Montage et suivi du développement de la communauté microbienne dans une plateforme de microwell Array

Summary

Le développement des communautés microbiennes dépend d'une combinaison de facteurs, y compris l'architecture environnementale, l'abondance des membres, les traits et les interactions. Ce protocole décrit un environnement synthétique et microfabricant pour le suivi simultané de milliers de communautés contenues dans les puits de femtolittes, où des facteurs clés tels que la taille de niche et le confinement peuvent être approchés.

Abstract

Le développement des communautés microbiennes dépend d'une combinaison de facteurs déterministes et stochastiques complexes qui peuvent modifier radicalement la répartition spatiale et les activités des membres de la communauté. Nous avons développé une plate-forme de micropuits qui peut être utilisée pour assembler et suivre rapidement des milliers de communautés bactériennes en parallèle. Ce protocole souligne l'utilité de la plate-forme et décrit son utilisation pour le suivi optique du développement de communautés simples à deux membres dans un ensemble de tableaux au sein de la plate-forme. Cette démonstration utilise deux mutants de Pseudomonas aeruginosa , une partie d'une série de mutants développés pour étudier la pathogénicité de la sécrétion de type VI. Les inserts chromosomiques des gènes mCherry ou GFP facilitent l'expression constitutive de protéines fluorescentes avec des longueurs d'onde d'émission distinctes qui peuvent être utilisées pour surveiller l'abondance et l'emplacement des membres de la communauté dans chaque micropuits. Ce protocole décrit un procédé détailléD pour assembler des mélanges de bactéries dans les puits du réseau et utiliser l'imagerie par fluorescence temporelle et l'analyse d'image quantitative pour mesurer la croissance relative de chaque population membre au fil du temps. L'ensemencement et l'assemblage de la plate-forme des micropuits, les procédures d'imagerie nécessaires à l'analyse quantitative des communautés microbiennes au sein du tableau et les méthodes qui peuvent être utilisées pour révéler les interactions entre les espèces d'espèces microbiennes.

Introduction

Les communautés microbiennes sont façonnées à la fois par des facteurs déterministes tels que la structure de l'environnement et les processus stochastiques associés à la mort cellulaire, à la division, à la concentration de protéines, au nombre d'organites et à la mutation ¹ . Dans l'environnement naturel, il est presque impossible d'analyser l'impact individuel de ces influences sur la composition et l'activité de la communauté. Obscurcis par des structures naturelles et enterrés dans un milieu chimique et biologique, l'identification des membres de la communauté et la résolution de leur répartition spatiotemporel....

Protocol

1. Fabrication de matrices de silicium

1. Revêtement de parylène
   1. Déposer entre 1-1,5 μm de parylène N sur des plaquettes de silicium en utilisant un système de revêtement de parylène vendu dans le commerce conformément aux spécifications et aux instructions du fabricant (réglages: point de consigne du vaporisateur = 160 ° C, point de consigne du four = 650 ° C).
      REMARQUE: Environ 6 g de parylène N chargé dans une chambre donne des revêtements de 1 à 1,5 μm d'épaisseur.
2. Photolithographie
   1. Revêtir les plaquettes de parylène N-enduites avec un promoteur d'adhérence, 20% d'hexaméthyldisil....

Results

La plate-forme expérimentale présentée ici est conçue pour des études à haut débit et à fort contenu des communautés bactériennes. Le design permet d'analyser simultanément des milliers de communautés, qui se développent dans des puits de différentes tailles. Avec cette conception de matrice de micropuits, on peut déterminer la dépendance de la composition de la communauté finale sur les densités de semis initiaux, la taille du puits et l'environnement chimique. Ce travail démontre la cr.......

Discussion

Cet article présentait un périphérique de réseau de micropuits et des protocoles expérimentaux conçus pour permettre l'analyse par image de cellule animale à haut débit et à haute teneur du développement communautaire bactérien. Bien que la démonstration ait été axée sur l'étude des effets de la sécrétion de type VI médiée par le contact sur le développement de la communauté, les tableaux ont été conçus pour être flexibles et permettre l'étude d'une large gamme de communautés microbiennes et des interact.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Systèmes de revêtement spécialisés	parylène N	CAS NO. :1633-22-3
Enduiseuse de parylène	Systèmes de revêtement spécialisés	Unité de dépôt de parylène Labcoter 2 PDS2010
Plaquette de silicium	WRS Matériaux	100 mm de diamètre, 500-550 &mu ; m d’épaisseur, Prime, résistivité 10-20, N/Phos< 100>,
promoteur d’adhérence	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 promoteur
photorésine de ton positif	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (propriété de Dow)	Microposit S1818 Photoresist positive (code 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching	Tool Oxford Instruments	Plasmalab System 100 Graveur
R2A Bouillon	TEKnova	R0005
Sérum bovin Albumine	Sigma	A9647
Lecteur de plaques multimode	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Microscope fluorescent	Nikon	Eclipse Ti-U
Automated Stage	Prior	ProScan III
Caméra CCD	Nikon	DS-QiMc
Chambre de contrôle de l’environnement sur scène	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm N° 1.5 lamelle	Nexterion	Haute performance #1.5H lamelles de
fluorescence Lames de référence	Ted Pella	2273
Stylet physique Profilomètre	KLA Tencor	P-6
lingettes de laboratoire	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Marque, 34155
logiciel commercial	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Microscope confocal	Zeiss
cubes de filtre	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red (96313)