Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

Résumé

L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N- acétylmannosamine dérivés.

Résumé

L’acide sialique (Sia) est un constituant très important des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. En raison de sa position à des terminaisons non réductrice des oligo - et polysaccharides, ainsi que ses caractéristiques chimiques, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur différent. En modifiant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule, l’acide sialique dépendant des interactions seront par conséquent influencées. Cela peut être utile pour étudier les interactions acide sialique-dépendante et a le potentiel d’influencer certaines maladies d’une manière bénéfique. Par l’intermédiaire de glycosylation métabolique (MGE), l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée. Dans les présentes, cellules, tissus ou même ensemble animaux est traités avec C2-modified dérivés de N- acétylmannosamine (ManNAc). Ces sucres aminés agissent comme molécules précurseurs de l’acide sialique donc métabolisés en acide sialique espèces correspondantes et sont exprimées sur glycoconjugués. En appliquant cette méthode produit des effets fascinants sur divers processus biologiques. Par exemple, il peut réduire considérablement l’expression de l’acide polysialique (polySia) dans les cellules neuronales traitées et affecte donc la différenciation et la croissance neuronale. Ici, nous montrons la synthèse chimique de deux des plus courants dérivés C2-modification N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) ainsi que de N- butanoylmannosamine (ManNBut) et en outre montrer comment ces non naturels sucres aminés peuvent être appliquées dans les expériences de culture cellulaire. L’expression des espèces acide sialique modifié est quantifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et plus analysée par spectrométrie de masse. Les effets sur l’expression acide polysialique ont été élucidés par Western blot, en utilisant un anticorps acide polysialique disponible dans le commerce.

Introduction

L’acide sialique est un monosaccharide qui se trouvent généralement à la termini non réductrice des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. Parmi tous les monosaccharides, l’acide sialique présente des caractéristiques chimiques uniques. Il a un squelette d’atomes C 9, un groupe carboxylique en position de C-1, qui est déprotoné et ainsi négativement chargées sous des conditions physiologiques et une fonction amine en position C-5. Bien que plus de 50 variantes d’acide sialique naturels ont été caractérisés à ce jour¹, la forme prédominante de l’acide sialique trouvée chez l’homme est l’acide N- ac....

Protocole

1. préparation des tampons et réactifs

1. Préparation de solution de méthylate de sodium 3 mM
   1. Dissoudre le méthylate de sodium 8,1 mg dans 50 mL de méthanol (3 mM) dans une bouteille de verre de 100 mL avec une barre de remuer. Conserver à température ambiante (RT) pendant plusieurs semaines.
2. Préparation de tampon Tris-HCl
   1. Combinez les 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl et 146 mg EDTA dans un flacon de verre de 100 mL avec une barre de remuer et dissoudre dans 80 mL d’eau.
   2. Ajouter hydroxyde de sodium (1 M, dans l’eau) ou HCl (20 %, dans l’eau) à la solution de l’agitation, tout....

Résultats

Les chromatogrammes HPLC de le fluorescent étiquetés Neu5Ac et les normes de Neu5Gc sont représentés dans la Figure 2. À l’aide de la méthode décrite ci-après, DMB-étiqueté Neu5Gc élue généralement entre temps d’élution 7-9 min et DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Plusieurs petits pics sur le chromatogramme apparaissent généralement entre 2 à 6 min. Ces pics représentent DMB n’a pas réagi et intermédiaires de réaction²⁵.

Discussion

Si les synthèse chimique dérivés de ManNAc, ManNProp et ManNBut sont analysés par spectrométrie de masse, seulement le pic de masse correct pour les deux spécimens doit être identifié. Par conséquent, les produits peuvent supposer avoir une pureté supérieure à 99 %. Petites quantités de Neu5Gc, qui se trouve normalement pas dans les cellules humaines²⁹, sont détectées dans les fractions membranaires des cellules lysées. Cela se produit probablement par une voie de récupération qui recrute des Neu5.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules	Sigma-Aldrich	92110411
RPMI milieu	Sigma-Aldrich	R8758
75 ml Fioles de culture tissulaire	Greiner	690175
plaques 48 puits	Corning	3548
FCS	PAA	A15-102
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Trypsine	Gibco	15400-054
EDTA	Roth	X986.1
Tris	Serva	37190.03
SDS	Roth	2326.2
Equipement SDS-PAGE (réservoirs, verrerie, etc., machine	VWR	SDS Gel/Blot
Acrylamide	Roth	3019.1
Échelle protéique	Fisher Scientific	267620
Nitrocellulose	GE Healthcare	10600002
Ponceau rouge	Roth	5938.2
Lait en poudre	Roth	T145.3
ECL	Millipore	WBLUF 0500
0,5 ml Unité de filtration centrifuge avec membrane de 3 kDa	Merck-Millipore	UFC500324
15 mL Tubes à centrifuger	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430791-500EA
2-Mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L	HPLC gradient grade
4,5-Méthylènedioxy-1,2-phénylènediamine dichlorhydrate	Sigma-Aldrich	D4784-50MG
48 puits, plaque de culture tissulaire à fond plat	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS3548-100EA
Tubes à centrifuger de 50 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430829-500EA
Acétonitrile	Sigma-Aldrich	34967-1L	HPLC gradient
grade Aprotinine de poumon bovin	Sigma-Aldrich	A1153-10MG	poudre lyophilisée, 3-8 TIU/mg
chlorure de butyryle	Sigma-Aldrich	109614-250G
C18 Colonne RP	Phenomenex	00F-4435-E0	110 & Aring ;, 3 & micro ; m taille des particules, 4,6 x 150 mm
Chlorhydrate de D-Mannosamine	Sigma-Aldrich	M4670-1G
de sel tamponné au phosphate de Dulbecco’s	PAN Biotech	P04-36500
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Acide formique	Sigma-Aldrich	56302-50ML-GL
d’acide	chlorhydriqueSigma-Aldrich	H1758-100ML	36.5-38.0 %, dans l’eau
Leupeptine	Sigma-Aldrich	L2884-10MG
Méthanol	Carl-Roth	T169.2	HPLC gradient grade
N-Acétyl-D-mannosamine	Sigma-Aldrich	A8176-250MG
N-Acide acétylneuraminique	Sigma-Aldrich	A0812-25MG
Acide N-glycolylneuraminique	Sigma-Aldrich	G9793-10MG
Fluorure de phénylméthanesulfonyle	Sigma-Aldrich	P7626-250MG
Chlorure de propionyle	Sigma-Aldrich	P51559-500G
Tubes Safe-Lock, 1,5 mL, ambre (protection contre la lumière)	Eppendorf	30120191
Safe-Lock Tubes, 1,5 mL, incolore	Eppendorf	30120086
Sodium solution de bisulfite	Sigma-Aldrich	13438-1L-R-D	40 %, dans l’eau
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	746398-500G-D
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	795429-500G-D
Solution d’hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	319511-500ML	1.0 M, dans l’eau
Méthoxyde de sodium	Sigma-Aldrich	164992-5G
Acide trifluoroacétique	Sigma-Aldrich	T6508-100ML-D
Chlorhydrate de tris	Sigma-Aldrich	T5941-100G
Trypsine 0,25 %/EDTA 0,02 % dans PBS	PAN Biotech	P10-019100
Eau	Carl-Roth	T905.1	HPLC gradient grade
Gel de silice 60	Carl-Roth	9779.1
HPLC	Agilent
ESI-MSD-System	Agilent

solide Solution Solution