Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l'ingénierie tissulaire

Résumé

Nous présentons un protocole pour isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux dérivé qui représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent être isolés rapidement, ne nécessitent pas dans le traitement in vitro et, par conséquent, peut être utilisé pour prévascularisation une étape dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire.

Résumé

Un réseau microvasculaire fonctionnelle est d'une importance cruciale pour la survie et l'intégration des constructions de tissu d'ingénierie. A cet effet, plusieurs stratégies angiogéniques et prévascularisation ont été mis en place. Cependant, la plupart des approches basées sur les cellules comprennent chronophages étapes in vitro pour la formation d'un réseau microvasculaire. , Ils ne sont donc pas adaptés pour peropératoires procédures en une seule étape. fragments microvasculaires adipeuses dérivées de tissu (ad MVF) représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent facilement être isolées à partir de tissu adipeux et présentent une morphologie fonctionnelle microvaisseaux. De plus, ils réassembler rapidement dans de nouveaux réseaux microvasculaires après l' implantation in vivo. En outre, ad-MVF ont été montré pour induire lymphangiogenèse. Enfin, ils sont une riche source de cellules souches mésenchymateuses, qui peut en outre contribuer à leur fort potentiel de vascularisation. Dans des études précédentes, nous avons démontré la vascularizati remarquablesur la capacité d'ad-MVF dans l'os d'ingénierie et de substituts cutanés. Dans la présente étude, nous présentons un protocole standardisé pour l'isolement enzymatique ad-MVF de tissu adipeux de souris.

Introduction

L' ingénierie tissulaire se concentre sur la fabrication de produits de remplacement de tissus et d' organes qui maintenir, rétablir ou d' augmenter la fonction des inopérable homologues in vivo ^{1, 2.} Le sort des constructions de l' ingénierie tissulaire dépend essentiellement d' une vascularisation adéquate ^3. Réseaux microvasculaires au sein de ces constructions doivent être organisés hiérarchiquement avec artérioles, capillaires et veinules pour permettre la perfusion sanguine efficace après anastomose à la vasculature du bénéficiaire ^4. La génération de ces réseaux est parmi les principaux défis dans l'ingénierie tissulaire. A cet effet, un large éventail de stratégies de revascularisation expérimentales a été mis en place au cours des deux dernières décennies , ^{5, 6.}

approches angiogéniques stimulent la croissance interne des microvaisseaux bénéficiaires dans Tiss d'ingénierieues par des moyens de modification de structure d'échafaudage ou physico - chimique, telles que l'incorporation de facteurs de croissance ^7. Toutefois, pour les grandes constructions de vascularisation en trois dimensions, des stratégies dépendant de l' angiogenèse sont nettement limités par des taux de croissance lente de développement microvaisseaux ^8.

Au contraire, le concept de prévascularisation vise pour la génération des réseaux microvasculaires fonctionnelles au sein des constructions de tissus avant leur implantation ^9. Prévascularisation classique implique la co-culture de cellules de formation de vaisseaux, comme les cellules endothéliales, les cellules murales ou des cellules souches ^10, à l' intérieur des échafaudages. Après la formation du réseau microvasculaire, les constructions prévascularisées peuvent alors être implantés dans des défauts du tissu. Il convient de noter, cette approche prévascularisation est difficile à appliquer dans un contexte clinique, car elle est basée sur in vitro complexe et prend du temps </ em> procédures, qui sont limitées par les principaux obstacles réglementaires ^9. Par conséquent, il y a encore un besoin pour le développement de nouvelles stratégies de prévascularisation qui sont plus appropriés pour une large application clinique.

