Article de méthode

Une approche de diagnostic résolue par un composant pour une étude sur les allergènes au pollen dans les ressortissants chinois avec la rhinite allergique et / ou l'asthme

DOI :

10.3791/55723

⸱

4 juin 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, 2National Clinical Research Center of Respiratory Disease, 3Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, 4Department of Allergy and Clinical Immunology, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 5Department of Respiratory Medicine, Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail décrit un protocole qui utilise une approche résolue par les composants pour étudier la sensibilisation aux allergènes de pollen de gazon dans une cohorte de patients du sud de la Chine avec une rhinite allergique et / ou de l'asthme.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sensibilisation au pollen d'herbe impose un risque global pour les maladies allergiques des voies aériennes. Bien que la prévention repose sur une enquête locale sur les allergènes du pollen, les données sur ce sujet sont limitées dans le sud de la Chine. Toutes les données disponibles ont été obtenues par des questionnaires autodéclarés, des tests cutanés et des tests IgE totaux ou spécifiques en utilisant des extraits bruts. Pour de nombreuses raisons, ces méthodes ne sont pas fiables. La réactivité au sérum sIgE à l'herbe des Bermudes, à l'herbe Timothy et aux allergènes Humulus scandens dans une cohorte de patients de la Grande Canton (la plus grande ville du sud de la Chine et sa périphérie) avec une rhinite allergique et / ou un asthme ont été examinées à l'aide d'un analyseur d'immunoessai entièrement automatisé en tant que composant Outil de diagnostic résolu (CRD).

Pour la première fois, on a démontré une prévalence considérablement élevée de la positivité de l'herbage Bermuda chez les sudistes chinois avec une rhinite allergique et / ou un asthme. Chez ces patients, une prévalence subtile de sensibilisationÀ l'herbe de Timothy et Humulus scandens a également été noté, ce qui peut résulter d'une réactivité croisée, car les deux derniers ne sont pas fréquents dans la région. Cela a également été soutenu par la détection des composants allergènes.

Les analyseurs d'immunodosage entièrement automatisés peuvent offrir une cohérence satisfaisante entre les régions, les laboratoires et les établissements et au fil du temps. L'automatisé de l'instrument peut permettre une détection standardisée qui n'aurait pas été facilement révélée avant l'avènement de CRD.

Il s'agit d'une étude qui utilise une approche CRD pour étudier la sensibilisation aux allergènes de pollen de gazon dans le sud de la Chine. Il ajoute à la preuve actuelle dans la littérature. Des études futures sont nécessaires pour valider ces résultats. Cependant, bien que CRD soit un outil utile, les résultats obtenus avec l'analyseur de dosage immunologique entièrement automatisé ne devraient pas remplacer d'autres études de laboratoire, évaluations cliniques et expertise médicale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le pollen d'herbe représente près de 50% des allergies liées à l'immunoglobuline E (IgE) et, en raison de sa nature aérienne, impose un risque global de maladies allergiques des voies respiratoires, en particulier l'asthme et la rhinite allergique 1 , 2 , 3 , 4 . La prévention contre les allergies au pollen dans une région repose sur des informations sur la répartition locale des allergènes du pollen. Malheureusement, le spectre des allergènes sensibilisants varie d'un endroit à l'autre - une observation généralement connue sous le nom de spécificité régionale.

En Chine, un vaste territoire de l'Asie de l'Est, la spécificité régionale de la sensibilisation au pollen d'herbe est compliquée par des données limitées actuellement disponibles dans la partie sud de ce pays au cours des dernières décennies 5 . Une telle pénurie de données a entraîné une difficulté à montrer le sens général du pollen d'herbeDans ce grand pays 6 . De plus, les données très limitées sur les ressortissants chinois ont été largement obtenues à partir de questionnaires auto-rapportés, de tests cutanés (plutôt que de tests sériques de laboratoire), de mesures totales d'IgE (plutôt que d'IgE spécifiques d'allergènes (sIgE)) et de détection de sIgE aux allergènes ( Plutôt que de molécules de composants allergènes).

