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Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

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DOI :

10.3791/55712

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17 mai 2017

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1Department of Oncological Sciences and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine, 2Department of Dermatology, University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La transplantation de cellules cancéreuses est un outil important pour l'identification des mécanismes du cancer et des réponses thérapeutiques. Les techniques actuelles dépendent des animaux immunitaire incompétents. Ici, nous décrivons une méthode pour transplanter des cellules tumorales de poissons zèbres en embryons immunologiquement compétents pour l'analyse à long terme du comportement des cellules tumorales et des réponses aux médicaments in vivo .

Résumé

La transplantation de cellules tumorales est une technique importante pour définir les mécanismes de lutte contre la croissance des cellules cancéreuses, la migration et la réponse de l'hôte, ainsi que pour évaluer la réponse potentielle du patient au traitement. Les méthodes actuelles dépendent en grande partie de l'utilisation d'animaux syngéniques ou immunisés pour éviter le rejet du greffe de la tumeur. De telles méthodes nécessitent l'utilisation de souches génétiques spécifiques qui empêchent souvent l'analyse des interactions immunité-cellules tumorales et / ou se limitent à des antécédents génétiques spécifiques. Une autre méthode dans le poisson zèbre tire profit d'un système immunitaire incomplètement développé dans le cerveau embryonnaire avant 3 jours, où les cellules tumorales sont transplantées pour une utilisation dans des essais à court terme ( c.-à-d. 3 à 10 jours). Cependant, ces méthodes provoquent la létalité de l'hôte, ce qui empêche l'étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments. Ce protocole décrit une méthode simple et efficace pour la transplantation orthotopique à long terme du tissu tumoral du cerveau zébré dansAu quatrième ventricule d'un poisson zèbre immunitaire compétent de 2 jours. Cette méthode permet: 1) étude à long terme des comportements des cellules tumorales, telles que l'invasion et la dissémination; 2) réponse tumorale durable aux médicaments; Et 3) la ré-transplantation de tumeurs pour l'étude de l'évolution de la tumeur et / ou l'impact de différents milieux génétiques de l'hôte. En résumé, cette technique permet aux chercheurs en cancérologie d'évaluer le greffe, l'invasion et la croissance sur des sites éloignés, ainsi que d'effectuer des essais chimiques et des tests de compétition cellulaire pendant de nombreux mois. Ce protocole peut être étendu aux études d'autres types de tumeurs et peut être utilisé pour élucider les mécanismes de chimisistance et de métastase.

Introduction

La transplantation de cellules tumorales dans des animaux immunodépendants, en particulier des xénogreffes de souris, est une technique largement utilisée pour étudier les mécanismes de lutte contre la prolifération des cellules cancéreuses 1 , 2 , la survie, l'invasion et la métastase 3 , 4 , ainsi que pour fournir une plate-forme Pour le dépistage des médicaments 5 , 6 , 7 . Plus récemment, la transplantation d'échantillons de tumeurs primaires dans des souris immunodéprimées a été utilisée pour générer des modèles de xénogreffe dérivés du patient (PDX) pour le dépistage diagnostique et préclinique des médicaments et constitue l'épine dorsale de l'initiative de médecine personnalisée 8 , 9 , 10 , 11 . Cependant, des preuves significatives montrent que la modulation du système immunitaireLa tige peut avoir un impact dramatique sur le comportement tumoral et le résultat du patient 12 , 13 . Cela a entraîné la refonte des techniques basées sur la xénogreffe pour inclure des souris "humanisées", dans lesquelles le système immunitaire de la souris est reconstitué par la co-transplantation de cellules immunitaires humaines avec des cellules tumorales. Cependant, cette approche est encore techniquement difficile, avec une reproductibilité variable et des toxicités associées à la technique, en plus du coût important 14 , 15 . Ainsi, de nouvelles techniques de transplantation dans des animaux immunitaires sont nécessaires pour accélérer la découverte de mécanismes immunitaires et tumorales spécifiques de la progression du cancer et de la réponse aux médicaments.

Le poisson-zèbre est un modèle animal alternatif pour l'étude du cancer humain, avec plus de 20 modèles de cancer maintenant établis 16 , y compris le cerveau hautement malin 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 et cancers pancréatiques 21 , 22 , ainsi que de nombreuses leucémies 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Deux attributs du système de poissons zèbres le rendent particulièrement propice à la recherche sur le cancer: 1) la clarté optique des animaux translucides permet la visualisation directe des comportements cellulaires cancéreux ( c.-à-d. Prolifération, survie, invasion et dissémination) en utilisant des techniques de microscopie simple et 2) Le poisson zèbre féminin peut produire jusqu'à 200 embryons par jour, ce qui permet de réduire rapidement le nombre d'animaux pour le dépistage génétique ou de médicaments à faible coût. En outre, les génomes du cancer du poisson zèbre et des humains sont hautement conservés (y compris les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs)28 », ce qui permet de traduire rapidement les pratiques mécaniques et les découvertes de médicaments dans des systèmes de mammifères. Ces attributs font également du poisson zèbre un modèle animal idéal pour les techniques de transplantation, qui profitent de l'imagerie, de l'évolutivité et du faible coût du système.

