Article de méthode

Glycosylation métabolique de l’acide sialique à l’aide de N-acyl-modification Mannosamines

DOI :

10.3791/55746

⸱

25 novembre 2017

 , 
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Dans cet article

Résumé

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L’acide sialique est une monosaccharide-unité typique trouvée dans glycoconjugués. Il est impliqué dans une multitude d’interactions moléculaires et cellulaires. Nous présentons ici une méthode pour modifier l’expression de la cellule l’acide sialique surface à l’aide de glycosylation métabolique avec N- acétylmannosamine dérivés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’acide sialique (Sia) est un constituant très important des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. En raison de sa position à des terminaisons non réductrice des oligo - et polysaccharides, ainsi que ses caractéristiques chimiques, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur différent. En modifiant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule, l’acide sialique dépendant des interactions seront par conséquent influencées. Cela peut être utile pour étudier les interactions acide sialique-dépendante et a le potentiel d’influencer certaines maladies d’une manière bénéfique. Par l’intermédiaire de glycosylation métabolique (MGE), l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée. Dans les présentes, cellules, tissus ou même ensemble animaux est traités avec C2-modified dérivés de N- acétylmannosamine (ManNAc). Ces sucres aminés agissent comme molécules précurseurs de l’acide sialique donc métabolisés en acide sialique espèces correspondantes et sont exprimées sur glycoconjugués. En appliquant cette méthode produit des effets fascinants sur divers processus biologiques. Par exemple, il peut réduire considérablement l’expression de l’acide polysialique (polySia) dans les cellules neuronales traitées et affecte donc la différenciation et la croissance neuronale. Ici, nous montrons la synthèse chimique de deux des plus courants dérivés C2-modification N- acylmannosamine, N- propionylmannosamine (ManNProp) ainsi que de N- butanoylmannosamine (ManNBut) et en outre montrer comment ces non naturels sucres aminés peuvent être appliquées dans les expériences de culture cellulaire. L’expression des espèces acide sialique modifié est quantifiée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) et plus analysée par spectrométrie de masse. Les effets sur l’expression acide polysialique ont été élucidés par Western blot, en utilisant un anticorps acide polysialique disponible dans le commerce.

Introduction

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L’acide sialique est un monosaccharide qui se trouvent généralement à la termini non réductrice des glycoconjugués, tels que le N- O- glycanes ou glycolipides. Parmi tous les monosaccharides, l’acide sialique présente des caractéristiques chimiques uniques. Il a un squelette d’atomes C 9, un groupe carboxylique en position de C-1, qui est déprotoné et ainsi négativement chargées sous des conditions physiologiques et une fonction amine en position C-5. Bien que plus de 50 variantes d’acide sialique naturels ont été caractérisés à ce jour1, la forme prédominante de l’acide sialique trouvée chez l’homme est l’acide N- acétylneuraminique (Neu5Ac). Autres mammifères expriment également des quantités plus élevées de N- GLYCOLYLNEURAMINIQUE acide (Neu5Gc)2,3.

En raison de sa position exposée en glycoconjugués, l’acide sialique est impliqué dans une multitude d’interactions ligand-récepteur, par exemple, la liaison dépendant d’hémagglutinine du virus de la grippe à hôte cellules4. Un épitope acide sialique avec des fonctions biologiques importantes, en particulier au cours de l’embryogenèse et dans le système nerveux, est l’acide polysialique. L’acide polysialique est un polymère de jusqu'à 200 acides sialiques liés à 2,8 alpha. Le transporteur de la protéine majeure de l’acide polysialique est la molécule d’adhésion cellulaire neuronal (NCAM). Polysialic acide expression module la propriété adhésive de la NCAM qu’expression acide polysialique diminue l’adhérence et augmente la plasticité du système nerveux5.

Changements dans l’expression de l’acide sialique (poly) affecteront en fin de compte une multitude d’interactions biologiques différentes. Ceci peut être utilisé pour étudier les processus dépendants connus acide sialique au niveau moléculaire, de découvrir les interactions glycoconjugués roman, ou d’explorer des approches thérapeutiques possibles. Il existe différentes méthodes disponibles permettant l’expression de l’acide sialique sur la surface de la cellule peut être modulée, par exemple le traitement avec l’acide sialique glycosidases spécifique (sialidases), l’inhibition des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acide sialique6 ,7,8, ou faire tomber ou changement de l’expression de l’enzyme clé de la biosynthèse de l’acide sialique9.

