Itophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction de volume et la tortuosité de l'espace extracellulaire du cerveau

Summary

Ce protocole décrit l'iontophorèse en temps réel, une méthode qui mesure les paramètres physiques de l'espace extracellulaire (ECS) des cerveaux vivants. La diffusion d'une molécule inerte libérée dans l'ECS est utilisée pour calculer la fraction de volume ECS et la tortuosité. Il est idéal pour étudier les modifications réversibles aiguës des ECS du cerveau.

Abstract

Cette revue décrit les concepts et le protocole de base pour effectuer la méthode de l'iontophorèse en temps réel (RTI), l'étalon-or pour explorer et quantifier l'espace extracellulaire (ECS) du cerveau vivant. L'ECS entoure toutes les cellules du cerveau et contient à la fois du liquide interstitiel et de la matrice extracellulaire. Le transport de nombreuses substances requises pour l'activité du cerveau, y compris les neurotransmetteurs, les hormones et les nutriments, se produit par diffusion à travers l'ECS. Les changements dans le volume et la géométrie de cet espace se produisent au cours des processus cérébrales normaux, comme le sommeil, et les pathologies, comme l'ischémie. Cependant, la structure et la régulation des ECS du cerveau, en particulier dans les états malades, restent largement inexplorées. La méthode RTI mesure deux paramètres physiques du cerveau vivant: fraction volumique et tortuosité. La fraction de volume est la proportion de volume tissulaire occupée par ECS. La tortuosité est une mesure de l'obstacle relatif qu'une substance rencontre lors de la diffusion à travers un cerveauPar rapport à un milieu sans obstruction. Dans RTI, une molécule inerte est pulsée à partir d'une microélectrode source dans l'ECS du cerveau. Au fur et à mesure que les molécules se diffusent loin de cette source, la concentration changeante de l'ion est mesurée au fil du temps en utilisant une microélectrode sélective d'ions positionnée à environ 100 μm. A partir de la courbe de diffusion résultante, on peut calculer la fraction de volume et la tortuosité. Cette technique a été utilisée dans des tranches de cerveau provenant d'espèces multiples (y compris les humains) et in vivo pour étudier des modifications aiguës et chroniques à ECS. Contrairement à d'autres méthodes, RTI peut être utilisé pour examiner à la fois des modifications réversibles et irréversibles de l'ECS du cerveau en temps réel.

Introduction

L'espace extracellulaire (ECS) est le réseau de canaux interconnectés extérieurs à toutes les cellules du cerveau et contient à la fois le fluide interstitiel et la matrice extracellulaire ( Figure 1a et Figure 1b ). La distribution de nombreuses substances requises pour la fonction des cellules cérébrales, y compris les nutriments, les hormones et les neurotransmetteurs, se produit par diffusion à travers le système ECS. Les changements dans les paramètres physiques de cet espace, y compris le volume, la géométrie et la matrice extracellulaire, peuvent influer drastiquement sur la diffusion à travers l'ECS ....

Protocol

Toutes les procédures animales, utilisées pour obtenir des échantillons de tissus, ont été approuvées par le comité d'éthique animale au SUNY Downstate Medical Center.

1. Préparation des solutions et de l'équipement

1. Préparez une solution de remplissage de NaCl 150 mM pour le baril de référence de l'ISM. Rangez-le dans une seringue de 10 mL attachée à un filtre de 0,22 μm (pour éliminer les bactéries ou les particules).
2. Préparez une solution de remplissage de chlorure de TMA 150 mM (TMA-Cl) pour les microélectrodes. Rangez-le dans une seringue de 10 mL attachée à un filtre de 0,22 μm. Préparez les solutions TMA-Cl (dan....

Results

L'utilité de la technique RTI est démontrée dans une expérience conçue pour mesurer les changements dans α et pendant un défi hypoosmolaire ( Figure 8 et Figure 9 ). Il a déjà été démontré que la réduction de l'osmolarité de l'ECS par lavage sur ACSF hypotonique produirait une diminution de α et une augmentation de λ ¹³ .