Les études antérieures sur la transplantation de tumeurs dans le poisson zèbre immunodéprimé ont facilité l'identification des capacités d'auto-renouvellement, de la tumeur tumorale et de l'invasion / diffusion 11 , 29 . Des études à court terme du comportement des cellules tumorales peuvent être effectuées après une transplantation chez des adultes irradiés par γ, dont les systèmes immunitaires sont effectivement supprimés pendant environ 20 jours 11 , 30 . Le traitement du poisson zèbre adulte avec de la dexaméthasone supprime les lymphocytes B et T pendant jusqu'à 30 jours avant le rejet 31 . Une autre stratégie moins commune utilise des souches clonales de poisson zèbreQui permettent des recherches à long terme chez un hôte immunitaire compétent 32 . Cependant, seul un nombre limité de souches clonales ont été générées et sont difficiles à maintenir en raison d'une faible fécondité. En outre, la plupart des modèles établis de tumeur du poisson zèbre sont générés dans d'autres milieux génétiques, de sorte que ces tumeurs ne peuvent pas être transplantées dans les souches clonales sans supprimer le système immunitaire 11 , 33 , 34 . Des approches plus récentes pour améliorer les études de transplantation à long terme incluent le développement de la ligne de mutants E250f de rag2 , avec des fonctions de cellules B et T associées, qui a été utilisée pour réussir à transplanter des cancers multiples 35 , 36 . Pour contourner l'exigence de lignes clonales de poisson zèbre ou d'un hôte immunodéficié, un certain nombre de groupes ont utilisé des embryons de stade précoce ( c.-à-d. > 72 chOst-fertilisation (hpf)) pour la transplantation de cellules tumorales humaines, car ces embryons n'ont pas encore complètement développé un système immunitaire adaptatif 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Cependant, ces méthodes sont limitées à l'analyse à court terme du comportement des cellules tumorales ou de la réponse au médicament (généralement moins de 2 semaines), car les cellules cancéreuses humaines ou la technique de transplantation elle-même tue l'hôte, empêchant les études à long terme et la ré-transplantation.

Ce protocole décrit une méthode de transplantation embryonnaire modifiée dans la lumière du quatrième ventricule d'un cerveau d'embryon de 2 jours après fertilisation (dpf). Il minimise la toxicité pour l'hôte et peut être combiné avec des modèles de tumeur cérébrale du poisson zèbre pour le greffe à long terme des cellules tumorales. Ainsi, cette technique alDes niveaux minimaux pour la ré-transplantation de cellules tumorales dans de nouveaux hôtes pendant de nombreuses générations, en facilitant de futures études sur l'hétérogénéité des tumeurs, les réponses immunitaires / immunitaires, les réponses aux médicaments ou le potentiel métastatique. Cette méthode est également simple, efficace et évolutive, car jusqu'à 300 transplantations peuvent être effectuées par un seul utilisateur par jour, avec jusqu'à 90% de greffe. Ceci permet la propagation rapide de tumeurs primaires individuelles en des centaines d'embryons à 2 dpf pour des projets de dépistage génétique ou de dépistage de drogue ou pour visualiser directement le comportement des cellules tumorales cérébrales dans différents milieux hôtes pendant de nombreux mois.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées et ont suivi les lignes directrices sur les soins des animaux du Comité d'aide et de soins pour animaux institutionnels de l'Université de l'Utah (IACUC n ° 16-03019).

1. Préparation de l'équipement pour la microinjection

  1. Préparation de la plaque d'injection.
    1. Préparez une solution de 50 ml d'agarose à 1,2% dissous dans de l'eau d'oeuf (sel d'aquarium 0,6 g / L dans l'eau d'osmose inverse + 0,01 mg / L de bleu de méthylène). Faire bouillir la solution jusqu'à dissolution de l'agarose puis ajouter en ajoutant 0,05 mg / L de bleu de méthylène. Verser 25 ml de la solution finale dans une boîte de Petri de 10 cm et la laisser solidifier. Placer les 25 ml restants de solution d'agarose dans un bain d'eau à 42 ° C jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour l'étape 1.1.2.
    2. Mettre un bécher de 2 pouces de diamètre au centre de la surface solidifiée et verser les 25 mL restants d'agarose à 1,2%.
      REMARQUE: cela crée une surface d'injection à la périphérie de la plaque et un noyau au centre, quiFournit une zone pour tester la taille de l'aiguille et la consistance de la suspension tumorale.
      1. Maintenir la plaque d'injection à 28 ° C pendant au moins 30 minutes avant l'injection ou à 4 ° C pour un stockage à long terme.
  2. Préparation des aiguilles d'injection.
    1. Faire les aiguilles en tirant des capillaires de 10 cm avec une dimension extérieure de 1,2 mm et une dimension interne de 0,9 mm (sans filament) en deux aiguilles sur un extracteur d'aiguille.
      NOTE: Chaque aiguille doit mesurer 6 cm de longueur totale, où environ 1,5 cm de l'extrémité est conique.
    2. Placez soigneusement l'aiguille sur une lame de microscope enveloppée dans un film de paraffine en plastique. Utilisez une lame de rasoir pour couper l'extrémité de l'aiguille à un angle de 45 ° pour créer une aiguille avec une ouverture à la pointe.
      REMARQUE: Typiquement, on élimine 0,1 mm à 0,3 mm de la fin de l'aiguille. Une pointe chanfreinée n'est pas nécessaire pour effectuer les injections.
  3. Préparez la configuration de microinjection.
    1. Disposer une configuration de micro-injection standard, y compris un stéréomicroscope, un manipulateur et un micro-injecteur pour la transplantation.

