Article de méthode

Aiguilles personnalisées pour Microinjections dans le cerveau des rongeur

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DOI :

10.3791/55751

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24 janvier 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour le microinjection dans le cerveau de rongeur qui utilise des aiguilles quartz. Ces aiguilles ne pas produire des lésions tissulaires décelables et assurer une prestation fiable même dans les régions profondes. En outre, ils peuvent être adaptés aux besoins de la recherche par des designs personnalisés et peuvent être réutilisés.

Résumé

Microinjections ont été utilisées pendant une longue période pour la livraison de médicaments ou toxines dans des zones spécifiques du cerveau et, plus récemment, ils ont été utilisés pour livrer des produits de thérapie génique ou cellulaire. Malheureusement, les techniques de microinjection actuelles utilisent des aiguilles en acier ou en verre qui sont pas optimaux pour de multiples raisons : en particulier, aiguilles en acier peuvent entraîner des lésions tissulaires et aiguilles de verre peuvent plier quand descendus profondément dans le cerveau, manque la région cible. Dans cet article, nous décrivons un protocole visant à préparer et utiliser des aiguilles de quartz qui combinent un certain nombre de fonctionnalités utiles. Ces aiguilles ne produisent pas de lésions tissulaires décelables et, étant très rigide, assurer une prestation fiable dans la région du cerveau désiré même en utilisant les coordonnées profondes. En outre, il est possible de personnaliser le design de l’aiguille en faisant de multiples trous du diamètre désiré. Plusieurs trous facilitent l’injection de grandes quantités de solution dans une vaste zone, tandis que les gros trous facilitent l’injection de cellules. En outre, ces aiguilles quartz nettoyer et ré-utilisés, tels que la procédure devient rentable.

Introduction

Microinjections ont été utilisées pendant une longue période pour la livraison de composés pharmacologiquement actives pour moduler l’activité neuronale dans des zones spécifiques du cerveau. En outre, elles ont été utilisées pour injecter des toxines près des populations neuronales particulières, pour imiter les manifestations neurodégénératives caractéristiques de certaines maladies, par exemple 6-hydroxy-dopamine dans le système de dopamine sont pour imiter la maladie de Parkinson 1 , 2 ou le saporin d’IgG immunotoxine 192 à lésion du système cholinergique3. Plus récemment, les procédures de microinjection ont été utilisées pour fournir des greffes de vecteurs ou de cellules virales pour la thérapie génique ou cellulaire du cerveau expérimental troubles4,5.

Le type classique des aiguilles utilisées dans ces études est fait d’acier inoxydable. Bien que facile et pratique à utiliser, aiguilles en acier ont un certain nombre de problèmes6: ils sont relativement grands et peuvent entraîner des lésions tissulaires, avec la fuite de la barrière hémato - encéphalique et l’activation des astrocytes ; en outre, ils peuvent produire de carottage de tissu cérébral qui pénètre dans l’aiguille, créant un obstacle ou même complètement éviter l’écoulement de la solution recherchée. Plus récemment, aiguilles de verre prêt ponctuel des capillaires ont été introduites en utilisent7,8. Ceux-ci ne causent pas d’activation de dommage ni astrocyte tissulaire importante, mais sont relativement souples et peuvent plier lorsque introduit dans les structures profondes, réduisant la précision de la localisation (obs.).

Il est donc nécessaire de réduire autant que possible dommage (surtout lors de l’exécution d’expériences pour guérir les dommages) tout en augmentant la précision et reproductibilité (c'est-à-direfaire en sorte que toute solution est livrée et assurer la localisation correcte). En outre, il serait souhaitable d’utiliser des conceptions différentes de l’aiguille afin d’assurer une distribution optimale de la solution injectée dans les zones du cerveau avec des géométries variables. Dans cet article, nous décrivons un protocole visant à préparer et utiliser des aiguilles quartz pour microinjections dans le cerveau des rongeur. En raison du point de fusion élevé, les capillaires de quartz ne peuvent être tirés sur un extracteur classique et ont donc pas été utilisés dans le passé pour générer des aiguilles. Quartz, cependant, offre un avantage important sur verre, notamment haute rigidité et rupture résistance9. En raison de leur rigidité, aiguilles quartz sont idéales pour des injections dans des régions du cerveau ventral. En raison de leur haute résistance à la rupture, ils peuvent être modélisés pour inclure plusieurs trous, obtenir des dessins qui peuvent s’avérer plus efficaces même lorsque vous ciblez les régions du cerveau avec des géométries complexes10.