Une telle stratégie de prévascularisation peut être l'application des dérivées de tissu adipeux fragments microvasculaires (ad-MVF). ad-MVF représentent des unités de vascularisation puissants qui peuvent être récoltées en grandes quantités dans le tissu adipeux des rats ^{11, 12} et ¹³ les souris. Ils se composent d'artérioles, capillaires et veinules segments de vaisseaux, qui présentent une morphologie de microvaisseaux physiologique avec une lumière et de stabilisation des cellules périvasculaires ^{14, 15.} Cette caractéristique unique permet l'implantation immédiate des échafauds ad MVF tête de série dans les défauts des tissus sans préculture. Là-bas, l'annonce-MVF réassembler rapidementà des réseaux microvasculaires fonctionnelles. Par ailleurs, ad-MVF représentent une riche source de cellules souches mésenchymateuses ^16, ce qui peut contribuer en outre à leur capacité de régénération frappant. Par conséquent, ad-MVF sont de plus en plus utilisé dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

L'isolement de l' ad-MVF a été initialement mis en place chez les rats ^{11, 12.} Nous décrivons ici un protocole qui permet l'isolement normalisé ad-MVF de souris à partir de tampons de graisse épididyme. Cela peut fournir de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents fonction ad-MVF en utilisant des modèles de souris transgéniques.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées selon l'Institut national des directives de santé pour l'utilisation des animaux de laboratoire et ont suivi les directives institutionnelles (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Sarrebruck, Allemagne).

1. Préparation des instruments chirurgicaux

1. Tenir prêt les ciseaux de dissection, des pinces chirurgicales, des petits ciseaux de préparation, une pince fine et une boîte de Pétri stérile avec un milieu de Eagle modifié par 15 mL Dulbecco (DMEM, 10% de sérum de veau foetal (SVF), 100 U / ml de pénicilline, 0,1 mg / mL de streptomycine ) pour la récolte coussinets adipeux épididyme.
2. Exposer les instruments chirurgicaux à une solution désinfectante pendant 5 min. En variante, les stériliser (stérilisation à la vapeur, 121 ° C, 20 min).

2. Les animaux et anesthésie

1. Choisissez avec soin la souche des souris comme indiqué pour l'étude et la sujet à l'étude.
   NOTE: Dans cette étude, nous avons utilisé des hommes de type sauvage C57BL / 6 comme donneurs pour la récolte de la graisse épididyme. D' un intérêt, ad-MVF peut également être isolé à partir de la protéine fluorescente verte transgéniques (GFP) animaux donneurs -positif (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / j) ^22. Cela porte un grand avantage, les fragments sont facilement détectables par coloration immunohistochimique de la GFP après implantation dans les souris de type sauvage GFP-négative ^14.
2. Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale de xylazine (15 mg / kg) et de la kétamine (75 mg / kg). Assurez-vous que les animaux sont profondément anesthésiés en effectuant une pincée de pied sans réponse. lubrifiant oculaire n'est pas indiqué que les animaux donneurs sont sacrifiés après la récolte de matières grasses.
   REMARQUE: Assurez-vous que l'analgésie et la stérilité chirurgicale sont en accord avec les directives respectives du pays et de l'institution où les expériences sont prévues.

le "> 3. La récolte de l'épididyme Pads Fat

1. Transfert de l'animal à une table d'opération. Placez l'animal dans une position couchée sous une loupe binoculaire chirurgicale et confirmer l'anesthésie profonde à l'aide pincement de l'orteil.
2. Immobiliser les pattes en les collant à un drap chirurgical et désinfecter l'abdomen avec une solution de désinfection.
3. Séparer la peau abdominale libre de la couche musculaire sous-jacent avec les ciseaux de dissection.
4. Effectuer une laparotomie médiane avec des ciseaux de dissection et dérouler latéralement les rabats de la paroi abdominale.
5. Bilatéralement identifier les testicules, l' épididyme et le coussinet adipeux épididymaire à l' aide des pinces fines (Figure 1). Ne pas nuire aux structures intestinales pour prévenir la contamination fécale des tampons de graisse.
6. Récolter les coussinets adipeux de l'épididyme avec les petits ciseaux de préparation et la pince fine sous la loupe binoculaire. Gardez une marge de sécurité de plusieurs mm entre les épididyme et la graisseréduire le risque de récolte épididymaire accidentelle.
   NOTE: Cette procédure peut également être effectuée sans stéréomicroscope. Cependant, cela peut également augmenter le risque de blessure accidentelle des épididyme et cordons spermatiques.
7. Transférer les coussinets adipeux épididymaire dans une boîte de Petri contenant 15 ml de DMEM préchauffé à 37 ° C pendant le transport vers le laboratoire de la cellule.
8. Sacrifier l'animal par une incision de l'aorte abdominale ou dislocation cervicale.