L'auto-déclaration des symptômes allergiques peut être peu fiable en ce qui concerne les allergènes spécifiques. Les tests de piqûre cutanée, bien que largement accessibles, impliquent l'utilisation d'extraits d'allergènes bruts non standardisés, qui peuvent contenir d'autres composants sensibilisants qui confondent l'interprétation des résultats. La fiabilité du test cutané cutané dépend également de la manipulation habile par des allergologues ou des infirmières spécialisées, l'utilisation récente d'histamine et la compliance du patient (parfois très difficile pour les jeunes enfants). L'IgE totale est utile pour le dépistage d'une allergie mais ne détermine pas judicieusementEtruit des allergènes chez un patient. En outre, presque tous les allergènes contiennent un certain nombre de molécules de composants allergènes. La sensibilisation aux composants majeurs ( p. Ex ., Der p 1 et Der p 2 des acariens domestiques) peut suggérer une allergie "authentique" (allergie à un allergène spécifique, plutôt qu'une fausse positivité due à des réactions croisées avec d'autres allergènes), mais une sensibilisation À certains ( c.-à-d., Le Der-10 à réaction croisée, une tropomyosine) ne peut pas 7 .

Avant la mise en place des diagnostics résolus par des composants (CRD), ces retards décevants entravaient les études d'allergènes en Chine. CRD détecte précisément les composants d'un allergène en utilisant des molécules allergènes recombinantes ou purifiées, ce qui rend la mesure facilement quantifiable et caractérisable 8 . Au cours des dernières décennies, les études sur les allergies ont souvent utilisé des extraits bruts d'allergènes qui contiennent inévitablement un certain nombre de composants non pertinents. Beaucoup de ces coLes composants sont inertes, mais parfois, certains peuvent conduire à des réactions positives confondantes. L'utilisation de molécules allergènes recombinantes ou purifiées dans CRD peut contourner ceci et donc fournir une meilleure précision de test. Lorsqu'il est traité en microarrays, une approche CRD permet d'écouter ou d'identifier rapidement la sensibilisation à des centaines de molécules allergènes chez des sujets individuels. Une étude CRD bien conçue sur la sensibilisation au pollen d'herbe dans le sud de la Chine manque actuellement. Idéalement, une telle étude devrait inclure une population locale d'une couverture géographique considérable, compte pour les pollens d'herbe communément signalés en Chine et abordent les aspects techniques mentionnés ci-dessus. Pour atteindre un niveau pratique de pertinence clinique et pour faciliter le recrutement d'échantillons de sérum, une enquête précoce sur la sensibilisation aux pollens d'herbe comme allergènes inhalés peut également être axée sur les patients atteints de troubles respiratoires allergiques plutôt que sur la population générale.

Ce travail décrit une méthodeUtilisé pour tester la réactivité sérique chez Bermuda Grass, Timothy grass et Humulus scandens chez les patients de la Grande Canton (la plus grande ville du sud de la Chine et ses environs) avec une rhinite allergique et / ou un asthme utilisant l'approche CRD 5 . Ces résultats sur la sensibilisation à ces pollens subtropicaux et tempérés dans le sud de la Chine ajoutent des preuves importantes à celles actuellement dans la littérature.

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Protocole

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Le protocole d'étude, y compris l'utilisation de l'échantillon de sérum humain, a été approuvé par le Comité d'éthique, premier hôpital affilié de l'Université médicale de Guangzhou. Tous les participants ont offert un consentement écrit, soit de façon autonome, soit par l'intermédiaire de leurs parents (dans le cas d'un enfant). Le protocole a été enregistré en ligne (Chinese Clinical Trial Registry, Reg No .: ChiCTR-DCC-13004003, voir http://www.chictr.org/cn/).