2. Préparation des embryons pour la transplantation

  1. Recueillir jusqu'à 500 embryons mitfa w2 44 (ou embryons de tout autre génotype de poisson zèbre tel que défini par l'utilisateur) comme décrit 45 et maintenir dans un incubateur à 28 ° C.
  2. Décortiser les embryons à 24 hpf en ajoutant 100 μL de solution de cocktail de protease 10 mg / mL diluée dans de l'eau d'oeuf et doucement pendant environ 20 min. Rincez les embryons 3 fois avec de l'eau fraîche pour éliminer la protéase résiduelle.
  3. Écran des embryons à 48 hpf pour le stade de développement approprié, tel que défini par les critères standard de la série de mise en scène 45 .
    Remarque: Seuls des embryons correctement mis en scène et morphologiquement normaux devraient être utilisés pour la transplantation.
  4. AnesthésierEnviron une vingtaine d'embryons de 48 hpf dans de l'eau d'oeuf contenant 0,002% de Tricaine-S dans une boîte de Petri. Confirmer une anesthésie appropriée en observant la cessation des mouvements.

3. Faire une suspension de cellules tumorales

NOTE: Les modèles de tumeur cérébrale du poisson zèbre peuvent être générés par des combinaisons de génotypes génétiques d'oncogènes et de gènes suppresseurs de tumeur 17 , 46 , 47 . Ici, on a utilisé le modèle NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET zebrafish p53 zdf1 / zdf1 , tel que décrit récemment 17 .

  1. Éuthaniser un poisson porteur de tumeur cérébrale dont le fardeau tumoral est d'environ 20% de la taille totale du corps en utilisant un surdosage de Tricaine-S à 0,4% suivi d'une immersion dans de l'eau glacée selon les protocoles approuvés par l'IACUC.
  2. Dissectez la tumeur marquée par fluorescence avec une lame de rasoir et une pincette sous une fluorescenceMicroscope à l'aide d'une technique stérile et placez-le dans 5 mL de 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS).
    REMARQUE: les méthodes de dissection exacte seront définies par l'utilisateur et dépendent du type de tumeur et de l'emplacement des tissus. Voir les références listées pour des procédures détaillées pour la dissection de différents organes de poisson zèbre et des tumeurs cérébrales 17 , 48 .
  3. Perturbe manuellement la masse tumorale en utilisant une pipette p1000 jusqu'à ce qu'une solution uniforme et trouble se développe. Enlevez les particules importantes avec une pointe de pipette ou utilisez une passoire de cellule de 40 μm (dépend de la tumeur). Centrifuger la suspension à température ambiante pendant 5 min à 290 xg et retirer le surnageant.
    Remarque: Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) n'est pas réalisé pour isoler les cellules tumorales. Cela permet la transplantation d'une population hétérogène de cellules stromales, immunisées et tumorales.
  4. Remettre à nouveau le culot de cellules tumorales dans 100 μL de PBS stérile et le transférer dans un micro de 1,5 mlTube de centrifugation. Prendre 5 μL de la suspension cellulaire et diluer dans 250 μL de PBS. Comptez le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger la suspension pendant 3 min à 290 xg, enlever le surnageant et remettre à nouveau le culot dans du PBS stérile pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée.
    NOTE: Typiquement, les cellules remises en suspension dans 30 à 40 μL de PBS stérile produisent une solution visqueuse et opaque (concentration cellulaire ≥ 100 cellules / nL) et ont tendance à générer les transplantations les plus réussies. La viabilité cellulaire n'est pas évaluée.
  5. Conserver la suspension tumorale sur un bloc de chaleur de 28 ° C pendant la procédure de transplantation.