Une autre méthode polyvalente pour moduler l’expression de l’acide sialique est MGE (génie métabolique également connu sous le nom d’oligosaccharide, MOE). Dans les présentes, cellules, tissus ou même les animaux sont traités avec non naturels dérivés de ManNAc portant modifications C2-aminés. Étant des molécules précurseurs de l’acide sialique, après absorption cellulaire, ces analogues de ManNAc sont les acides sialiques métabolisés à non-naturelles unidirectionnels et peuvent être exprimées sur glycoconjugués sialylés. Les cellules traitées avec ManNAc dérivés transportant aliphatiques C2-modifications, telles que ManNProp ou ManNBut, intègrent l’acide N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou l’acide N- butanoylneuraminic (Neu5But) dans leur glycoconjugués10 , 11. à l’aide de groupes fonctionnels à la position C2 de ManNAc, les naturels les acides sialiques non naturels peuvent être couplés, par exemple, via la ligature de Staudinger ou la cycloaddition de bases azoture, avec les colorants fluorescents et donc visualisées sur la surface de cellule12.

L’expression de ces acides sialiques de non naturel a des effets intrigantes sur nombreux processus biologiques, y compris les infections pathogènes, l’adhérence et la migration des cellules tumorales, d’adhérence cellulaire générale, ainsi que de vascularisation et de différenciation (pour révision Voir : Wratil et al. 13). il est intéressant, MGE avec N-acyl modifié mannosamines peut également être utilisé pour gêner l’expression de l’acide polysialique. L’acide polysialique est généré par deux polysialyltransferases différentes (ST8SiaII et ST8SiaIV). Il a été démontré, que polysialyltransferase ST8SiaII est inhibée par l’acide sialique unnatural précurseurs, tels que ManNProp ou ManNBut14,15. En outre, il a été démontré dans les cellules de neuroblastome humain que ManNProp ou ManNBut application réduit également sialylation au total15.

MGE avec N-acyl modifié mannosamines est un facile d’appliquer la méthode qui a été utilisé avec succès, non seulement dans les mammifères et la culture de cellules de bactéries mais aussi dans tout animaux de différentes espèces, telles que Caenorhabditis elegans16, poisson zèbre17ou souris18,19,20,21. En particulier les dérivés de ManNAc portant modifications aliphatiques, y compris ManNProp et ManNBut, sont négligeable cytotoxiques, même à des concentrations millimolaires dans un milieu de culture cellulaire ou de plasma sanguin. En outre, ils sont relativement faciles à synthétiser.

Ici, nous donne des détails sur comment utiliser MGE avec la N-acétyl modifiés mannosamines. Tout d’abord, la synthèse chimique de deux des dérivés ManNAc plus largement utilisés dans ce domaine, ManNProp et ManNBut, s’explique. Ensuite, nous montrons comment MGE peut être appliqué dans une expérience in vivo . À titre d’exemple, la lignée de cellules de neuroblastome Kelly a été choisie pour démontrer une diminution d’expression de l’épitope polysialique par Western blot après le traitement avec les dérivés de ManNAc. Les acides sialiques non naturelle sur la surface de la cellule ont été quantifiés par HPLC et plus analysés par spectrométrie de masse.

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Protocole

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1. préparation des tampons et réactifs