4. Isolation ad-MVF

1. Préparer trois boîtes de Petri stériles de 15 mL de tubes solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile en polypropylène de 14 ml (PP), un flacon d'Erlenmeyer de 50 ml stérile, des tubes stériles à centrifuger conique de 1,5 ml et de ciseaux fins stérilisés.
2. Laver les coussinets adipeux trois fois dans des boîtes de Petri avec 15 ml de PBS sous une hotte à flux laminaire.
3. Transférer la graisse dans un tube de 14 ml PP. Déterminer le volume de tissu adipeux récolté (en ml) au moyen de til échelle du tube. Hacher le tissu adipeux mécaniquement avec les ciseaux fins jusqu'à obtention d'une suspension homogène de tissu.
4. Transférer le tissu haché avec deux volumes de collagénase NB4G (0,5 U / ml de PBS) dans un flacon Erlenmeyer de 50 ml à l'aide d'une pipette de mesure de 10 ml. Le volume total est trois fois le volume de tissu adipeux mesurée à l'étape 4.3. Effectuer la digestion de tissu dans un incubateur pendant 10 min sous agitation vigoureuse au moyen d'un agitateur automatique (taille de la barre d'agitation magnétique: 25 mm) dans des conditions atmosphériques 37 ° C et humidifié avec 5% de CO _2.
5. Observez une petite fraction (10 pi) du tissu digérées au microscope pour déterminer si la digestion peut être arrêté. Vérifier que le digestat contient principalement ad-MVF « libre » à côté de cellules individuelles, ce qui indique l'endroit approprié pour arrêter le processus de digestion enzymatique (figure 2).
   REMARQUE: Cette étape nécessite de l'expérience et la procédure est essentielle pour la qualitéde isolé ad-MVF. digestion prolongée graisse entraîne une suspension unicellulaire sans ad MVF.
6. Neutraliser l'enzyme avec deux volumes de PBS / 20% de FCS. Le volume total est trois fois le volume de la suspension cellulaire des vaisseaux à l'étape 4.4. Transférer la suspension cellulaire navire retour dans de nouveaux tubes en PP.
7. Incuber la suspension pendant 5 min à 37 ° C et ad-MVF séparer de la graisse restant par gravité. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant principal de la graisse avec une pipette de précision 1 ml. Répétez plusieurs fois ce cycle avec une pipette de précision de 100 pi jusqu'à ce que la suspension semble être sans gras.
8. Mettre un filtre de 500 um au sommet d'un tube de centrifugation conique de 50 ml. Transférer la suspension cellulaire navire avec une pipette de mesure de 10 ml dans les tubes de 14 mL PP sur la membrane de filtre pour éliminer les caillots restant gras. Transférer la suspension filtrée dans de nouveaux tubes de 14 ml PP en fonction du nombre d'ad-MVF isolats individuels pour les expériences prévues.
   REMARQUE: Pour en Vitrdosages o centrés sur la formation du réseau microvasculaire, il peut être avantageux de purifier davantage la suspension de cellules-récipient pour améliorer la qualité de formation d'image lors d' analyses microscopiques. A cet effet, la suspension peut être filtrée une fois de plus avec un filtre de 20 um pour éliminer les cellules individuelles de l'ad-MVF collectées sur le filtre.
9. Centrifuger la suspension cellulaire navire (600 xg, 5 min, température ambiante) pour obtenir un culot contenant ad-MVF.
10. Après centrifugation, éliminer le surnageant jusqu'à 1 ml reste. Remettre en suspension le culot avec ad-MVF dans ce 1 mL et transférer la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml conique.
11. Centrifuger la suspension ad-MVF dans le tube de microcentrifugeuse (600 xg, 5 min) pour obtenir un culot.
12. Retirer le surnageant pour remettre en suspension le culot dans le volume final requis de PBS / 20% de FCS.
    NOTE: Le nombre d'ad-MVF par isolat peut être évaluée par comptage microscopique. A cet effet, 1/10 de la dernière cellule-Vessesuspension de l est dilué 1:10 dans du PBS et 100 ul de cette dilution sont transférés dans un puits d'une plaque à 96 puits. Le nombre total de ad-MVF présentant une morphologie de type vaisseau est ensuite compté et extrapolée à l'ensemble isolat. La concentration ad-MVF requis et la purification peuvent être adaptés individuellement aux in vitro ou dans la demande respective vivo de l'ad-MVF. Cela peut comprendre l'incorporation d'ad-MVF dans des gels de collagène pour l'analyse in vitro de la formation de réseau microvasculaire ou l'ensemencement du ad-MVF sur des échafaudages pour l' implantation in vivo dans des défauts du tissu.