1. Identification de la population étudiée

REMARQUE: Le référentiel d'informations sur les allergies du Laboratoire clé d'état des maladies respiratoires (AIR-SKLRD) est la principale source de recrutement de patients, car AIR est la plus grande base de données documentée sur les patients pour les tests d'allergènes dans le sud de la Chine 9 , 10 . AIR a stocké des échantillons de sérum de patients depuis près d'une décennie. En bref, ces échantillons stockés ont été préalablement préparés par centrifugation de 5 mL oF sang veineux phlébotomisé pendant 10 min à 3 000 xg et récupération du surnageant. Les échantillons de sérum ont été placés dans des réfrigérateurs de -80 ° C pour un stockage à long terme. Les échantillons répondant aux critères d'inclusion des patients étaient prêts à être utilisés pour tous les tests dans la présente étude.

  1. À partir de la base de données AIR, récupérer des données sur les patients atteints de rhinite allergique et / ou d'asthme qui ont subi des tests de sérum pour l'allergène à l'herbe entre janvier 2013 et juin 2015, la période d'étude pré-conçue.
  2. Sélectionnez les patients atteints de rhinite allergique légère à modérée et / ou d'asthme selon la rhinite allergique et son impact sur l'asthme (ARIA) 11 et l'Initiative mondiale pour l'asthme (GINA) 12 lignes directrices. Assignez-les en tant que «groupe d'étude».
  3. Exclure les patients avec des dossiers médicaux incomplets, ceux perdus pour le suivi, ceux qui refusent de donner un consentement éclairé concernant l'utilisation de leurs échantillons de sérum à des fins scientifiques, ceux qui ont identifié iLa déficience nucléaire, ceux actuellement en immunothérapie ou les agents immunomodulateurs, ou ceux qui ont eu des infections parasitaires.
  4. Sélectionnez une cohorte contemporaine de patients atteints d'allergies non respiratoires ( c.-à-d., Eczéma, dermatite allergique et allergie alimentaire) selon les mêmes critères d'exclusion et assignez-les comme «groupe témoin».
  5. Assurez-vous que les échantillons de sérum ont été prélevés avant que des ordonnances ou des traitements ne soient administrés pour minimiser les effets de confusion sur les résultats du laboratoire. Exclure tout échantillon de sérum ne remplissant pas cette exigence.
  6. Assurez-vous que tous les sujets sont des résidents permanents de toutes les parties de la Grande Canton ( c'est-à-dire nés ou ont vécu ici depuis plus de 10 ans).

2. Étude des flux et des mesures d'intérêt

  1. Récupérer les échantillons de sérum des patients admissibles de la banque biologique. Pour tester un composant allergène / allergène, utiliser 140 μL de sérum (y compris 100 μL à remplirL'espace mort).
    REMARQUE: Le volume sérique total maximal nécessaire pour chaque patient dans cette étude est: 3 allergènes spécifiques et 8 composants allergènes, sIgE = 140 μL * 11 = 1 540 μL.
  2. Lorsque vous utilisez cet instrument, testez principalement les échantillons de sérum pour les sIgE à des allergènes entiers de Bermuda Grass, Timothy Grass et Humulus scandens . Suivez les instructions de la section 3.
    NOTE: Ces pollens ont été sélectionnés pour les mesures parce que Bermuda grass 13 , 14 , 15 et Humulus scandens 16 ont été largement signalés en Chine, tandis que Timothy grass 17 , 18 , 19 est une espèce végétale typique qui vit dans des environnements allant du tropical au tempéré Zones et est le plus étudié dans le monde entier.
  3. En second lieu, tester les échantillons de sérum identifiés à l'étape 2.3 pour avoirSIgEs à des allergènes entiers pour la présence de sIgE à des composants allergènes de Bermudes [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209 ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211) et Phl p 12 (g212)], et les déterminants des glucides réactifs croisés [CCD (o214)]. Suivez les instructions de la section 3.

3. Procédure de test entièrement automatisée utilisant le système d'analyse des immunodosages

REMARQUE: toute la procédure de test d'allergène sIgE, entièrement automatisé et décrit ailleurs 7 , 8 , 9 , 10 , suit le protocole du fabricant.

