidement pour empêcher le plat de sécher.
2. Plate suspension de cellules 250 pl par puits (plaque 24 puits) ou par boîte à fond de verre.
   1. goutte à goutte plaque dans un mouvement « zig-zag » lent à travers le puits. Permettre aux fragments cryptiques de se déposer pendant environ 5 min avant de déplacer la plaque de thincubateur e.
      NOTE: Cela devrait encourager une répartition équitable des cryptes / cellules dans le puits.
3. Incuber la plaque ou de la vaisselle pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO _2.
   NOTE: Une monocouche « parcellaire » aurait dû faire. Pour une image représentative des cultures suivantes trois lavages, voir la figure 2A.
4. plats d'imagerie « inondation » avec 2 ml de milieu de culture préchauffé par boîte.
   NOTE: Ces plats seront adaptés pour l'imagerie jusqu'à ~ 72 heures après placage. cultures durent généralement plus longtemps colique, jusqu'à 7 jours. Les cellules qui n'ont pas adhéré peuvent être éliminés par une étape de lavage. Les cultures primaires sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences.

Résultats

L'utilisation des étapes de digestion série permet la collecte d'une préparation relativement propre des fragments de la crypte à plaquer pour des expériences. Les deux premiers digestions supprimer principalement des cellules individuelles et les débris cellulaires à partir du matériau de digestion (figure 1A). Au cours de la troisième digestion, les fragments cryptiques apparaissent dans la matière digérée (figure 1B). Digère 4 et 5 donnent un plus grand nombre de fragments cryptés avec moins de cellules simples (Figure 1C). Filtrer le matériau mis en commun à partir de digestions 3-5 élimine les gros morceaux de tissu non digéré, ce qui peut nuire à la culture, la production d' une préparation de fragment de cryptage propre (Figure 1D).

À la suite de 18 à 24 h de culture, des monocouches de cellules intestinales petites primaires sont observées (figure 2A). En utilisant des cultures provenant des souris transgéniques exprimant spécifiquement le calCapteur fluorescent cium, GCaMP3, sous le contrôle du promoteur du proglucagon ^11, les cellules L sont faciles à identifier et entrecoupées dans la culture (figure 2B). Dans des cultures primaires de petits intestinaux, des composés ciblant le G _q -Ca ²⁺ _i et _i cAMP dépendante voies ont stimulé la sécrétion de GLP-1 (pour la méthodologie de l' essai de sécrétion voir Reimann et al. ^1). Bombésine (BBS, 100 nM) et la co-application de forskoline et de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (F / I, 10 uM chacun) ont déclenché un 2 et 11 fois, la stimulation de la libération de GLP-1 par rapport à de base, respectivement (figure 2C). Expression spécifique des cellules L de GCaMP3 permet l'identification et la surveillance en temps réel de la mobilisation du calcium dans les cellules individuelles L. Les deux 100 nM bombésine (BBS) et 30 mM de chlorure de potassium (KCl) ont stimulé des augmentations transitoires de calcium intracellulaire indicatives de la G connue _{q <}/ sub> - et les voies électrogènes couplés dans des cellules primaires de L (Figure 2D).

Figure 2: Des données représentatives provenant de cultures primaires intestin grêle. Exemple images de petites cultures primaires intestinales mixtes utilisées pour (A) et la sécrétion des expériences d'imagerie (B) Poste de placage 24 h. (A) Image en prise à partir d' une plaque à 24 puits, en utilisant un microscope inversé numérique avec un objectif 4x. Barre d'échelle = 500 um. (B) En utilisant GLU-Cre x souris ROSA26 GCamP3, les cellules L dans le champ de vision (cellules vertes) ont été identifiés par la fluorescence de GCaMP3. La barre d'échelle représente 50 um. (C) la sécrétion de GLP-1 a été mesurée en réponse à la bombésine (BBS, 100 nM) et de la forskoline / 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (F / I, 10 pM de chacun). Pourcentage GLP-1 a été calculé la sécrétionen mesurant les niveaux de GLP-1 dans les surnageants et les lysats cellulaires. Les données représentent les moyennes ± SEM de n = 3 pour chaque condition. (D) la fluorescence de GCaMP3 (reflétant calcium cytosolique) des deux cellules décrites en (B) suivie en temps réel en réponse à du chlorure de potassium (KCl, 30 mM) et BBS (100 nM). l'imagerie de cellules individuelles a été effectuée en utilisant un microscope à fluorescence inversé avec un objectif d'immersion dans l'huile 40X. GCaMP3 a été excité à 475/10 nm, en utilisant une lampe à arc au xénon de 75 W et un monochromateur commandé par un logiciel d'imagerie par fluorescence. Émission a été enregistrée avec une caméra à dispositif (CCD) à couplage de charge numérique à haute résolution à l'aide d'un miroir dichroïque et d'un filtre de bande passante de 510-560 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce protocole décrit l'isolement et la culture des cellules intestinales petites murins mixtes pour permettre l'étude de la sécrétion de peptide intestinal et l'imagerie cellulaire unique de cellules entéro-endocrines marqués.