  1. Préparation de solution de méthylate de sodium 3 mM
    1. Dissoudre le méthylate de sodium 8,1 mg dans 50 mL de méthanol (3 mM) dans une bouteille de verre de 100 mL avec une barre de remuer. Conserver à température ambiante (RT) pendant plusieurs semaines.
  2. Préparation de tampon Tris-HCl
    1. Combinez les 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl et 146 mg EDTA dans un flacon de verre de 100 mL avec une barre de remuer et dissoudre dans 80 mL d’eau.
    2. Ajouter hydroxyde de sodium (1 M, dans l’eau) ou HCl (20 %, dans l’eau) à la solution de l’agitation, tout en respectant le pH en utilisant un pH-metre et ajuster le pH à 8.0.
    3. Ajouter le volume d’eau nécessaire pour obtenir un volume final de 100 mL. Filtrer la solution à l’aide d’un système de filtration stérile de 0,22 µm.
      Remarque : 100 mL Tris-HCl tampon contiendra NaCl 150 mM, 10 mM Tris-HCl et 5 mM EDTA (pH 8,0). La solution peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  3. Préparation de la solution de l’aprotinine
    1. Dissoudre 10 mg aprotinine dans 1 mL d’eau (1,54 mM). Partie aliquote de la solution d’aprotinine dans 10 x 1,5 mL-plastique tubes (100 µL). Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  4. Préparation de la solution leupeptine
    1. Dissoudre 10 mg leupeptine dans 2 mL d’eau (10 mM). Partie aliquote de la solution de leupeptine 10 x 1,5 mL-plastique tubes. Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  5. Préparation de la solution de fluorure (PMSF) phénylméthylsulfonyle
    1. Dissoudre 34,8 mg PMSF dans 2 mL d’éthanol (100 mM). Partie aliquote de la solution PMSF à 10 x 1,5 mL-plastique tubes. Conserver à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  6. Préparation de la solution 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dichlorhydrate (DMB)
    1. Mélanger 15,62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoéthanol et 48 µL, bisulfite de sodium-solution (39 %) et ajouter 9,6 mL d’eau (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoéthanol et bisulfite de sodium 0,19 %). Partie aliquote de la solution DMB en 40 x 1,5 mL-plastique tubes (250 µL). Boutique abri de la lumière à-20 ° C pendant plusieurs semaines.
  7. Préparation de la solution (TFA) d’acide trifluoroacétique 1 M
    1. Ajouter 770,3 µL de 100 % TFA à 9,23 mL d’eau dans un tube en plastique de 15 mL (1 M). Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  8. Préparation de la solution AGT 120 mM
    1. Ajouter 92,4 µL AGT (100 %) à 9,91 mL d’eau (120 mM) dans un tube en plastique de 15 mL. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  9. Préparation de solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 400 mM
    1. Dissoudre 160 mg NaOH dans 10 mL d’eau (400 mM) dans un tube en plastique de 15 mL. Conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  10. Préparation du tampon de lyse Western blot
    1. Dissoudre 5,84 g de NaCl, 0,1 g de Tris (hydroxyméthyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g de CaCl2, 0,95 g MgCl2et 1 g Triton-X100 dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 7,8. Conserver à 4 ° C. Ajouter 100 µL de chaque inhibiteur de la protéase (aprotinine, leupeptine et PMSF) avant d’utiliser le tampon de lyse.
  11. Préparation de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE) tampon
    1. Dissoudre 0,3 g de Tris, glycine de 1,5 g et 0,1 g SDS dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 7,3. Magasin à température ambiante.
  12. Préparation du tampon de Western blot
    1. Dissoudre 0,3 g de Tris, glycine de 1,1 g dans 90 mL d’eau et ajouter 10 mL d’éthanol. Magasin à température ambiante.
  13. Préparation de la solution de blocage
    1. Dissoudre 1 g de puissance de lait sans gras dans une solution saline tamponnée au phosphate de 25 mL (PBS). Préparez toujours frais.

2. synthèse des ManNProp et des N-acyl-modification Mannosamines

  1. Dissoudre 431,2 mg de chlorhydrate de mannosamine en solution de méthylate de sodium 3 mM 10 mL dans un flacon de verre de 50 mL avec une barre de remuer.
  2. Laisser refroidir le mélange sur la glace à 0 ° C. À la solution en remuant, ajouter lentement goutte à goutte 210 chlorure de propionyle µL (2,4 mmol), ou chlorure de butanoyl 248 µL (2,4 mmol) de synthétiser les ManNProp ou ManNBut, respectivement. Incuber le mélange en remuant à 0 ° C pendant 4 h.
  3. Transvaser la solution dans un tube en plastique de 50 mL. Piquez 4-8 trous dans le couvercle du tube en plastique avec une aiguille fine. Congeler rapidement la solution à l’aide d’azote liquide et ensuite lyophiliser (gel sec) pendant 48 heures ou jusqu'à ce qu’il soit complètement sec.
  4. Mélanger 350 g de gel de silice 60 avec 750 mL d’éthyle acétate/méthanol/eau (15:2:1) (il s’agit d’une suspension). Remplir une colonne de verre (35 mm de diamètre et 70 cm de longueur) avec la suspension du gel de silice 60 et laver la colonne préparée avec un autre 100 mL éthyl-acétate/méthanol/eau (15:2:1) avant utilisation.
  5. Dissoudre les produits séchés de l’étape 2.3 (produit sec de 5 g) dans 10 mL d’éthyl-acétate/méthanol/eau (15:2:1) et la charge à l’aide d’une pipette sur la silice gel colonne. Recueillir les fractions 4 mL après 500 mL (pour ManNProp). Remarque : ManNBut va éluer de la colonne après environ 700 mL.
  6. Transférer les fractions éluées dans les tubes en plastique de 15 mL. Piquez 3-6 trous dans le couvercle du tube en plastique avec une aiguille fine. Rapid geler la solution à l’aide d’azote liquide et par la suite il lyophiliser jusqu'à ce qu’il soit complètement sec.
    Remarque : Les produits lyophilisés peuvent être stockés pendant plusieurs mois à température ambiante.
  7. Vérifier la pureté des produits par spectrométrie de masse (voir section 9).
    Remarque : Vous pouvez également pureté peut également être vérifiée par 1H résonance magnétique nucléaire (RMN).