  1. Démarrez l'analyseur de dosage immunologique entièrement automatisé ( par exemple, ImmunoCAP1000) et utilisez-le pour effectuer l'immunoessai tout au long de l'étude. Activez l'ordinateur intégré de gestion des données d'information (IDM).
    NOTE: L'analyse immunologiqueYzer est habituellement en mode veille.
  2. Lorsque "Primary Power" est allumé, allumez "System Power" et attendez 3 minutes jusqu'à ce que le logiciel intégré commence. Cliquez sur "Load Rinse Solution" et "Load Washing Solution".
  3. Ajouter 140 μL de sérum dans un flacon pour chaque test d'allergène / composant allergène. Étiquetez chaque flacon contenant 140 μL de sérum avec un numéro d'identification unique à chaque patient.
  4. À partir de l'interface IDM, exécutez les étapes suivantes en cliquant sur le menu.
    1. Vérifiez la fenêtre "Liste des demandes" sur le IDM pour vous assurer que "sIgE" est la méthode de test choisie.
    2. Chargez les tubes d'échantillonnage dans les supports d'échantillons et les tubes de contrôle de qualité dans les racks de contrôle de qualité, avec des codes à barres.
      NOTE: Pour chaque patient, les tests ont initialement été prévus pour sIgE à 3 allergènes spécifiques et 8 composants allergènes, ou 346 * 11 (3,806) tubes d'échantillonnage. Pour chaque tube d'échantillonnage, 3 tubes de contrôle de qualitéQui contiennent des niveaux bas, moyens et élevés de contrôle sIgE (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) ont été appariés. Finalement, seulement 58 patients qui ont testé un résultat positif dans le test primaire (étape 2.3) ont été examinés plus avant dans le test secondaire (étape 2.3). Le chargement des tubes peut être réglé automatiquement sur la console de l'ordinateur.
    3. Sélectionnez "Charger les réactifs" dans l'écran "Analyse du dosage". Complétez le chargement de l'échantillon et des racks de contrôle de la qualité, solution de développement, conjugué, étalonneurs, support, pipettes, solution d'arrêt et solution de lavage selon la «liste de charge» (voir la table des matériaux pour plus de détails).
    4. Dans «Charger et Démarrer», appuyez sur «OK».
      REMARQUE: À la fin de la mesure, les résultats apparaissent sur l'IDM.
    5. À partir de l'interface IDM, sélectionnez les données à exporter. Cliquez sur "Menu", "Approuver" et "Enregistrer sous" et exportez les résultats de mesure sIgE en tant que fichier de tableur.
    6. Importez la feuille de calcul à un logiciel statistique ( p. Ex. SPSS) 10 . En utilisant un module spécifique pour les coefficients de Spearman à partir du menu SPSS, analyse les corrélations de sensibilisation entre ces pollens d'herbe (sIgE positif à l'allergène entier) et les composants du pollen (sIgE positif aux molécules allergènes).

4. Définition de la réactivité sIgE

REMARQUE: Pour un échantillon de sérum non dilué, la gamme de mesure spécifique d'IgE est de 0,35 à 100 kU / L.

  1. Diluer les échantillons avec des valeurs de sIgE> 100 kU / L 1: 5 et re-dosage. Lorsque la valeur reste supérieure à 100 kU / L, procédez à d'autres dilutions jusqu'à atteindre un niveau de point final jusqu'à 1 000 kU / L.
  2. Sur la base de la valeur de seuil de 0,35 kU / L, considérez un niveau de sIgE supérieur à 0,35 kU / L pour être positif 5 , 7 , 10 . Évaluez le réactif≥0,35 et <0,70 kU / L), classe 2 (≥0,70 et <3,50 kU / L), classe 3 (≥ 3,50 et <17,50 kU / L), classe 4 (≥ 0,15 et <0,00 kU / L) 17.50 et <50.00 kU / L), classe 5 (≥50.00 et <100.00 kU / L) et classe 6 (≥100.00 kU / L).