Pour augmenter la probabilité que les petites cultures intestinales être couronnée de succès, il est important que le protocole est effectué aussi rapidement que possible (idéalement, à moins de 3 h de récolte du tissu) et en ce que le tissu est conservé dans un milieu glacé ou tampon avant au processus de digestion, de limiter la mort cellulaire. Bien qu'il ne soit pas essentiel, en particulier pour les cultures du côlon, l'élimination de la couche musculaire de l'intestin grêle est fortement encouragée. Le petit protocole de culture intestinale a été normalisée, autant que possible. Cependant, il est important de noter qu'aucun processus de digestion est identique. Il y a beaucoup d' étapes au cours de ce protocole où la variabilité peut être introduit au jour le jour , par exemple le degré d'élimination des muscles, la taille de til morceaux de tissu « émincé », la force de la secousse, la puissance d'un lot particulier de collagénase etc. Il est donc d'une importance capitale pour inspecter aliquotes de chacun des différents « digère » au microscope pour évaluer les progrès du processus de digestion et d'adapter la secousse et le nombre de « digests » en conséquence. Il est recommandé de secouer plus doucement pour commencer et, si des fragments de la crypte ne sont pas évidents à partir de « digérer » 3 partir, pour commencer à secouer plus vigoureusement.

D'après notre expérience, les cellules endocrines ne prolifèrent pas dans la culture et sont généralement de petites cultures perdues intestinales dans les 4 jours. Néanmoins, cela permet amplement le temps d'effectuer des expériences de sécrétion de peptide intestinal (généralement réalisé plus de 2 h, 18-24 h plaquage post) pour tester des stimuli physiologiques et / ou d'agents pharmacologiques. Des expériences nécessitant une incubation d'une nuit avant l'expérience de sécrétion sont également possibles , par exempledans le cas du pré-traitement par la toxine de pertussis ^15.

La technique de culture primaire présentée ici est une méthode bien établie, comme en témoigne le volume de la production de la recherche, il a produit au fil des ans. Le modèle de culture primaire a été utilisée pour étudier la sécrétion d'une variété de peptides intestinaux, y compris le GLP-1 ^1, GIP et ¹⁸ PYY ^19, en réponse à divers éléments nutritifs et non nutritifs ^{14, 20} stimuli et des inhibiteurs. En outre, a été appliquée avec succès la même technique à la culture des cellules intestinales humaines ^21. Souvent, une combinaison de la première méthode de culture de cellules avec un exemple de modèle expérimental supplémentaire. ex vivo ou in vivo peuvent fournir un aperçu plus ^6. En particulier et contrairement à d'autres méthodes, cette technique a imapplications portantes au-delà de la mesure de la libération du peptide intestinal. Nous avons démontré que les cultures de petits intestinales primaires dérivées de souris rapporteurs transgéniques sont de puissants outils pour l'interrogation des voies de signalisation intracellulaire couplé à vider la sécrétion de peptide, en utilisant par exemple le Ca ²⁺ et des capteurs d'AMPc, GCaMP3 ^{11, 13} et Epac2camps ^14, respectivement, ainsi que des techniques électrophysiologiques ^12.

Comme avec tous les modèles in vitro, les cultures intestinales primaires ont certaines limites inhérentes , notamment la perte de la polarité des cellules épithéliales en culture, ainsi que la perte de l' approvisionnement en sang et innervation. Il est difficile d'estimer les impacts potentiels de ces conditions artificielles sur la fonction cellulaire entéroendocrine. Toutefois, les données obtenues à partir de cultures primaires ont souvent été translaté dans la in vivo setting (par exemple les effets des acides gras à chaîne courte sur la sécrétion de GLP-1 ^15).