4. Injecter la suspension de tumeur dans le quatrième ventricule d'un embryon de 2 dpf

  1. Transférer 10-20 embryons anesthésiés (de l'étape 2.4) à la périphérie de la plaque d'injection à l'aide d'une pipette de transfert; Les embryons devraient tomber latéralement sur la plaque d'injection, les ventricules étant clairement visibles et accessibles. Utiliser une sonde inclinée pour ajuster les embryons au besoin et les positionner loin du bord extérieur de la plaque d'injection.
  2. Chargez 1-2 μL de la suspension de cellules tumorales dans l'aiguille d'injection en utilisant des pointes de pipette de chargement en gel et insérez l'aiguille dans le manipulateur.
  3. Abaissez manuellement le manipulateur, en maintenant l'aiguille à un angle de 45 °. Réglez les boutons sur le micromanipulateur dans les directions x, y et z jusqu'à ce que l'aiguille soit juste au-dessus et à environ 5 mm à droite de la tête d'embryon. Regardez les oculaires du stéréomicroscope et ajustez lentement le micromanipulateur dans la direction x jusqu'à ce que l'aiguille perfore le quatrième ventricule de l'embryon. Ne laissez pas l'aiguille percer le cœur ou le jaune.
    1. Poussez la pédale attachée au micro-injecteur pour injecter la suspension de cellules tumorales.
      REMARQUE: La pression et le temps d'injection varient en fonction de la taille de l'alésage de l'aiguille, mais un bon point de départ est de 5 à 10 PSI et de 50 à 100 ms.Le volume des cellules tumorales injectées peut être évalué avec des techniques standard de chute d'huile par injection dans l'huile minérale, si désiré 49 . Les injections de 500 pL avec un diamètre de goutte de 0,1 mm donnent généralement les meilleurs résultats.
  4. Rincer doucement les embryons injectés de la plaque d'injection et dans une boîte de Petri en utilisant de l'eau fraîche pour les oeufs. Maintenir les embryons dans l'eau des oeufs pour les procédures restantes ou jusqu'à ce qu'ils soient cultivés en citernes (comme décrit à l'étape 4.9.1).
  5. Inspecter les embryons injectés sous un stéréomicroscope fluorescent. Confirmez que la pression d'injection, l'angle, la taille de l'aiguille et la viscosité de la suspension cellulaire donnent lieu à des cellules tumorales remplissant 25 à 50% de l'espace ventriculaire. Réglez ces paramètres si nécessaire.
  6. Répétez les étapes 4.1-4.5 pour tous les embryons restants. Anesthésier les embryons supplémentaires au besoin (décrit à l'étape 2.4).
    NOTE: Un utilisateur expérimenté peut injecter jusqu'à 300 embryons sur 3-4 h.
  7. Remettre les embryons dansL'incubateur à 28 ° C pendant la nuit.
  8. Le lendemain, évaluer la survie des embryons en examinant les caractéristiques morphologiques et physiologiques, telles que le développement normal du cœur et du cerveau, comme décrit 45 .
  9. Pour le dépistage, anesthésier les embryons, comme décrit à l'étape 2.4, au 1 jour après la transplantation (dpt).
    1. Utilisez une pipette de transfert pour ajouter 4% de méthylcellulose au milieu d'une boîte de Petri et ajoutez les embryons à la goutte de méthylcellulose. Orientez les embryons (côté ventral face à la source de lumière) en utilisant une sonde inclinée et un écran pour une taille de greffe uniforme en utilisant un microscope à fluorescence. Enlevez tous les embryons avec des cellules tumorales non confinées au ventricule ou celles qui contiennent des cellules tumorales qui ne comportent pas moins de 25% de l'espace ventriculaire.
      Note: La greffe constante est définie comme des embryons avec une seule masse tumorale qui englobe 25-50% de l'espace ventriculaire 17 . À des fins de dépistage, utiliser une fluorescence sTereomicroscope avec un objectif 1X, une ouverture numérique de 0,15, un grossissement allant de 0,7-1,6X et un temps d'exposition de 50 ms à 1 s. Pour toutes les images, utilisez le canal de champ lumineux en plus du canal GFP ou RFP.
    2. Pour le maintien des tumeurs, placer les embryons transplantés dans les chars pour cultiver 45 à 8 dpf (6 dpt).

5. Impression des embryons transplantés pour les comportements cellulaires

  1. Anesthésier les embryons à 3-8 dpf (1-6 dpt) et monter (côté dorsal face à la lamelle) dans 1,2% d'agarose à faible teneur en fusion. Effectuer une imagerie temporelle des embryons montés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser pour la durée désirée pour visualiser les comportements cellulaires, tels que la migration, la division cellulaire ou les interactions cellule-cellule, au besoin 38 , 43 , 53 .
    REMARQUE: utilisez un rapport d'aspect de 1 024 x 1 024, une vitesse de balayage de 8 et #181; s / pixel. Utilisez la moyenne de l'analyse et définissez les dimensions de la profondeur z pour assurer la capture de la masse tumorale totale (1 000 à 1 500 μm). En outre, effectuez des expériences de 4 h en cas de défaillance, en acquérant une image toutes les 10 à 15 minutes en utilisant un objectif de 40x, afin de surveiller les comportements invasifs. La sensibilité du détecteur variera en fonction de l'intensité de la masse tumorale, et la puissance laser sera dépendante du microscope, mais il est généralement recommandé d'être compris entre 15 et 40%.
  2. Une fois l'imagerie terminée, libérer l'embryon monté de l'agarose à l'aide d'une sonde incliné et le transférer dans une boîte de Petri avec de l'eau fraîche d'oeuf.