Discussion

Figure 10: Données non idéales démontrant des problèmes techniques communs. (A) Les diagrammes de problèmes techniques communs avec iontophorèse microélectrodes: Comparaison de la libération normale de la TMA d'un ionophorèse fonctionnement microélectrodes avec trois sources démontrant des problèmes techniques. [Agrandissement élevé, a1] Le courant dans une source iontophorétique idéale est porté à la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Convertisseur A/N et N/A	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	Le NI USB-6221 est toujours vendu en tant que périphérique « hérité » par NI. Ils recommandent d’utiliser les DAQ NI USB-6341 de la série X pour les nouvelles installations, mais nous n’avons pas testé les unités les plus récentes. Nous décrivons l’utilisation du NI USB-6221 avec MATLAB et Windows 7 (32 bits). Alternatives : le convertisseur A/N PCI-MIO-16E-4 beaucoup plus ancien (utilisé sous Windows XP ou ancien système d’exploitation uniquement) avec panneau de connexion BNC BNC-2090 et câble SH68-68-EP. Comme indiqué dans le manuel Wanda, un programme MATLAB expérimental permettant d’utiliser les fichiers binaires Axon est disponible.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	pour préparer un gel d’agarose dilué pour les mesures RTI
amplificateur pour ISM	Dagan	Modèle IX2-700 Amplificateur de	tension ionique et de référence à double préamplificateur avec N=0.1 (pour le canon de référence) et N=0.001 (pour le baril d’ions)
Miscroscope de composé biologique (avec objectif 4x et 10x)			pour ébrécher les pointes des microélectrodes et inspecter les microélectrodes ; divers fournisseurs, e.g. AmScope
borosilicate thêta tube en verre capillaire	Harvard Apparatus	Warner Instruments modèle TG200-4 ; commande #64-0811	tube en verre à double canon pour microélectrodes sélectives d’ions et microélectrodes iontophorétiques ; D.E. 2,0 mm, D.I. 1,4 mm, septum 0,2 mm, longueur 10 cm
brosse	Winsor & Newton	University Series 233, taille 0	brosse ronde à manche shoft, disponible sur Amazon
bec bunsen	Fisher
pour la visualisation de micropipettes	Olympus	OLY-150	nécessite un moniteur, le filtre IR sur l’illuminateur de sous-platine est
enregistreur			graphique en optionenregistrer en continu les tensions sur une microélectrode sélective d’ions pendant l’étalonnage dans des étalons de tétraméthylammonium et pendant l’expérience RTI ; par ex. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel graphique enregistré, disponible remis à neuf
chlorotriméthylsilane, puriss., > 99 %	Sigma-Aldrich	# 92360	pour silanisation ; ATTENTION : inflammable, toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), corrosion cutanée, lésions oculaires, réagit violemment avec l’eau, voir les informations de sécurité Sigma-Aldrich pour une description complète
Logiciel commercial	The MathWorks	MATLAB, Boîte à outils d’acquisition de données	pour l’acquisition et l’analyse de données à l’aide des programmes Wanda et Walter. Notez qu’une licence académique est disponible.
lunettes de protection oculaire	Le
	Olympus	BX51WI	peut utiliser d’autres microscopes composés avec pince à platine fixe
	Outils de science fine #	11251-10	pour ébrécher le capillaire en verre ; Dumond #5, de préférence utilisé et n’est plus nécessaire pour le travail fin
Hotte			pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; divers supliers, par exemple Captair avec filtre approprié vendu par Erlab
lame de microscope en verre	Fisher	12-550A	à puce pointes de microélectrode
chauffant/agitateur	Fisher	Corning PC-420D	pour préparer des solutions d’agrose diluée et agiter
l’unité iontophorétique	Dagan	ION-100 et PS-100	ION-100 est une unité d’ionophorèse monocanal de conformité +/- 130 V ; Le PS-100 est une alimentation externe ; alternatives : par exemple Axoprobe-1A fabriqué par Axon Instruments (maintenant Molecular Devices), hors production, vérifier la disponibilité des unités remises à neuf (eBay et autres sites)
échangeur d’ions liquides (LIX) pour	l’échangeur d’ions potassium World Precision Instruments IE190		Remarque : cela équivaut à l’échangeur de potassium Corning d’origine 477317 à base de tétraphénlyborate - ne pas confondre avec l’échangeur de potassium à support neutre provenant du laboratoire du Dr Simon, ETH, Zurich, qui ne détecte pas le tétraméthylammonium, et qui est vendu par Fluka. Vous pouvez également fabriquer vous-même un échangeur d’ions liquides pour le tétraméthylammonium : 3 % en poids de tétrakis de potassium = borate de (p-chlorophényle) dissous dans du 2,3-diméthylnitrobenzène. Achetez des produits chimiques chez Fluka (qui fait maintenant partie de Sigma). Voir Oehme et Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86, 21-25 ; ATTENTION : Les propriétés toxicologiques de cet échangeur d’ions liquides n’ont pas été entièrement déterminées. L’ingestion ou le contact avec le corps humain peut être nocif. Faites preuve de prudence ! Les échangeurs d’ions liquides doivent être stockés dans un endroit frais, à l’abri de la lumière directe du soleil.
