Ici, nous décrivons la préparation de tranches ventriculaires viables à partir de souris adultes et leur utilisation pour des enregistrements de potentiel d'action des électrodes pointues. Ces préparations multicellulaires fournissent une structure tissulaire similaire in vivo , ce qui en fait un modèle précieux pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques in vitro .
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Article de méthode
Tranches de coeur ventriculaire à courte aiguille murine pour études électrophysiologiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cardiomyocytes murins ont été largement utilisés pour des études in vitro de la physiologie cardiaque et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, les préparations multicellulaires de cardiomyocytes dissociés ne sont pas représentatives de la structure complexe in vivo des cardiomyocytes, des non myocytes et de la matrice extracellulaire, ce qui influence les propriétés mécaniques et électrophysiologiques du cœur. Nous décrivons ici une technique pour préparer des tranches ventriculaires viables de coeurs de souris adultes avec une structure de tissu préservée in vivo et démontrer leur aptitude à des enregistrements électrophysiologiques. Après l'excision du cœur, les ventricules sont séparés des oreillettes, perfusés avec une solution exempte de Ca2 + contenant du monoxime de 2,3-butanedione et incorporés dans un bloc d'agarose à faible teneur en masse fondue à 4%. Le bloc est placé sur un microtome avec une lame vibrante, et des tranches de tissu avec une épaisseur de 150 à 400 μm sont préparées en gardant la fréquence de vibrationDe la lame à 60-70 Hz et de déplacer la lame vers l'avant aussi lentement que possible. L'épaisseur des tranches dépend de l'application supplémentaire. Les tranches sont stockées dans la solution de Tyrode glacée avec 0,2 mM Ca 2+ et 2,3-butanedione monoxime (BDM) pendant 30 minutes. Ensuite, les tranches sont transférées à 37 ° C de DMEM pendant 30 minutes pour laver le BDM. Les tranches peuvent être utilisées pour des études électrophysiologiques avec des électrodes tranchées ou des réseaux de micro-électrodes, pour des mesures de force pour analyser la fonction contractile ou pour étudier l'interaction des cardiomyocytes et des tissus hôte présents dans les cellules souches transplantées. Pour les enregistrements d'électrodes pointues, une tranche est placée dans un plat de culture cellulaire de 3 cm sur la plaque chauffante d'un microscope inversé. La tranche est stimulée par une électrode unipolaire, et les potentiels d'action intracellulaire des cardiomyocytes dans la tranche sont enregistrés avec une électrode en verre tranchant.
Introduction
Des tranches de tissus minces ont été utilisées fréquemment dans la science fondamentale puisque Yamamot et Mcllwain ont montré en 1966 que l'activité électrique des tranches de cerveau est maintenue in vitro 1 . Depuis lors, des études électrophysiologiques et pharmacologiques ont été effectuées sur tranches de cerveau 2 , foie 3 , poumon 4 et tissu myocardique 5 , 6 , 7 . Les premiers enregistrements de pince-patch dans les tranches ventriculaires à partir de coeurs de rat néonataux ont été décrits en 1990 8 , mais cette technique est tombée dans l'oubli pendant un certain temps. Plus d'une décennie plus tard, notre groupe a mis au point une nouvelle méthode pour préparer des morceaux de coeur 11 embryonnaires murins, néonatals 10 et adultes. Ces tranches de tissus viables peuvent être utilisées pour des expériences aiguës (tranche pour adultesS peut être cultivé pendant plusieurs heures) ou des expériences culturelles à court terme (les tranches embryonnaires et néonatales peuvent être cultivées pendant quelques jours). Les tranches montrent in vivo, comme les caractéristiques électrophysiologiques et une propagation d'excitation homogène, comme l'ont évalué par un fort potentiel d'action des électrodes et des enregistrements de micro-électrodes 11 . En raison de leur morphologie «bidimensionnelle», ils permettent l'accès direct des électrodes d'enregistrement à toutes les régions du ventricule, ce qui en fait un outil intéressant pour les recherches électrophysiologiques et soulève de nouvelles options expérimentales par rapport aux coeurs entiers perfusés de Langendorff. La réponse médicamenteuse des tranches aux bloqueurs des canaux ioniques comme le verapamil (bloqueur de canal Ca 2+ ), le lidocain (bloqueur de canal Na + ), la 4-aminopyridine (inhibiteur de canal K + non sélectif dépendant de la tension) et la linopirdine (KCNQ K + -channel blocker) 9 , 11 correspond à des effets connus sur les cardiomyocytes dissociés. Les mesures de force isométrique ont révélé une relation de force fréquente positive et ont fortement suggéré une fonction contractile intacte 10 . Ces résultats ont démontré que les tranches ventriculaires murines conviennent comme un modèle tissulaire in vitro pour des études physiologiques et pharmacologiques. En outre, les tranches ventriculaires de coeurs récepteurs en combinaison avec des enregistrements d'électrodes pointues se sont révélées être un outil très utile pour caractériser l'intégration électrique et mécanique ainsi que la maturation des 12 cardiomyocytes dérivés de cellules 12 , 13 et 14 transplantés.