6. Administration des médicaments contre les embryons transplantés et l'évaluation du fardeau tumoral 17

  1. Anesthésier les embryons à 3 dpf et les orienter dans 4% de méthylcellulose, avec le côté ventral face à la source lumineuse. Image des embryons de prétraitement utilisant un microscope à fluorescence 17 .
  2. PlaLes embryons transplantés à 3 dpf dans une plaque de 12 puits, avec 10 embryons par puits dans 0,5 mL d'eau d'oeuf. Ajouter la quantité appropriée de médicament pour obtenir la concentration finale souhaitée ( p. Ex. Inhibiteur de MEK 50 μM) et retourner les embryons dans un incubateur à 28 ° C. Le lendemain, retirez l'eau d'oeuf traitée avec un médicament avec une pipette à transfert mince et ajoutez un nouveau traitement. Répétez ce jour jusqu'à ce que les embryons atteignent 8 dpf.
  3. À 8 dpf, retirer les embryons du traitement médicamenteux et les placer dans de l'eau fraiche des oeufs. Anesthésier les embryons et orienter (côté ventral face à la source lumineuse) dans 4% de méthylcellulose. Image embryons post-traitement à l'aide d'un microscope à fluorescence. Quantifier la zone de la tumeur en utilisant un logiciel approprié, comme décrit 17 .
  4. Séparer les embryons, le cas échéant, par traitement et les placer dans des citernes pour cultiver. Après 4 à 9 semaines, anesthésier le poisson et les évaluer pour le fardeau tumoral global en utilisant un stéréomicroscope de fluorescence standard, car dÉcrit 17 .

Résultats

Transplantation et greffe de tumeurs

Un schéma de la procédure est représenté sur la figure 1 . Des cellules tumorales marquées par fluorescence sont extraites du site organique primaire et une suspension à une seule cellule est générée pour la transplantation dans le quatrième ventricule d'embryons de poisson zèbre 44 mitfa w2 2-dpf. La figure 2 montre les résultats représentatifs de cette méthode en utilisant un modèle de poisson zèbre de la tumeur ectodérmique neurale primitive du système nerveux central (CNS-PNET), dans lequel le promoteur sox10 conduit l'expression de NRAS de type sauvage ou de NRAS activé fusionné à mCherry dans des cellules précurseurs oligonéales déficients p53 17 . Le mutant mitfa w2 zebrafish 44 , qui manque de mélanophores, a été utilisé pour visualiser plus facilementLes cellules tumorales après la transplantation et / ou à l'âge adulte. D'autres mutants de pigments pourraient également être utilisés pour fournir une clarté d'image supplémentaire, comme Casper 50 . Dès 24 heures après la transplantation, on peut voir des cellules tumorales envahissant le tissu cérébral environnant ( Figure 2A , 3 dpf, flèches). Les greffes tumorales continuent de croître dans le ventricule et le tissu cérébral environnant au cours de la semaine prochaine ( figure 2A , 8 dpf). À cette époque, la fluorescence peut également être observée dans la région des reins ( figure 2A , astérisques). Cela peut être dû au fait que les reins filtrent les débris cellulaires de la transplantation, ce qui correspond aux études antérieures qui utilisent des colorants fluorescents comme essai pour évaluer la fonction rénale 51 . Les cellules tumorales continuent à proliférer et à envahir, de sorte que, par 28 dpf, une masse tumorale peut être observée dans tout le cerveau du poisson zèbre ( Figure 2A , 28 dpf).

Cette technique permet la transplantation rapide de cellules tumorales dans des centaines d'embryons avec une consistance reproductible, car le site d'injection peut être ciblé avec précision avec un dommage minimal pour l'hôte. Un groupe représentatif d'embryons transplantés avec des cellules tumorales cérébrales marquées par mCherry est représenté dans le panneau supérieur de la figure 2B . La greffe de tumeur est habituellement atteinte dans 80 à 90% d'embryons et les transplantations de tumeurs persistent jusqu'à l'âge adulte; Trois exemples représentatifs sont représentés dans les panneaux inférieurs de la figure 2B . Cela permet que les transplantations de tumeur soient récoltées et congelées ou ré-transplantées pendant plusieurs générations.

L'invasion des tumeurs et les réponses aux drogues

La figure 3A montre un schéma de co-transplantation dans lequel deux tumeurs différentes marquées avec GFP (Tumeur A) ou mCherry (Tumeur B) sont récoltées par l'ensembleOu la dissociation (notez que FACS n'est pas utilisé ici, mais les cellules tumorales triées par FACS peuvent être utilisées si nécessaire). Les tumeurs A et B peuvent provenir de différents endroits, induites par différents oncogènes, ou induites dans différents milieux génétiques. Chaque tumeur est transformée en une seule suspension cellulaire, et les cellules tumorales sont ensuite mélangées à un rapport 1: 1 et transplantées dans l'embryon de 2 dpf. Les propriétés tumorales, telles que le greffon, la croissance, l'invasion et la dissémination de la Tumeur A par rapport à la Tumeur B peuvent alors être observées dans le même hôte qui permet des contrôles internes pour la technique et le fond génétique.

Sur la figure 3B , on a récolté un poisson zébraux marqué au mouton NRC, CNS-PNET du tectum optique et un CNS-PNET marqué au GFP du cervelet. Ils ont été récoltés et transformés en suspensions monocellulaires. Les cellules ont été comptées, et un nombre égal de cellules de chaque tumeur ont été mélangés ensemble et transplanté dans des embryons de 2 dpf. Quatre dAprès la transplantation, les embryons ont été imagés avec microscopie confocale. On a montré un embryon représentatif démontrant que les cellules tumorales du tectum (rouge) migrent plus largement dans le cerveau de l'hôte (flèches) que la tumeur cérébelleuse.