3. Culture cellulaire

  1. Cellules de neuroblastome de Kelly culture dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10 % sérum de veau fœtal, 100 pénicilline U, streptomycine 100 mg, 2 mM de L-glutamine contenant 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp ou 5 mM ManNBut, à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Les cellules cultivées dans un milieu sans ManNAc ou ses analogues sont utilisés comme un contrôle.
  2. Avant l’application de la mannosamines, détacher les cellules de neuroblastome Kelly en incubant les pendant 10 min avec la trypsine/EDTA (0,25 % et 0,02 %, dans du PBS) et compter à l’aide d’un compteur de Neubauer-chambre ou cellule. Les cellules aux numéros définis selon la taille du plat/plaque de graines.
    1. Pour mesurer l’acide sialique monosaccharides, graines 1 x 105 cellules de 500 µL de milieu dans une plaque de 48 puits vitroplants. Pour l’analyse des acides polysialique, graines 1 x 106 cellules dans 3 mL de milieu sur une boîte de Petri de cellule de diamètre 6 cm. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2. Remplacer le support de toutes les 24 h.
      Remarque : L’effet de MGE augmente avec la durée totale du traitement. Pour un rendement métabolique élevé traiter les cellules pendant 5 à 7 jours.
  3. Après le traitement, décanter le milieu. Laver les plaques/plats avec du PBS. Détacher les cellules en les incubant pendant 10 min avec la trypsine/EDTA (0,25 % et 0,02 %, dans du PBS). Neutraliser la trypsine en ajoutant le même volume de milieu de culture cellulaire dans les cellules individuelles. Transférer les cellules individuelles dans des tubes en plastique de 15 mL. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 500 x g et éliminer le surnageant.
    1. Ajouter 5 mL des cellules de PBS et centrifuger (voir étape 3.3). Répétez la procédure de nettoyage deux fois plus.
      Remarque : Le culot de cellules lavées sans surnageant peut être stocké à-20 ° C pendant plusieurs jours. Si l’expression de l’acide polysialique doit être élucidé continuent à l’article 10.

4. cellule Lysis pour analyse par CLHP

  1. Préparation du tampon de lyse HPLC
    1. Mélanger 5 mL Tris-HCl de tampon, 5 µL de solution d’aprotinine, 20 µL de solution de leupeptine et 50 µL de solution de PMSF.
      NOTE : tampon de lyse de HPLC de 5 mL contient 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinine, 40 µM leupeptine et 1 mM PMSF (pH 8,0). Ce tampon toujours doit être préparé fraîche avant de la lyse cellulaire.
  2. Remettre en suspension les granules des cellules recueillies (étape 3.3) chaque dans 500 µL glacee HPLC-tampon de lyse et ultra-laisser agir les échantillons avec une aiguille de processeur ultra sonique trois fois pour une période de 30 s à feu moyen-vif amplitudes. Laisser refroidir les échantillons sur glace pendant au moins 1 min entre les cycles.