En résumé, les tranches ventriculaires sont un modèle de tissu multicellulaire précieux et bien établi et devraient être considérées comme complémentaires de cardiomyocytes dissociés et de coeurs perfusés de LangendorffDans la recherche cardiovasculaire, avec l'avantage majeur de fournir une structure tissulaire in vivo (contrairement aux cellules dissociées) ainsi que l'accès direct aux technologies de mesure, comme les enregistrements d'électrodes nettes à toutes les régions du cœur (contrairement aux préparations de coeur entier).
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Protocole
La manipulation des animaux doit être conforme aux directives du comité local du bien-être animal et à la Directive 2010/63 / UE du Parlement européen.
1. Préparer des solutions
- Préparer la solution de Tyrode sans Ca 2+ (composition en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. Ajuster le pH à 7,4 Avec NaOH à 4 ° C.
- Préparer la solution de Tyrode avec Ca 2+ (composition en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH à 4 ° C.
- Préparer 4% d'agarose à faible teneur en fusion: Mettre 0,6 g d'agarose à bas point de fusion dans 15 ml de solution de Tyrode sans Ca 2+ . Chauffer le mélange dans un four à micro-ondes deux fois à 750 W pendant 10-15 s jusqu'à dissolution de l'agarose. Maintenir la solution à une température constante de 37 ° C &# 176; C et remuer en continu.
- Gardez le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) sans sérum à 37 ° C avec du carbogène (5% de CO 2 , 95% d'O 2 ).
2. Préparez le Microtome
- Allumez le microtome.
- Remplissez la chambre externe du microtome avec de la glace.
- Remplissez la chambre de microtome interne avec une solution de Tyrode glacée sans Ca 2+ et oxygènez en continu la solution avec 100% de O 2 .
- Placez une lame d'acier dans le porte-lame du microtome.
3. Isolation cardiaque de la souris
- Injecter par voie sous-cutanée 2,500 U d'héparine. Attendre 15 min.
- Sacrifiez l'animal par dislocation cervicale.
- Ouvrez la poitrine par sternotomie.
- Disique soigneusement le péricarde à l'aide de petits ciseaux et une pince # 5.
- Insérer une canule dans l'aorte ascendante et perfuser les artères coronaires sur place avec des Tyrode glacésSolution sans Ca 2+ jusqu'à ce que le sang restant soit enlevé.
- Ressusciter doucement le cœur avec une pince et des ciseaux et transférer le cœur dans la solution glacée de Tyrode roulée sans Ca 2+ .
- Séparez les oreillettes des ventricules avec un scalpel ou des ciseaux.
4. Incorporation des ventricules dans 4% d'agarose à bas point de fusion
- Placez les ventricules avec le sommet vers le haut dans le moule d'agarose ( Figure 1 ). Placez la broche au milieu du moule dans la chambre ventriculaire gauche.
- Remplir le moule avec 4% d'agarose à faible teneur en fusion à 37 ° C, jusqu'à ce que le cœur soit complètement recouvert.
- Placez le moule sur de la glace pour un durcissement plus rapide de l'agarose empêchant le flottement du tissu.
- Retirez le bloc d'agarose contenant les ventricules du moule avec un scalpel.
- Tournez le bloc à l'envers et remplissez les chambres ventriculaires et l'espace à l'arrière du bloc d'agarose, que j'aiS laissé par la broche de la mue, avec 4% d'agarose à bas point de fusion en utilisant une seringue avec une aiguille de 20 G.
- Couper le bloc d'agarose avec un scalpel pour obtenir un fond plat du bloc et la position verticale de l'apex cardiaque.
5. Tranchage du tissu ventriculaire
- Fixez le bloc sur le porte-échantillon du microtome avec une goutte de colle de cyanoacrylate. Faites face au sommet cardiaque vers le haut.
- Placez le porte-échantillon dans la chambre d'échantillon interne du microtome, qui est rempli de Tyrode glacé sans Ca 2+ . Recouvrir complètement le bloc d'agarose avec la solution de Tyrode.
- Préparez des tranches d'axe court à une épaisseur de 150 à 400 μm, en fonction de l'application supplémentaire (pour les enregistrements d'électrode nette 150-200 μm), maintenez la fréquence de vibration de la lame à 60-70 Hz et déplacez la lame vers l'avant aussi lentement que possible .
- Utilisez une brosse fine pour retirer soigneusement l'agarose restant des tranches.
- Transfère doucementR avec une pipette Pasteur dans la solution de Tyrode avec 0,2 mM de Ca 2+ aéré avec 100% de O 2 et les stocker pendant au moins 30 minutes sur de la glace pour récupérer à partir du processus de tranchage.
- Ensuite, maintenez les tranches pendant 30 minutes dans le DMEM à 37 ° C, aérées avec du carbogène, pour laver le BDM avant de l'utiliser.