Résultats

Dans la présente étude, nous avons effectué six procédures d'isolement ad MVF avec le tissu adipeux de 7 à 12 mois vieux mâle de type sauvage C57BL / 6 souris (poids corporel moyen: 35 ± 1 g). La figure 1 illustre la récolte des plaquettes murines de graisse épididymaire avec l' isolation ad-MVF mécanique et enzymatique subséquente. Le temps nécessaire à la récolte de matières grasses était de 30 minutes et pour l'isolement des ad-MVF était de 120 min. Au total, la procé...

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un protocole bien établi pour l'isolement des ad-MVF. L'obtention ad-MVF du tissu adipeux de souris est une procédure simple avec quelques étapes critiques. Les souris présentent différents dépôts de graisse sous-cutanée et intra-abdominales. Comme précédemment décrit pour les rats, la source de matières grasses la plus appropriée pour l'isolement de l' ad-MVF sont les coussinets adipeux épididymaire en raison de leur taille, de structure homogène et une contamination mi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à microcentrifuger conique de 1,5 mL	VWR, Kelsterbach, Allemagne	700-5239
100-µ ; Pipette de précision L	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	Pipette
10 ml	Costar, Corning Inc., New York, États-Unis	4488
Tubes en PP de 14 ml	Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne	187261
Pipette de précision de 1 ml	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	4920000083
500-µ ; m filtre (pluriStrainer 500 µ ; m)	HISS Diagnostics, Fribourg, Allemagne	43-50500-03
Tube à centrifuger conique de 50 mL	Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne	227261
Fiole Erlenmeyer de 50 mL	VWR, Kelsterbach, Allemagne	214-0211
Plaque à 96 puits	Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne	65518
solution de détachement de cellules (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA États-Unis	00-4555-56
C57BL/6 souris	Charles River, Cologne, Allemagne	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J souris	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, États-Unis	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne	553354
Collagénase NB4G  ;	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Allemagne	17465.02	Lot testé par le fabricant pour l’activité enzymatique
Ciseaux de dissection	Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Allemagne	BC 601
Colorant de liaison à l’ADN (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne	B2261
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)  ;	PAN Biotech, Rickenbach, Allemagne	P04-03600
Sérum de veau fœtal (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Allemagne	S0615
Pinces fines	S& T AG, Neuhausen, Suisse	FRS-15 RM-8
Ciseaux fins	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, États-Unis	503261
Substitut cutané (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Kétamine  ;	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Allemagne	7005294
M-IgG2akAL488  ;   ;	eBioscience, San Diego, CA États-Unis	53-4724-80
Octeniderm (solution désinfectante)	Schü ; lke & Mayer, Norderstedt, Allemagne	118211
Pénicilline/Streptomycine	Biochrom, Berlin, Allemagne	A2213
Boîte de Pétri	Greiner bio-one, Frickenhausen, Allemagne	664160
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Lonza Group, Bâle, Suisse	17-516F
pluriStrainer 20-µ ; m (20 & micro ; m filtre)	HISS Diagnostics, Fribourg, Allemagne	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne	553930
Petits ciseaux de préparation	S& T AG, Neuhausen, Suisse	SDC-15 R-8S
Pince chirurgicale	Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Allemagne	BD510R
Ruban adhésif (Heftpflaster Seide) 1,25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Allemagne	1671801
Xylazine  ;	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Allemagne	1320422
&alpha ;-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA États-Unis	53-9760-82	L’étiquetage intracellulaire nécessite en outre Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne ; #554722)