5. la séparation de la Fraction de Membrane

  1. Centrifuger les échantillons de cellules lysées pendant 2 h à 20 000 x g et 4 ° C. Séparer le surnageant (environ 480 µL), représentant des protéines cytosoliques, dans des tubes en plastique de 1,5 mL. Déterminer la concentration de protéines de ces fractions en utilisant, par exemple, le Bradford ou dosage bicinchoninic acid (BCA).
    NOTE : La concentration de la protéine (environ 1 mg/mL) des fractions cytosoliques peut plus tard être liée aux quantités mesurées de l’espèce de l’acide sialique respecté. Le plomb représente la fraction de membrane, qui est utilisée à l’étape 6.1.

6. acide hydrolyse

NOTE : Oligo - et polysaccharides dans les membranes cellulaires sont hydrolysés en monosaccharides. En outre, possible O-modifications dans les monosaccharides sont hydrolysés, aussi bien. C’est nécessaire pour l’analyse quantitative de HPLC, parce que l’écrasante majorité des acides sialiques dans les fractions membranaires est naturellement intégrée à glycoconjugués et pourrait éventuellement porter O-acétyl ou O- lactolyl modifications.

  1. Ajouter 150 µL 1 M TFA-solution pour les fractions de membrane séparées (pellet du chapitre 5). Incuber les échantillons pendant 4 h à 80 ° C sous agitation à 200-600 tr/min.
  2. Centrifuger les échantillons pour environ 30 min à 20 000 x g et 21 ° C à l’aide de tubes filtre 0,5 mL avec 3 membranes d’exclusion kDa, jusqu'à ce que le volume de la phase supérieure est inférieure à 20 µL.
    Remarque : Cette étape est importante pour éliminer les débris moléculaire plus élevé.
  3. Transférer la phase inférieure contenant des molécules plus petites, notamment l’espèce acide sialique, dans des tubes en plastique de 2 mL. Piquez 2-4 trous dans les bouchons des tubes en plastique avec une aiguille fine. Rapid congeler les échantillons à l’aide d’azote liquide et ensuite leur lyophiliser du jour au lendemain.
    Remarque : Les échantillons séchés peuvent être stockés pendant plusieurs jours à RT., remplacera un cap sans trous pour une conservation plus longue.

7. fluorescent étiquetage

  1. Remettre en suspension les échantillons séchés à 10 µL de solution de TFA 120 mM et ajouter 50 µL de solution de DMB. Transférer les échantillons dans des tubes de sombre 1,5 mL pour les protéger des rayons ultraviolets.
  2. Pour les normes, dissoudre 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, dans l’eau) ou 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, dans l’eau) dans 10 µL de solution de TFA 120 mM en tubes sombres de 1,5 mL. Ajouter 50 µL de solution de DMB.
  3. Incuber les échantillons de la membrane cellulaire et les normes pour 1,5 h à 56 ° C abri de la lumière. Après l’incubation, ajouter 4 ml 400 mM solution de NaOH à chaque échantillon pour arrêter la réaction d’étiquetage.

8. analyse par CLHP

Remarque : Les échantillons étiquetés sont analysés sur un système HPLC équipé d’une colonne C18 RP (110 Å, granulométrie 3 µm, 4.6 x 150 mm), un détecteur de fluorescence et un collecteur de fraction. Les solvants utilisés sont le méthanol, l’acétonitrile et l’eau. Veillez à dégazer tous les solvants avant les mesures, si le système de CLHP manque un dégazeur interne.

  1. Régler la température de la colonne à 40 ° C et de configurer le détecteur de fluorescence avec 373 nm pour l’excitation et 448 nm pour l’émission, respectivement. Injecter le volume d’échantillon de 10 µL et séparez les sondes pendant 50 min à 0,5 mL/min débit par méthanol/acétonitrile/eau (6:8:86) comme l’éluant. Pour l’analyse de spectrométrie de masse, recueillir les pics d’intérêt.
    Remarque : Neu5Gc est censé d’éluat après 6-8 min, Neu5Ac après 9 à 12 min, Neu5Prop après 17-23 min et Neu5But après 38-44 min. Les échantillons fractionnés peuvent être conservés pendant plusieurs heures à 4 ° C, abri de la lumière.
  2. La mesure de chaque échantillon, laver la colonne pendant 7,5 min à débit de 1,0 mL/min (volumes de colonne 1,5 ≈) avec méthanol/acétonitrile/eau (6:25:69) et rééquilibrer le système pendant 7,5 min à débit de 1,0 mL/min avec méthanol/acétonitrile/eau (6:8:86).
  3. Pour une analyse quantitative, calculer l’aire sous la courbe des pics d’intérêt en utilisant le logiciel d’exploitation du système HPLC respectifs22acide sialique.
    NOTE : Données obtenues peuvent être liées à la Neu5Ac ou la norme Neu5Gc et aux concentrations mesurées de protéine dans les fractions cytosoliques (voir section 5.1).