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Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvées par le Comité éthique de l’Université de Ferrare pour l’expérimentation animale et par le ministère italien de la santé. L’arrivée (Animal Research : Reporting des expériences In Vivo11) directives ont été suivies.

1. préparation des aiguilles Quartz

  1. Nettoyer et stériliser les capillaires de quartz (voir Table des matières) en les plaçant pour 5 min dans l’eau distillée, 5 min dans l’éthanol à 99 % et 5 min dans l’éther diéthylique.
  2. Laissez les capillaires sous la hotte pendant au moins 1 h pour les laisser sécher complètement.
  3. Préparer les aiguilles à l’aide d’un extracteur de laser selon des paramètres qui permettent la production d’une aiguille suffisamment long, assez mince, selon les besoins individuels.
    Remarque : Nous utilisons un extracteur de laser (voir Table des matières). Utilisez un programme de deux lignes pour tirer. La première ligne utilise la puissance élevée, la plus grande longueur balayage (correspondant à la valeur de FILAMENTS) et aucune force de traction. Cette combinaison de paramètres conduit à la fonte de la plus grande partie du capillaire avec la plus faible vitesse d’extension, permettant la mise en forme d’une longue aiguille avec grande taille interne/externe et réduit la tige. De cette façon, l’aiguille conserve une résistance mécanique élevée et large diamètre qui permet le passage de cellules souches ou de particules virales sans colmatage. Vitesse et retard de cette ligne de programme devraient arrêter l’extension capillaire avant la pointe devient trop petite et longue, manquant la mécanique requise et les caractéristiques de forme. La deuxième ligne du programme de traction est exécutée automatiquement, une fois que le quartz se refroidit (5 s). Paramètres de puissance, de filaments et de force de traction sont fonctionnelles pour couper un bout avec la longueur la plus courte possible pointe et la queue raide, en évitant la séparation entre les deux aiguilles avec une rupture de l’embout. Régulièrement, avec nos équipements, nous utilisons ce qui suit : (a) ligne 1 = puissance 990, filament 5, traction retard 110, 130, de la vitesse 0 ; (b) ligne 2 = puissance 970, filament 3, vitesse 0, retard 70, tirez sur 0.
  4. Placer les aiguilles dans une boîte de Pétri préalablement nettoyés avec l’éthanol 70 %.
    1. Couvrir le plat d’une pellicule de plastique paraffine.
  5. Couper les capillaires à la micro-dissecteur.
    1. Au démarrage, laissez le laser exécuter un processus d’étalonnage automatique pour vérifier la puissance et l’énergie fournie. Puis définissez les paramètres de coupe.
      Remarque : Nous utilisons un dissecteur-micro (voir Table des matières) et les paramètres suivants : énergie d’impulsion électrique (63 µJ), diamètre de faisceau laser de 20 % de l’ouverture maximale au laser (ouverture maximale : 1,0 µm) et vitesse de coupe de 10 % de la vitesse maximale (maximum Vitesse : 30 µm/s).
    2. Solidement fixer l’aiguille sur le tableau de microscope et positionner sa pointe au centre de l’écran de l’ordinateur.
    3. Dans la barre de menu, cliquez sur l’icône de crayon et il permet de tracer une marque pour la découpe au laser de l’aiguille.
      Remarque : La coupe doit être à un angle d’environ 45 ° par rapport à la surface de l’aiguille.
    4. Sur la fonction de barre latérale, sélectionnez l’indicateur contenant le bouton « Commencer à couper » pour permettre le laser couper l’endroit précédemment marqué.
    5. Si nécessaire, couper ou les trous latéraux en répétant les procédures décrites dans 1.5.2-3 ; Il n’y a aucune nécessité de repositionner l’aiguille (Figure 1).
  6. Couper après nettoyage.
    1. Se connecter à l’aiguille à une pompe à vide à travers un tube en plastique.
    2. Allumer la pompe et définir manuellement la vitesse d’écoulement vers l’avant à une vitesse modérée (3 µL/min).
    3. Aspirer l’éthanol 99 % premier, puis l’eau distillée pour éliminer les impuretés en raison de la coupe.
    4. Aspirer le 99 % d’éthanol à nouveau pour faciliter le séchage.
      Remarque : Chaque étape doit durer au moins 3 min.
  7. Rangez les aiguilles dans un plat de Pétri correctement couverte jusqu’au jour de la chirurgie.
  8. Aiguilles peuvent être réutilisés ; à la fin de l’expérience, nettoyer avec eau de Javel et de l’éthanol pour éliminer les résidus de tissus solution et possible. Pour un nettoyage plus complet, mettre les aiguilles dans un bocal de stockage micropipette avec la pointe dirigée vers le bas, remplissez le bol avec de l’eau distillée jusqu'à ce que les pointes sont couverts, faites bouillir pendant 1,5 min enlever n’importe quel tissu de reste, puis laver avec de l’éthanol.

