Le but de ce protocole est de démontrer la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La technique peut être utilisée comme outil de dépistage in vitro dans la recherche auditive.
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Article de méthode
Technique explosive cochléaire murine néonatale en tant que
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bien qu'il y ait eu des progrès remarquables dans la recherche de l'ouïe au cours des dernières décennies, il n'y a toujours pas de remède contre la perte d'audition sensorielle (SNHL), une affection qui entraîne généralement une perte ou une perte des structures mécanosensorielles délicates de l'oreille interne. Des essais sophistiqués in vitro et ex vivo ont émergé ces dernières années, ce qui a permis de dépister un nombre croissant de composés potentiellement thérapeutiques tout en minimisant les ressources et en accélérant les efforts pour développer des remèdes pour SNHL. Bien que les cultures homogènes de certains types de cellules continuent à jouer un rôle important dans la recherche actuelle, de nombreux scientifiques s'appuient maintenant sur des cultures organotypiques plus complexes d'oreilles internes murines, également connues sous le nom d'explants cochléaires. La préservation des structures cellulaires organisées à l'intérieur de l'oreille interne facilite l'évaluation in situ de divers composants de l'infrastructure cochléaire, y compris les cellules capillaires interne et externe, les neurones ganglionnaires en spirale, les neuronesItes, et les cellules de soutien. Nous présentons ici la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La préparation minutieuse de ces explants facilite l'identification des mécanismes qui contribuent au SNHL et constituent un outil précieux pour la communauté de la recherche auditive.
Introduction
La perte auditive sensorielle (SNHL) reflète les dommages causés à l'oreille interne ou à la voie auditive ascendante. Bien que la perte auditive soit le déficit sensoriel le plus fréquent chez les humains 1 , les traitements curatifs n'existent pas encore 2 . Bien que les implants cochléaires ou auditifs du tronc cérébral puissent rétablir un certain degré d'audition chez les patients atteints de SNHL grave à profond, l'audition fournie par ces dispositifs est encore très différente de l'audition "naturelle", en particulier lors des tentatives de compréhension de la parole dans le bruit ou de l'....
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Protocole
Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts Eye and Ear. Les expériences ont été réalisées selon le Code de déontologie de l'Association médicale mondiale.
1. Préparation de la dissection
- Préparation de la table chirurgicale
- Utilisez 70% d'éthanol pour désinfecter la table chirurgicale.
- Placez deux plaques de préparation non stériles à côté du microscope.
- Préparez le tiroir à instruments, y compris les ciseaux opératoires stérilisés par la chaleur, une poignée de scalpel, un mic....
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Résultats
Bien que de nombreux protocoles se concentrent sur l'organe des explants de Corti, cette technique tente de préserver l'anatomie de l'ensemble du tournant cochléaire, y compris les SGN. Cela donne aux chercheurs la possibilité d'analyser les effets d'un traitement donné sur les neurites et somata des SGN en plus de l'organe de Corti. Effectuer une dissection qui conserve une partie du modiolus, comme décrit ici, est plus difficile à utiliser que l'explantation.......
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Discussion
Les chercheurs doivent perfectionner la technique de dissection avant d'effectuer des expériences impliquant des explants cochléaires. Les cellules ciliées sont généralement endommagées lors des dissections effectuées au début de la courbe d'apprentissage, et un moment particulièrement problématique pour leur intégrité est l'élimination de la membrane tectoriale, qui nécessite des mains régulières, des outils appropriés et une expérience. Pour économiser du temps et des ressources, un contrôle visuel devrait.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication, R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (soutenant SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) et le Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Nous remercions Jessica E. Sagers, BA pour des commentaires perspicaces sur le manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ampicilline, sel de sodium | Invitrogen | 11593-027 | |
| anticorps anti-CtBP2, souris (IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anticorps anti-Myo7A, lapin | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anticorps anti-NF-H, poulet | EMD Millipore | AB5539 | |
| anticorps anti-PSD95, souris (IgG2a) | Anticorps Inc. | 75-028 | |
| Anticorps anti-TuJ1, souris | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Adhésif pour cellules et tissus, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Tubes à centrifuger, fond conique, graduation, | Greiner Bio-One | stérile 188161 | |
| CELLSTAR Boîte de culture cellulaire, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Boîte de culture cellulaire, 35 x 10 mm, 4 anneaux intérieurs | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Boîte de culture cellulaire CELLSTAR, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Tubes à centrifuger, fond conique, graduation, | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Vernis à ongles transparent | Microscopie électronique Sciences | 72180 | |
| Plats à fond en verre transparent (verre 40mm), PELCO® ;, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Couvre-lames, rond, verre, 10 mm de diamètre, épaisseur #1, 0,13 - 0,16 mm | Ted Pella Inc. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Eau distillée, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 ; | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), teneur élevée en glucose, pyruvate, sans glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Alcool éthylique (EtOH), pur, 200 proof, anhydre, &ge ; 99,5 % | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Sérum de veau fœtal (FBS), qualifié, régions approuvées par l’USDA, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 ; | Aliquote dans des tubes de 50 mL et conserver à -20° ; C chèvre congélateur |
| anti-poulet-647 anticorps secondaire | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| chèvre anti-souris (IgG)-568 anticorps secondaire | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| chèvre anti-souris (IgG1)-568 anticorps secondaire | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| chèvre anti-souris (IgG2a)-488 anticorps secondaire | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| chèvre anti-lapin-488 anticorps secondaire | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, stérile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnésium, sans rouge de phénol, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Plateau à instruments avec couvercle Acier inoxydable | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro couteau (dissection) &ndash ; coudé 30° ; | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Lames de microscope, VistaVision, à code couleur, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm d’épaisseur, blanches, paquet de 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, solution d’hydroxyde de sodium, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sérum normal pour chevaux (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Ciseaux opératoires | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldéhyde (PFA), qualité réactif, cristallin | Sigma-Aldrich | P6148 | Avant l’utilisation : Établir des procédures opérationnelles normalisées basées sur les protocoles disponibles en ligne |
| PBS, pH 7,4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 ; | Autoclave avant utilisation |
| Phalloïdine, Alexa Fluor 568 ; | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Coussin de préparation, non stérile | Medline | 05136CS | |
| Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, polypropylène, 0,5 mL | Autoclave | de 022363719 | Eppendorf |
| Tubes de microcentrifugation Safe-Lock, polypropylène, 1,5 mL | Autoclave | de 022363204 | Eppendorf |
| Lames de scalpel - #15 | Outils de science fine | 10015-00 | |
| Manche de scalpel - #4 | Outils de science fine | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stéréomicroscope | Zeiss° | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 microscope confocal | Leica | N/A | |
| Triton-X (tensioactif non ionique) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield support de montage anti-décoloration pour fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Sac à fermeture éclair, refermable, 4 x 6'' - 2 mm d’épaisseur | Zipline | 0609132541599 |
Références
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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Réimpressions et autorisations