9. mass Spectrometry analyse de l’acide sialique Monosaccharides

NOTE : Pics de rétention HPLC d’intérêt peuvent être davantage analysés par spectrométrie de masse par chromatographie liquide (CL)-ionisation par électrospray (ESI-MS), afin de vérifier l’espèce de l’acide sialique contre nature.

  1. Pour l’analyse de spectrométrie de masse, injecter 20 µL de l’échantillon prélevé dans un système de détecteur sélectif LC/masse (MSD) avec 79,9 % de méthanol, alcool isopropylique à 20 % et 0,1 % d’acide formique comme éluant, débit 0,5 mL/min, 4 kV de tension capillaire et 350 ° C température capillaire 22 , 23.
  2. Dans le logiciel d’évaluation du système LC/MSD respectif, sélectionnez le pic d’intérêt dans le chromatogramme d’ion totale. Découvre le spectre de masse du pic résolu. Afficher le rapport masse/charge positive entre 300 et 700.
    NOTE : DMB étiquetage des acides sialiques conduit à une augmentation de la masse moléculaire de 116,2 g/mol. Les espèces de l’acide sialique marquée DMB ont les masses moléculaires suivantes : DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol communs adduits sont l’acétonitrile, de sodium ou de l’alcool isopropylique.

10. immunobuvardage, d’acide polysialique dans les cellules de neuroblastome Kelly

  1. Préparation des lysats cellulaires
    1. Ajouter tampon de lyse de Western blot 1 mL pour les pellets de la cellule à l’étape 3.3 et vortex. Incuber pendant 30 minutes sur la glace. Vortex toutes les 5 min. Centrifuger les échantillons pendant 1,5 h 20 000 x g et 4 ° C. Récupérer le surnageant contenant les protéines des cellules lysées.
    2. Déterminer la concentration de protéine les fractions protéiques, par exemple, le Bradford ou le dosage de la BCA. Diluer les échantillons à une concentration de protéines de 1,5 µg/µL de tampon de lyse.
    3. Préparer les échantillons pour la SDS-PAGE, en ajoutant 10 µL de tampon de Laemmli sample à la fraction de protéine 90 µL (1,5 µg/µL) et faire bouillir l’échantillon pendant 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Utiliser les gels SDS-acrylamide 8 % avec 20-30 µL poches et 0,75 ou 1 mm épaisseur. Exécutez le gel à 25 mA pendant 2 h à température ambiante.
    2. Retirez soigneusement le couvercle en verre du gel. Couper et jeter la partie supérieure du gel contenant les poches de chargement. Placer le gel sur une membrane de nitrocellulose (0,2 µm), gonflée dans le tampon de Western blot. Les protéines de transfert sur nitrocellulose conformément à la recommandation du système (p. ex., 250 mA pendant 1 h à 4 ° C).
    3. Enlever la membrane de nitrocellulose du système buvard. La tache avec Ponceau tache rouge pour visualiser les protéines. Transférer la membrane de nitrocellulose dans une chambre en plastique et ajouter 10 mL de solution de blocage. Incuber pendant 1 heure à ta ou toute la nuit à 4 ° C.
    4. Décanter la solution de saturation et ajoutez l’anticorps monoclonal anti-polySia 735 (1 µg/mL) dans du PBS. Incuber la membrane pendant 1 h à RT ou toute la nuit à 4 ° C. Après incubation, laver la membrane au moins trois fois pendant 5 min avec du PBS.
    5. Ajouter anti-souris IgG secondaires anticorps polyclonal (1 µg/mL) couplé à la peroxydase de raifort (HRP) ou une étiquette fluorescente dans du PBS. Incuber la membrane pendant 1 h à température ambiante. Après incubation, laver la membrane au moins trois fois pendant 5 min avec du PBS.
    6. Le transfert de la membrane sur une plaque d’un imageur approprié. Détecter le signal selon les instructions du fabricant.