2. mode opératoire

  1. En suivant les instructions fournies par le manuel d’utilisation de pompe, sélectionnez le menu paramètres pour étalonner la pompe selon le diamètre/volume de la seringue de la microinjection et régler le débit à 0,3 µL/min.
  2. Remplissez une seringue de 10 mL (équipée d’une aiguille émoussée (p. ex., aiguille de Hamilton, 30 G) et un tube court polytétrafluoroéthylène) avec de l’eau stérile et utilisez-la pour remplir la seringue de microinjection (après avoir enlevé avec beaucoup de prudence le piston) et l’injection kit de pièces de montage pour la pompe manuelle de microinjection (MMP).
    Remarque : Le kit MMP est utilisé pour fixer solidement l’aiguille dans le cadre stéréotaxique (Figure 2). Le kit comprend : un tube de polytétrafluoroéthylène, luer-à-tube coupleur, titulaire de pipette et joints d’étanchéité pour pipettes avec des diamètres extérieurs différents.
  3. Connectez l’aiguille au kit MMP.
    1. Circuler plus d’eau à l’échelle du système dans la seringue de 10 mL et vérifier si l’eau sort de l’aiguille.
      Remarque : Veillez à supprimer toute bulle d’air à l’intérieur du système en répétant les étapes de remplissage.
  4. Déconnecter la seringue de 10 mL de la seringue de microinjection tout en poussant lentement le piston afin de laisser une goutte d’eau à l’extrémité de la seringue de microinjection. Insérez le piston de la seringue de microinjection.
  5. Connecter la seringue de microinjection à la pompe et régler le débit à 0,3 µL/min.
    NOTE : Attendre qu’il y a une goutte d’eau qui fuit de la pointe de l’aiguille et puis laissez-le aller pendant 3 min.
  6. Régler le débit à 0,1 µL/min et de commencer la procédure de chirurgie. La pompe doit être en cours tout en effectuant la chirurgie.
    Remarque : Pour les expériences rapportées dans cet article, nous utilisons des rats Sprague Dawley mâles de 300 g (3 mois). Toutefois, la procédure est applicable à d’autres espèces, souris en particulier.
  7. Induire une anesthésie générale en utilisant une méthode approuvée par la réglementation locale.
    Remarque : Nous utilisons un mélange d’injection intrapéritonéale (i.p.) de xylazine kétamine et 8 mg/kg de 85 mg/kg pour 20 à 50 min de l’anesthésie. Il est important que pincées queue et/ou orteil servent à s’assurer que l’animal est entièrement sous sédation. Niveau d’anesthésie et de la base données vitales sont évalués avant chirurgie commence et contrôlé toutes les 10 min tout en effectuant la chirurgie. Température de corps animal est maintenue constante avant, pendant et après les interventions chirurgicales utilisant une eau recyclée coussin chauffant. Animaux est surveillés jusqu'à ce que complètement rétabli (p. ex. ils sont debout et ambulatoire). En outre, animaux reçoit des analgésiques (tramadol, i.p. de 5 à 7 mg/kg) toutes les 24 h après l’opération pendant trois jours.
    1. Se raser la tête de l’animal et de se préparer adéquatement le site chirurgical chirurgie aseptique. Effectuer un gommage bi-étagé avec la solution de base d’iode (Bétadine) suivie de l’éthanol à 70 %. En outre, pour maintenir l’asepsie, envelopper le site chirurgical avec un drapé chirurgical (dans la vidéo a été omis pour fins de démonstration).
  8. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique sur une eau recyclée couverture chauffante. Pour fournir le soulagement de la douleur supplémentaire, sur le site de la chirurgie appliquer la solution de lidocaïne à 0,5 % (ne pas dépasser 7 mg/kg). Avant de stériliser tous les instruments chirurgicaux en utilisant une désinfection froide stérilisateur ou liquide de perle de tourbillonnement de l’équipement, soit 2 %, glutaraldéhyde plus 7,05 % phénol (Sporodicin ou Cidex) suivie d’un rinçage avec de l’eau stérile ou de sérum physiologique. La désinfection doit être effectuée même entre les procédures. Faites une coupe longitudinale sur le crâne à l’aide d’un scalpel stérilisé. Soyez doux pour éviter un saignement excessif. Ouvrir le cuir chevelu à l’aide d’une spatule plate et appliquer des pinces chirurgicales sur les lambeaux de peau pour le maintenir ouvert. Très doucement, détacher le périoste pour exposer le bregma et la zone du crâne à travers laquelle l’aiguille sera inséré.