5. Analyse statistique

  1. Analyser les données avec un logiciel statistique ( p. Ex. SPSS) 10 . Indiquer les données quantitatives en tant que moyenne et écart type, les données qualitatives en tant que fourchette médiane et interquartile (IQR) et les données catégoriques comme proportion de résultats positifs.
  2. Utilisez un test chi-carré pour la comparaison entre les groupes de proportions, un test t non apparié pour les données quantitatives et un test de somme de classement pour les données qualitatives.
  3. Utilisez le test de Pearson pour les analyses de corrélation entre les données paramétriques, avec les coefficients de corrélation exprimés en "r" et le test de Spearman pour les valeurs non paramétriques, avec tLes coefficients de corrélation exprimés par " r s ". Considérons que la signification statistique soit lorsque P- valeurs <0,05.

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Résultats

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L'analyseur de dosage immuno-automatisé entièrement automatisé utilisé dans cette étude a une structure en phase solide recouverte de couplages covalents d'allergènes ou de composants allergènes qui réagissent avec les molécules d'intérêt (sIgE) dans des échantillons de sérum du patient. Avec un programme automatique, l'analyseur élimine toutes les IgE non spécifiques avec 150 μL de solution de rinçage et les répète 5 fois. Ensuite, il ajoute des anticorps anti-IgE marqués aux enzymes (5...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les analyseurs d'immunodosage entièrement automatisés peuvent offrir une cohérence satisfaisante entre les régions, les laboratoires et les établissements et au fil du temps. Une telle procédure automatique a été considérée comme supportant de manière substantielle la recherche bancaire et les études cliniques, permettant la détection standardisée de nombreux allergènes et / ou composants allergènes, et identifient une réactivité croisée allergène probable qui n'aurait pas été facilement révélée avant l'avèn...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Yueming Su pour son aide dans la préparation de la figure. Cette étude a été financée par la Fondation Guangdong de Science et Technologie (Projet n °: 2014A020212352), le Guangzhou Education Bureau (1201630044; 1201630393) et la National Natural Science Foundation of China (NSFC 81572063; NSFC 81601394).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instrument ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)12-3800-01
Phadia Information Data Manager ProgicielThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)12-3801-11
Progiciel ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)12-3801-12
g2
( Herbe des Bermudes)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)14-4131-01
g6
(Fléole des prés)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)14-4100-01
w22
(Houblon japonais)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)14-4452-01
g216
(nCyn d 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suède)14-4972-01
g205
(rPhl p 1)		Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)14-5234-01
g208
(nPhl p 4)		Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)14-5288-01
g215
(rPhl p 5b)		Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)14-5338-01
g209
(rPhl p 6)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5289-01
g210
(rPhl p 7)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5290-01
g211
(rPhl p 11)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5291-01
g212
(rPhl p 12)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suède)14-5292-01
o214
Déterminants glucidiques à réaction croisée (CCD)		Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)14-5339-01
Conjugué IgE spécifique 400Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)10-9310-08
Bande étalonneuse IgE spécifiqueThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9459-08
Bande de contrôle de courbe IgE spécifiqueThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)10-9312-08
IgE spécifique anti-IgE ImmunoCAP ThermoFisher Scientific, Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)14-4417-01
ImmunoCAP Détection négative IgE spécifiqueThermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia, AB, Uppsala, Suède)10-9445-01
Contrôle des IgE spécifiques ImmunoCAP LThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9528-01
Contrôle des IgE spécifiques ImmunoCAP MThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9529-01
Contrôle des IgE spécifiques ImmunoCAP HThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9530-01
Solutionde développementThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9439-08
Solution d’arrêtThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)34-2271-58
Solution de lavageThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9202-08
FluoroCThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Suède)10-9264-01
Kit de solutions de maintenanceThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Suède)10-9476-01

Références

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