Les embryons transplantés avec des cellules tumorales marquées par fluorescence peuvent être utilisés dans des régimes de traitement médicamenteux pour identifier des composés qui inhibent la croissance tumorale. La figure 3C est un calendrier typique pour le traitement et l'imagerie des transplantations de tumeurs. 24 heures après la transplantation, on accède aux embryons pour obtenir une taille de greffe uniforme et se divise en groupes de traitement. Dans l'exemple fourni, les embryons transplantés avec du SNP-PNET à poissons zèbres marqués par le NRAS sont traités avec un inhibiteur de MEK 50 μM (DMSO) ou un inhibiteur de MEK (AZD6244). Les embryons sont traités pendant 5 jours et sont représentés à 8 dpf, comme indiqué dans la figure 3C . La figure 3D (panneaux de gauche) montre représentativité E animaux des deux groupes de traitement. Les embryons traités par un inhibiteur de MEK ont une quantité de fluorescence significativement plus faible que celles traitées avec du DMSO, comme décrit 17 . Après l'imagerie des animaux, ils sont transférés dans des réservoirs sans médicaments et surveillés pour une croissance tumorale pendant deux mois. Dans l'exemple fourni, le traitement inhibiteur de MEK aboutit à une réponse durable chez les adultes ( figure 3D , panneaux droits). Pour plus de détails sur le traitement médicamenteux, l'imagerie et la quantification, voir la référence 17 .

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Figure 1: Schéma de protocole de la transplantation de cellules tumorales dans le quatrième ventricule d'embryons de poissons zébrés à 2 dpf. Schéma général des sections 3 à 4 du protocole, y compris d'autres analyses de points d'extrémité (sections 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2: Engrau et progression des tumeurs. (A) Les cellules tumorales principales du SNC-PNET 17 du poisson-zèbre marquées avec mCherry ont été transplantées dans le quatrième ventricule d'embryons de 2 dpf. À 3 dpf, les cellules tumorales sont vues envahissant le tissu cérébral environnant (flèches). À 8 dpf, les cellules tumorales se développent dans le ventricule; Des cellules tumorales rouges sont également présentes dans le tissu cérébral environnant et les reins (astérisques). À 28 dpf, les cellules tumorales ont envahi et se développent dans tout le cerveau de l'hôte. (B) Panneau supérieur. Sept embryons de 3 dpf transplantés avec des cellules tumorales cérébrales de poissons zèbres marquées par mCherry. Les cellules tumorales peuvent être transplantées constamment dans des centaines d'embryons, avec des taux élevés de greffe ( c.-à-d. Typiquement des embryons de 85/100). Moyen etPanneaux de fond. Trois poissons adulte représentatifs avec des tumeurs transplantées 4-8 semaines après la fécondation (wpf). Les tumeurs peuvent être visualisées par microscopie à fluorescence. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3: Comparaison de l'invasion tumorale et de la réponse médicamenteuse. ( A ) Les CNS-PNET 17 du tectum optique ou du cervelet sont marqués avec mCherry ou GFP, respectivement, transformés en suspension monocellulaire, mélangés ensemble à un rapport de 1: 1 et co-transplantés en embryons de 2 dpf. ( B ) Un embryon de 6 dpf co-transplanté avec une suspension mixte de cellules tumorales cérébelleuses marquées par GFP et de cellules tumorales marquées par mCherry à partir du tectum optique. Différences dans les propriétés invasives de chaque tumeur dans tLe même récepteur peut être observé à l'aide d'une microscopie à fluorescence. Dans cet exemple, les cellules tumorales marquées par mCherry migrent plus largement que celles marquées avec GFP (flèches). ( C ) Chronologie du traitement médicamenteux sur les embryons transplantés avec des cellules tumorales. ( D ) Images d'animaux représentatifs à la fin du schéma de traitement (8 dpf) et à 8 semaines après le traitement (8 wpf), avec un contrôle DMSO ou un inhibiteur de MEK 50 μM. La charge tumorale peut être mesurée en quantifiant la fluorescence, comme décrit 17 . Dans cette expérience, la croissance des cellules tumorales marquées par mCherry est réduite dans les embryons traités par un inhibiteur de MEK et se traduit par une réponse durable chez l'adulte. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce protocole décrit un test de transplantation simple et efficace qui implique l'injection de cellules tumorales de poissons zèbres dans le ventricule d'un embryon de 2 dpf qui développera un système immunitaire entièrement compétent. Jusqu'à présent, le poisson zèbre CNS-PNET 17 et le mélanome (données non représentées) ont été transplantés avec succès pour des études à long terme sur le comportement des cellules tumorales et l'invasion. Les étapes critiques de ce protocole incluent la garantie de la taille appropriée de l'alourdissement de l'aiguille et de la suspension appropriée des cellules tumorales et des embryons hôtes d'anesthésiant adéquats. Pour chaque chercheur individuel, une meilleure optimisation de cette technique peut inclure l'ajustement de la concentration de cellules tumorales, de la pression d'injection et de l'orientation de l'embryon. En outre, il peut y avoir une hétérogénéité dans la viscosité des suspensions provenant de différentes tumeurs, de sorte que différents types de tumeurs peuvent être plus ou moins difficiles à ré-suspendre et à transplanter. Cependant, en ajustant la taille de l'alésage de l'aiguille et en utilisant difféDes dilutions de location de la suspension tumorale, il est possible de surmonter les difficultés associées aux viscosités tumorales.