6. Préparation de l'installation de l'électrode Sharp
- Pour préchauffer, allumez tous les appareils électriques 30 min avant le début des enregistrements.
- Mettez un plat de culture cellulaire de 3 cm sur la plaque chauffante placée sur le microscope inversé.
- Placez l'électrode en anneau sur mesure ( Figure 2 ) dans le plat et connectez les fils de mise à la terre du préamplificateur et de l'électrode de stimulation.
- Raccorder les tubes flexibles du système de perfusion au plat.
- Remplir le réservoir du système de perfusion avec DMEM, aéré avec du carbogène.
- Allume la pompe à perfusion et réglez la perfusionTe à 2-3 mL / min.
- Réglez la température du DMEM dans le plat à 37 ° C en régulant le chauffe-circuit et la plaque chauffante.
7. Enregistrements potentiels d'action
- Placez une tranche ventriculaire dans le plat rempli de DMEM.
- Vérifier l'intégrité structurale et la viabilité (basée sur la fonction contractile) du tissu avec le microscope inversé.
- Remplissez une électrode en verre d'enregistrement avec KCL 3 M.
- Remplir une électrode de stimulation avec DMEM.
- Placez l'électrode d'enregistrement et l'électrode de stimulation sur les supports d'électrode.
- Placez soigneusement l'électrode de stimulation sur la tranche et allumez le stimulateur électrique. Commencez avec une fréquence de stimulation de 1-2 Hz.
- Déplacez l'électrode d'enregistrement avec le micromanipulateur sur la position d'enregistrement prévue.
- Abaissez lentement l'électrode d'enregistrement jusqu'à ce que la pointe touche le tissu.
- Appliquer une courte impulsion électrique rectangulaire à travers leEnregistrement de l'électrode pour pénétrer dans la membrane cellulaire.
- Réinitialisez soigneusement l'électrode d'enregistrement jusqu'à ce qu'un signal stable soit assuré.
- Commencez l'enregistrement des potentiels d'action.
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Résultats
L'infarctus du myocarde entraîne une perte pratiquement irréversible des cardiomyocytes. La thérapie de remplacement cellulaire utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pour la régénération cardiaque exogène est une approche thérapeutique prometteuse. L'intégration électrique et la maturation des cellules transplantées sont essentielles pour la sécurité et l'efficacité de la thérapie de remplacement cellulaire.
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Discussion
Les tranches ventriculaires permettent des études électrophysiologiques, pharmacologiques et mécaniques avec une structure tissulaire in vivo préservée et un accès direct de la technologie de mesure à toutes les régions du cœur. Les propriétés potentielles d'action physiologique ont été démontrées dans les tranches embryonnaires, néonatales et adultes 9 , 10 , 11 . La vitalité des tranches, à l'exception des co...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à déclarer.
Remerciements
Nous reconnaissons le soutien fourni par les ateliers et l'établissement animal de l'Institut de neurophysiologie. Ce travail a été soutenu par Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune et Deutsche Stiftung für Herzforschung.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne | Microtome avec lame vibrante. | |
| Lames en acier inoxydable | Campden Instruments, Loughborough, Angleterre | 7550-1-SS | |
| Pipettes Pasteur | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Pinceau fin, par exemple taille 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Table | Mue | ||
| pour l’enrobage des ventricules dans agarose | fait maison | ||
| 1 mL Seringue | Becton, Dickinson ; Franklin Lakes, États-Unis | 300013 | |
| 27 G x 3/4'' Aiguilles | Braun, Melsungen, Allemagne | 4657705 | |
| 20 G 11/2'' Aiguilles | 4657519 | ||
| Petite ciseau | WPI, Sarasota, États-Unis | 501263 | |
| Pince à épiler #5, pointe 0,1 x 0,06 mm | WPI, Sarasota, États-Unis | 500342 | |
| Oxygène gazeux (qualité médicale O2) | Linde, Munich, Allemagne | ||
| Gaz carbogen (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Allemagne | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, | États-Unis 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Colle cyanoacrylate | Henkel, Dü ; sseldorf, Allemagne | ||
| Agarose à bas point de fusion | Roth, Karlsruhe, Allemagne | 6351.2 | |
| Héparine-sodium-25000 E.-I./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Allemagne | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glycémie élevée, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, États-Unis | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplificateur | npi electronic GmbH, Tamm, Allemagne | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Allemagne | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Allemagne | ||
| Micromanipulateur à faible grossissement | Narashige, Tokyo, Japon | Nm-3 | |
| Micromanipulateur à trois axes à fort grossissement | Narashige, Tokyo, Japon | MHW-3 | |
| Pompe | à perfusion péristaltiqueMulti Channel Systems, Reutlingen, Allemagne | PPS2 | |
| 2 canaux | Multi Channel Systems, Reutlingen, Allemagne | TCO02 | |
| Stimulateur d’impulsions carrées | Natus Europe GmbH, Planegg, Allemagne | Grass SD9 | |
| Capillaires en verre | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Références
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- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
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Réimpressions et autorisations