  9. Montez le bras sur le cadre stéréotaxique (alors que le flux est en cours) et déplacez la pointe de l’aiguille exactement sur le dessus de bregma, attention ne pas à casser à son extrémité. Annoter les coordonnées antéro-postérieure et médiolatérales du bregma et traduira les coordonnées souhaitées. Guidé par un stéréomicroscope, piquez l’aiguille jusqu'à ce que son extrémité touche presque le crâne, marquer le forage spot après avoir soulevé un peu le bras stéréotaxique.
  10. Percer (pointe Ø de forage : 0,8 mm ; Vitesse de perçage : 1 000 tr/min) le crâne sur l’endroit marqué. Il faut ne pas à pénétrer la dura pendant les opérations de forages. Au cours du forage, goutte à goutte du sérum physiologique stérile pour éviter les lésions osseuses et une nécrose.
  11. Couper un petit morceau de film plastique paraffine et placez-le sur le crâne. À l’aide de la pipette de 10 µL, faire une goutte de la solution d’injecter sur le film plastique paraffine. Arrêter la pompe, un peu récupérer le poussoir de la pompe et créer une petite bulle d’air dans le tube capillaire en tirant doucement sur le piston de la seringue de microinjection.
  12. Abaissez le bras stéréotaxique jusqu'à ce que la pointe de l’aiguille atteint la goutte. Tirer l’échantillon en tirant (très lentement) le piston de la seringue de microinjection, évitant toute formation de bulles. Remplacer le poussoir de la pompe en contact avec le piston et tourner sur la pompe à un débit de 0,3 µL/min. Attendez jusqu'à la formation d’une goutte d’eau (quelques minutes) avant de passer à l’étape suivante.
    Remarque : Dans la présente expérience exemple, liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA) a été perfusé dans le striatum (AP : + 1,5, ML : 2,7 ; DV : -5,0) et dans l’hippocampe dorsal (AP : -3,5, ML : ±2.1 ; DV : -3,5 ; en mm de dura), 2 µL/site. Pour faciliter la comparaison entre les méthodes de deux injection, chaque région du cerveau a été perfusée à l’aide d’une aiguille de quartz dans un hémisphère et une pointe émoussée 26 G ou une aiguille d’acier inoxydable pointe biseau 30 G dans l’autre.
  13. Baisser le débit à 0,1 µL/min, entailler la dura avec une aiguille de pointe conique en acier inoxydable et abaissez lentement le bras stéréotaxique sur l’axe dorso-ventral, entrant dans le tissu cérébral. Lorsque la position désirée est atteinte, aller vers le bas un supplémentaires de 0,1 mm, arrêter la pompe, levez le bras stéréotaxique de 0,1 mm et recommencer la pompe à l’écoulement à 0,3 µL/min.
    NOTE : La raison de maintenir un débit lent tout en réduisant l’aiguille est d’assurer une pression positive qui évite la pénétration de petits fragments de tissu dans l’aiguille elle-même. Un tel événement pourrait obstruer l’extrémité, portant atteinte à la livraison de la solution. Puisque le débit est très lent alors qu’abaisser l’aiguille et la vitesse de descente est d’environ 10 s/mm, cela implique que les quantités de solution qui restent le long de la piste de l’aiguille sont négligeables par rapport à ceux injectés sur le site cible. Cette précaution peut être évitée en utilisant des aiguilles avec orifices latéraux.
  14. Démarrer le compte à rebours et attendre le temps nécessaire selon le volume désiré à injecter (par exemple, 6 min 40 s si injection 2 µL). Suivre les mouvements de la bulle s’injecter. À la fin, arrêter la pompe et attendre 5 min avant de les récupérer lentement l’aiguille. Lorsque l’aiguille de quartz est complètement extraites, remettre en route la pompe et vérifier la formation d’une goutte à l’extrémité de l’aiguille.
  15. Sceller l’ouverture dans la surface du crâne avec de la cire de l’OS, enlever les pinces hémostatiques et suture du cuir chevelu, enduire la zone autour de la plaie avec une crème antibiotique (par exemple, neosporin) et regagner la cage de l’animal.
    Remarque : Suite au protocole d’euthanasie approuvé par le Comité d’éthique institutionnel, pour les expériences décrites dans cet article, les animaux ont été profondément anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de kétamine 43 mg/kg et 7 mg/kg de xylazine et décapités. Cerveaux ont été retirés, traitée dans du formol pendant 48 h et paraffine incorporé. Coronales sections (8 µm) des cerveaux ont été tranchées à l’aide d’un microtome.