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Résultats

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Les chromatogrammes HPLC de le fluorescent étiquetés Neu5Ac et les normes de Neu5Gc sont représentés dans la Figure 2. À l’aide de la méthode décrite ci-après, DMB-étiqueté Neu5Gc élue généralement entre temps d’élution 7-9 min et DMB-Neu5Ac entre 10-12 min. Plusieurs petits pics sur le chromatogramme apparaissent généralement entre 2 à 6 min. Ces pics représentent DMB n’a pas réagi et intermédiaires de réaction25.

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Discussion

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Si les synthèse chimique dérivés de ManNAc, ManNProp et ManNBut sont analysés par spectrométrie de masse, seulement le pic de masse correct pour les deux spécimens doit être identifié. Par conséquent, les produits peuvent supposer avoir une pureté supérieure à 99 %. Petites quantités de Neu5Gc, qui se trouve normalement pas dans les cellules humaines29, sont détectées dans les fractions membranaires des cellules lysées. Cela se produit probablement par une voie de récupération qui recrute des Neu5...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions L. D. Nguyen, pour la relecture du manuscrit et des échanges fructueux. En outre, nous remercions Dernedde J. et H. G. Nguyen pour nous aider à préparer le tournage vidéo. La plupart des scènes de la vidéo ont été abattus dans les laboratoires de R. Tauber. Nous remercions également l’Institut Max Planck pour les colloïdes et interfaces et de nous donner libre accès à leurs installations de spectrométrie de masse. RH a été appuyée par la DFG (ProMoAge).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CellulesSigma-Aldrich92110411
RPMI milieuSigma-AldrichR8758
75 ml Fioles de culture tissulaireGreiner690175
plaques 48 puitsCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
Equipement SDS-PAGE (réservoirs, verrerie, etc., machineVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Échelle protéiqueFisher Scientific267620
NitrocelluloseGE Healthcare10600002
Ponceau rougeRoth5938.2
Lait en poudreRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0,5 ml Unité de filtration centrifuge avec membrane de 3 kDaMerck-MilliporeUFC500324
15 mL Tubes à centrifugerSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoéthanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient grade
4,5-Méthylènedioxy-1,2-phénylènediamine dichlorhydrateSigma-AldrichD4784-50MG
48 puits, plaque de culture tissulaire à fond platSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
Tubes à centrifuger de 50 mLSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcétonitrileSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradient
grade Aprotinine de poumon bovinSigma-AldrichA1153-10MGpoudre lyophilisée, 3-8 TIU/mg
chlorure de butyryleSigma-Aldrich109614-250G
C18 Colonne RPPhenomenex00F-4435-E0110 & Aring ;, 3 & micro ; m taille des particules, 4,6 x 150 mm
Chlorhydrate de D-MannosamineSigma-AldrichM4670-1G
de sel tamponné au phosphate de Dulbecco’sPAN BiotechP04-36500
Acide éthylènediaminetétraacétiqueSigma-AldrichE9884-100G
Acide formiqueSigma-Aldrich56302-50ML-GL
d’acidechlorhydriqueSigma-AldrichH1758-100ML36.5-38.0 %, dans l’eau
LeupeptineSigma-AldrichL2884-10MG
MéthanolCarl-RothT169.2HPLC gradient grade
N-Acétyl-D-mannosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acide acétylneuraminiqueSigma-AldrichA0812-25MG
Acide N-glycolylneuraminiqueSigma-AldrichG9793-10MG
Fluorure de phénylméthanesulfonyleSigma-AldrichP7626-250MG
Chlorure de propionyleSigma-AldrichP51559-500G
Tubes Safe-Lock, 1,5 mL, ambre (protection contre la lumière)Eppendorf30120191
Safe-Lock Tubes, 1,5 mL, incoloreEppendorf30120086
Sodium solution de bisulfiteSigma-Aldrich13438-1L-R-D40 %, dans l’eau
Chlorure de sodiumSigma-Aldrich746398-500G-D
Hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich795429-500G-D
Solution d’hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, dans l’eau
Méthoxyde de sodiumSigma-Aldrich164992-5G
Acide trifluoroacétiqueSigma-AldrichT6508-100ML-D
Chlorhydrate de trisSigma-AldrichT5941-100G
Trypsine 0,25 %/EDTA 0,02 % dans PBSPAN BiotechP10-019100
EauCarl-RothT905.1HPLC gradient grade
Gel de silice 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
ESI-MSD-SystemAgilent
solide Solution Solution

Références

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