Dans notre expérience, les raisons les plus courantes pour les cellules éparses / les masses cellulaires incohérentes dans le ventricule sont les suivantes: 1) la suspension de cellules tumorales est trop diluée; 2) la taille de l'aiguille est trop petite; 3) le temps d'injection et la pression sont trop faibles; Et / ou 4) les tissus restants n'ont pas été filtrés de la tumeur et sont logés dans l'aiguille. Lorsque la suspension de cellules tumorales sort du ventricule après injection, il est probablement dû à: 1) le placement de l'aiguille contre le plancher du ventricule; 2) une pression et un temps d'injection élevés; Et / ou 3) une taille d'alésage de l'aiguille trop grande. La faible survie des embryons transplantés peut être causée par: 1) l'anesthésie des embryons pendant une période prolongée; 2) laisser sécher les embryons sur la plaque d'injection; 3) l'injection de bulles d'air dans le ventricule; Et / ou 4) piercing organes vitaux, tels que le cerveau etCœur, parce que l'aiguille a traversé le ventricule.

Les méthodes antérieures de transplantation de tumeur dans le cerveau adulte ou embryonnaire du poisson zèbre dépendent de l'immunosuppression chez les adultes (génétiquement, pharmacologiquement ou par rayonnement) ou sont limitées à des études à court terme de cellules humaines ou de souris chez les embryons 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Par exemple, les tumeurs cérébrales de souris peuvent être injectées par voie intranasale dans du poisson zèbre juvénile juvénacé de dexaméthasone-immunodéprimé, 30-dpf, pour une utilisation dans des tests de médicaments précliniques à court terme (~ 2 jours) 54 . Cependant, le site d'injection dans ces expériences est obscurci par le crâne et le tissu cérébral et entraîne probablement des dommages aux tissus cérébrales normaux, ce qui réduit la viabilité de l'hôte et l'efficacité de la greffe. Une autre méthode récemment décrite implique l'injection de gliob humainLastoma dans la région du cerveau central des embryons de poissons zèbres, ce qui a permis l'analyse à court terme de la croissance, de l'invasion et de la réponse aux médicaments 43 . Encore une fois, la localisation précise du site d'injection est variable et endommage probablement les tissus normaux. Ainsi, les méthodes antérieures de transplantation embryonnaire de cerveau compromettent souvent la viabilité des hôtes, ce qui limite ces études à une analyse à court terme ( c.-à-d. De 2 à 14 jours), ce qui entraîne une variabilité accrue entre les injections individuelles en raison de sites d'injection obscurs, Analyse à long terme des comportements cellulaires et des réponses aux médicaments ou de la ré-transplantation à travers plusieurs générations.

La méthode décrite ici traite des limites actuelles des techniques embryonnaires de transplantation embryonnaire et de transplantation de poissons zèbres en permettant aux chercheurs de: 1) s'injecter de façon reproductible dans le même endroit, avec un dommage minimal sur le tissu environnant; 2) visualiser directement le site d'injection pour maximiserEfficacité de la greffe; 3) transplanter des centaines d'embryons par jour; 4) permettre aux tumeurs de pousser chez des animaux immunitaires; 5) permettent la surveillance du comportement des cellules tumorales et des réponses durables aux médicaments pendant la vie du poisson zèbre; Et 6) permettent la ré-transplantation de tumeurs pendant de nombreuses générations pour des études potentielles sur l'évolution tumorale ou les mécanismes de rechute de drogue. En outre, ce protocole permet aux chercheurs d'utiliser tout génotype de poisson zèbre pour l'évaluation de la réponse de l'hôte, y compris différentes populations immunitaires. Ces attributs rendent cette méthode facilement adaptable par tout laboratoire qui effectue déjà des micro-injections standard dans le poisson zèbre. Enfin, bien que cette méthode soit idéale pour les injections orthotopiques de tumeurs cérébrales de poissons zèbres, lors de la transplantation d'autres types de tumeurs, comme le foie ou le pancréas, le site orthotopique peut être plus important que la compétence immunitaire ( par exemple, si un chercheur étudie les effets du stromal Microenvironnement sur la croissance tumorale). Dans ce scénario, leLes modèles de poisson zèbre nouvellement développés et immunodéprimés peuvent être plus appropriés pour effectuer des transplantations de tumeur orthotopique 11 .