Les cultures primaires intestinales sont une technique polyvalente avec de nombreuses applications potentielles. Ils ont déjà fourni d'importants aperçu mécaniste dans la régulation de la sécrétion de peptide intestinal.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques à 24 puits	Costar	3524	Pour les expériences de sécrétion
Bombesin	Sigma-Aldrich	B4272	Contrôle positif (expérience d’imagerie calcique)
Tubes à centrifuger, 15 mL, stériles	Greiner bio-one	188261	Pour la préparation/digestion des tissus
Tubes à centrifuger, 50 mL, stériles	Corning  ;	430828	Pour la préparation/digestion tissulaire
Collagénase XI (brute)	Sigma-Aldrich	C9407	Pour le maquillage milieu
de digestion Miroir dichroïque	Cairn Recherche-Pour		les expériences d’imagerie
DMEM Glycémie élevée (4500 mg)	Sigma-Aldrich	D6546	Pour dissoudre matrigel (maintenir à 4 ° ; C). Pour préparer le milieu de digestion, préchauffer à 37 °C.
Filtre d’émission (bande passante 510-560 nm)	Cairn	Research-Pour	les expériences d’imagerie
Sérum de bovin fœtal	Sigma-Aldrich	F7524	Pour la préparation du milieu de culture
Forceps/Pinces à épiler	Agar Scientific	AGT520	Pour la dissection/l’ablation de l’intestin
Forskoline	Sigma-Aldrich	F6886	Contrôle positif (expérience de sécrétion)
Boîtes à fond de verre (35 mm)	MatTek	P35G-0-14-C	Pour les expériences d’imagerie
Pince à épiler de haute précision (110 mm)	IDEAL-TEK	3480641 (5 SA)	Pour l’élimination de la couche musculaire
Caméra CCD numérique haute résolution	Hamamatsu	ORCA-ER	Pour les expériences d’imagerie
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Contrôle positif (expérience de sécrétion)
L-15 Milieu (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L1518	Pour le prélèvement de tissus, conserver sur glace
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	Pour la constitution d’un milieu de culture
Matrigel  ;	Corning	354234	Matrice de membrane basale, pour le revêtement de plaques et de plats
MetaFluor®	Dispositifs moléculaires (fournis par Cairn Research)	-	Logiciel d’imagerie du rapport de fluorescence
Souris (C57BL6)	Charles River Laboratories	C57BL/6J	Souris de fond utilisées pour la reproduction. Peut également être utilisé pour des expériences de sécrétion
Souris (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)	en	maison-Pour	des expériences d’imagerie et de sécrétion de calcium
Microscope (EVOS XL Core)	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000	Pour les photomicrographies de cultures
Microscope  ;	Olympus	IX71	Microscope inversé avec objectif à huile 40X utilisé pour les expériences d’imagerie
Monochromator	Cairn	Research-Pour	les expériences d’imagerie
Pipettes Pasteur	Laboratoires Alpha	LW4234	Pour le nettoyage des tissus
PBS contenant du Ca2+ et du Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662	Pour laver les mouchoirs, garder sur la glace
Pénicilline et Streptomycine	Sigma-Aldrich	P0781	Pour la préparation de milieux de culture
Boîtes de Pétri (100 mm x 20 mm)	Corning	CLS430167	Pour le nettoyage des tissus et l’ablation de la couche musculaire
Chlorure de potassium	Fisher Scientific	P/4280/53	Contrôle positif (expérience d’imagerie calcique)
Ciseaux	Agar Scientific	AGT554	Pour la dissection/l’ablation de l’intestin
Passoire à cellules stériles 100 & micro ; m	Fisher Scientific	22363549	Pour filtrer la suspension cellulaire de la crypte avant le placage
Lame de scalpel chirurgical n° 22 (stérile, inoxydable)	Swann Morton	0308	Pour couper en dés les filtres de seringue
tissulaire, Minisart NML (0,2 & micro ; taille des pores)	Sartorius	16534-K	Pour une solution de collagénase stérilisante par filtre (milieu de digestion)
Seringues, 20 mL, jetables, stériles, Luer slip	BD	300613	Pour une solution de collagénase stérilisante par filtre (milieu de digestion)
Lampe à arc au xénon 75W	Cairn	Research-Pour	des expériences d’imagerie
Y-27632 dichlorhydrate	Tocris	1254	Inhibiteur de ROCK, préparer une solution mère de 10 mM dans de l’eau stérile (utiliser 1:1 000 dans le milieu de culture final)