porte-microélectrode	WPI	M3301EH	pour maintenir le préfabriqué de microélectrode sélectif d’ions pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; WPI vend deux versions de ce support, M3301EH transparent et M3301EH noir. D’après notre expérience, le M3301EH clair semble être plus solide que le M3301EH noir.
micromanipulateur	Narishige	MM-3	pour positionner la préfabrication de microélectrodes sélectives d’ions lors de la silanisation et du remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; peut être remplacé par n’importe quel micromanipulateur à trois axes en bon état de fonctionnement
extracteur de micropipettes	Sutter Instruments	Modèle P-97	pour tirer des tubes en verre à double canon ; d’autres extracteurs peuvent être utilisés tant qu’ils peuvent accueillir un thermomètre à microsonde à tube de verre à double canon de grand diamètre
	Physiotemp	BAT-12R	la sonde fine de ce thermomètre est placée près du site d’enregistrement
, aiguille,	BD	seringues et aiguilles # 305122 (calibre 25)	pour la silanisation ; Aiguilles BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 po (0,5 mm x 16 mm)
objectif 5X sec	Olympus	MPlan N
objectif 10X immersion dans l’eau	Olympus	UMPlan FL N	10X objectif est immergé dans l’eau, l’ouverture numérique est de 0,3, la distance de travail est de 3,3 mm
Récipients en plastique (avec couvercles)	Fisher	#14-375-148	pour stocker des solutions étalons de tétraméthylammonium et des microélectrodes
plate-forme et platine de translation x-y pour microscope à platine fixe	EXFO	Gibraltar Burleigh	maintient la chambre de coupe, les micromanipulateurs et les accessoires, la platine de translation x-y déplace le microscope sans compromettre la stabilité de l’enregistrement
Minicup			pour les mesures RTI dans un gel d’agarose dilué ; adhésif réutilisable fait maison
	Bostik	Blu-Tack	pour fixer les microélectrodes au récipient de maintien et à d’autres utilisations ; divers fournisseurs, disponibles auprès d’Amazon
micromanipulateur robotique avec positionnement précis x, y, z	Sutter Instruments	MP-285	deux micromanipulateurs sont nécessaires pour tenir séparément la microélectrode sélective d’ions et la microélectrode iontophorétique. Il est également possible de coller des micropipettes dans un réseau espacé (voir texte).
Unité de conditionnement de signal avec filtre passe-bas	Axon Instruments	CyberAmp 320 ou 380	n’est plus disponible chez le fabricant mais peut être disponible chez E-Bay ; alternatives : par exemple Filtre/Amplificateur FLA-01 de Cygnus Technology. Il s’agit d’un instrument monocanal avec une coupure minimale à 10 Hz à l’aide d’un filtre de Bessel multipolaire, mais l’entreprise peut être disposée à le modifier pour une fréquence de coupure plus basse (2 Hz) si nécessaire.
fil d’argent	A-M Systems	#7830	diamètre 0,015", chambre de tranche nue (sans revêtement)
	Harvard Apparatus	Warner Modèle RC-27L	il s’agit d’une chambre de coupe par immersion ; ne pas utiliser
stéréomicroscope			pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; monté horizontalement ;
divers fournisseurs seringue, 10 mL		Seringues et aiguilles BD #309604	pour le remplissage des microélectrodes et pour la silanisation ; BD Luer-Lok tip
seringue filtre 0.22 µ ; m pore	Whatman	#6780-1302	pour filtrer les solutions de remblayage ; disponible à partir de l’aiguille de
seringue Fisher, calibre 28, 97 mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	pour remplir les microélectrodes
Tube en téflon (=PTFE) Alimentation	des composants	Paroi lumineuse du tube en PTFE STT-28 (calibre 28)	pour la silanisation d’un canon sélectif d’ions ; s’adapte aux aiguilles BD PrecisionGlide de 25 G x 5/8 po. Remarque : Le téflon est essentiel, les tubes en PVC fondraient à la cire chaude.
système de contrôle de la température	Harvard	Apparatus Warner Models TC-344B et SH-27A	TC-344B est un régulateur de température automatique double, SH-27A est un réchauffeur en ligne ; le régulateur et le réchauffeur fonctionnent avec des chambres de coupe Warner chlorure de
tétraméthyammonium (TMA)	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution ; ATTENTION : toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), cancérogénicité, dangereux pour l’environnement aquatique, voir Sigma-Aldrich Informations de sécurité pour une description complète
microtome à lame vibrante	Leica	VT1000S	pour couper les tranches de cerveau
xylènes	Fisher	X5-1	pour la silanisation ; ATTENTION : inflammable, toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), corrosion cutanée, lésions oculaires, cancérogénicité, voir les informations de sécurité Fisher pour une description complète