Ce protocole a été utilisé pour effectuer des tests de compétition de cellules tumorales et pour injecter des tumeurs à double étiquette. Une stratégie de traitement potentielle pour l'évaluation de l'efficacité des composés chimiques sur la tumorigénèse, qui implique le traitement des embryons post-transplantation par l'addition du médicament à l'eau, a également été discutée. Un procédé pour le traitement ex vivo de cellules tumorales avant la transplantation était également précédemment signalé 17 . En outre, les tumeurs transplantées ont été regroupées pour de multiples cycles de ré-transplantation, ce qui sera bénéfique pour les études d'évolution tumorale et de chimisistance 17 . Actuellement, les études précliniques dépendent de xénogreffes de souris pour évaluer l'efficacité des composés potentiels. Cependant, ces études prennent beaucoup de tempsEt coûteux. Compte tenu du degré élevé de conservation des voies de signalisation oncogénique entre le poisson zèbre et les humains 28 , on s'attend à ce que cette méthode viendra compléter les études classiques sur les cellules de souris et humaines pour permettre une identification plus rapide des composés efficaces dans les essais précliniques et cliniques. En fin de compte, cette méthode pourrait s'avérer utile pour le dépistage chimique rapide des tumeurs primaires des patients, ce qui pourrait propulser davantage l'initiative de médecine personnalisée. Cependant, les conditions de croissance à long terme des cellules humaines dans le poisson zèbre (adulte ou embryon) doivent encore être identifiées.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions les deux réviseurs pour d'excellentes suggestions et améliorations au manuscrit. Nous remercions également Huntsman Cancer Institute / University of Utah pour l'élevage et la maintenance. Ce travail a été financé par l'American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), une subvention NIH (programme P30 CA042014 CRR), University of Utah Seed Grant et Huntsman Cancer Foundation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Eau d’œufdans la maisonpour maintenir les embryons, faire la plaque d’injection  ;
Bleu de méthylène  ;Sigma-AldrichM9140ajouter à l’eau de l’œuf pour prévenir la croissance fongique
Boîte de Pétri ThermoFisherFB0875711Z  ;logement des embryons, fabrication de plaques d’injection
50 mL  ; bécher (2 pouces de diamètre)Toute marquefabriquant une plaque d’injection
AgaroseDenvilleCA3510-8fabrication d’une plaque d’injection
Récipient en verreToute marquefabriquant une plaque d’injection
Pince à épilerOutils scientifiques fins11295-10dissection de tumeur
Lame de rasoirThermo Fisher12640préparation à l’aiguille, dissection tumorale
Lame de verre enveloppée dans du parafilmpréparation d’aiguillemarque
Phosphate Tamponné Saline 1x, pH 7,4Life Technologies10010023résuspension tumorale
Passoire cellulaire, 40 & micro ; mCorning Falcon352340remise en suspension
tumorale 1 000 & micro ; L filtre pointestoute marquetumor resuspension
100 & micro ; L filtres pointesn’importe quelle marquetumor resuspension
50 mL tubes coniquesGenesee Scientific  ;21-108résuspension tumorale
Tubes coniques de 15 mLGenesee Scientific  ;21-103  ;remise en suspension tumorale
1,7 mL de microtubesGenesee Scientific  ;24-281resuspension tumorale
MicropipettesToute marqueremise en suspension et transplantation tumorale
Capillaire en verre (sans filament)World Precision Instruments  ; TW120-4transplantation de tumeur
Extracteur d’aiguilleSutter InstrumentsP-97transplantation de tumeur
Embouts de microchargeurEppendorf930001007transplantation de tumeur
Micro-injecteurHarvard ApparatusPLI-90transplantation de tumeur
Tricaïne-S (MS-222)Western ChemicalTRS1transplantation de tumeur, anesthésique
Sonde coudéeOutils scientifiques fins10140-02Manipulation d’embryons
Pipette de transfertmanipulation d’embryonsmarque
CentrifugeuseEppendorf5810Rnécessaire lors de la remise en suspension d’une tumeur
MicrocentrifugeuseEppendorf5424remise en suspension d’une tumeur
StéréomicroscopeOlympusTransplantation de tumeurSZ61
Stéréomicroscope fluorescentImagerie OlympusSZX16Transplantations de tumeurs
Caméra microscopeImagerie OlympusDP-72Transplantations de tumeurs
Méthylcellulose  ;Imagerie Sigma-AldrichM7140Transplantations tumorales
IncubateurToute marquede maintien des embryons, réchauffement de la plaque d’injection
Micro-ondesToute marquefabriquant une plaque d’injection
ÉchelleToute marquefabriquant une plaque d’injection
GantsToute marqueles aspects du protocole
Agarose à bas pointToute marqueImagerie confocale d’embryons Plat à
fond de verreMattek CorporationP35G-1.0-20-CImagerie confocale d’embryons
Microscope confocal à balayage laser OlympusFLUOVIEW FV1200Imagerie confocale d’embryons
PronaseRoche Diagnostics11459643001embryons
PBSToute marqueMise en suspension de cellules tumorales/tumorales
Plaque à 12 puitstraitement médicamenteux d’embryonsmarque
commerciale Pipette de transfert à alésage mincetraitement médicamenteux d’embryonsmarque
HémocytomètreN’importe quelle marquePour compter les cellules tumorales en suspension
N2Toute marque commercialePour la configuration du micro-injecteur
commerciale commerciale Toute de commerciale commerciale commerciale commerciale Toute de commerciale nécessaire lors d’une commerciale commerciale commerciale commerciale tous commerciale déchorionnés commerciale Tout de Tout de commerciale commerciale

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