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Résultats

Nous avons comparé les lésions induites par microinjection directe dans l’hippocampe dorsal du rat et du striatum en utilisant une aiguille de quartz (pointe de diamètre extérieur 60 µM, trou côté de 20 µM de diamètre, type C, Figure 1) par rapport aux deux classique, extrémité arrondie 26 G et bord biseauté de 30 G aiguilles en acier inoxydable. Dans ce but, nous avons injecté 2 µL de FSCA en droite et gauche hippocampe dorsal et du striatum en utilisant res...

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Discussion

La technique décrite dans cet article répond aux besoins énoncés dans l' Introduction pour l’optimisation des microinjections effectuées pour diverses fins12. Les aiguilles décrits ici réduisent les dommages causés à un niveau minimum, essentiellement non détectable ; en désaccord avec les aiguilles de verre (qui ont tendance à plier), aiguilles de quartz sont rigides et assurer un succès fiable de la région du cerveau désiré même en coordonnées profondes. De plus, le trou latéral...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Communauté européenne [pcrd7-personnes-2011-IAPP projet 285827 (EPIXCHANGE)].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Capillaires en quartzSutter Instruments, Novato, CA USAQ100-50-10Sans extracteur de filament
SutterP2000
Pot de stockage de micropipettesWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USAE210
Microdissector laserLeica Microsystems, Wetzlar, AllemagneLMD6500
Seringue HamiltonHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&Yuml ; tzerbach, Allemagne19138-U
Pompe à micro-perfusionUniventor, Zejtun, MalteModèle 864
Kit de pompe de micro-injectionmanuelle WPIArticle# : MMP-KITKit permettant de monter solidement les micropipettes sur le cadre stéréotaxique
Perceuse de précisionProxxon28510 MicroMot 50/EArbre d’entraînement à roulement à billes avec vitesse variable
Artficial Cerebral Liquide céphalo-rachidienTocris3525
Aiguilles 26 g émoussées et biseau 30 gHamilton26 g émoussées : 19138-U
30 g Biseau : 20757
MicrotomeLeica, AllemagneLEICA RM212RT

Références

  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

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