Expression transitoire et localisation cellulaire des protéines recombinantes dans les cellules d'insectes Cultured

Summary

Les systèmes d'expression de cellules d'insecte non lytique sont sous-utilisées pour la production, le trafic / la localisation cellulaire, la protéine recombinante et l'analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici les méthodes pour générer des vecteurs d'expression et l'expression des protéines transitoire suivante dans des lignées cellulaires lépidoptères disponibles dans le commerce. La co-localisation de Bemisia tabaci aquaporines avec des protéines de marqueur fluorescent subcellulaires est également présenté.

Abstract

Les systèmes d'expression de protéines hétérologues sont utilisées pour la production de protéines recombinantes, l'interprétation de trafic / localisation cellulaire, et la détermination de la fonction biochimique de protéines au niveau de la sous-organismal. Bien que les systèmes d'expression de Baculovirus sont de plus en plus utilisés pour la production de protéines dans de nombreuses applications biotechnologiques, pharmaceutiques et industriels, systèmes non lytique qui ne nécessitent pas l'infection virale ont des avantages évidents mais sont souvent négligés et sous-utilisés. Nous décrivons ici une méthode pour générer des vecteurs d'expression et non lytique expression de protéine recombinante transitoire. Ce protocole permet la localisation cellulaire efficace des protéines recombinantes et peuvent être utilisées pour discerner rapidement le trafic de protéines dans la cellule. Nous montrons l'expression de quatre protéines recombinantes dans une lignée de cellules d' insectes disponibles dans le commerce, y compris deux protéines aquaporines de la tabaci Bemisia insectes, ainsicomme protéines marqueurs subcellulaires spécifiques de la membrane plasmique de la cellule et pour les lysosomes intracellulaires. Toutes les protéines recombinantes ont été produites comme des chimères avec des marqueurs protéiques fluorescents à leur extrémité carboxyle, qui permet la détection directe des protéines recombinantes. La double transfection des cellules avec des plasmides hébergeant des constructions de gènes d'intérêt et un marqueur subcellulaire connu permet d'imagerie des cellules vivantes et l'amélioration de la validation de la localisation des protéines cellulaires.

Introduction

La production de protéines recombinantes en utilisant des systèmes d'expression de cellules d'insectes offre de nombreux avantages pour l'étude des protéines eucaryotes. A savoir, des cellules d' insectes possèdent des modifications post-traductionnelles similaires, de traitement et de tri des mécanismes que ceux présents dans les cellules de mammifères, ce qui est avantageux pour produire des protéines correctement repliées ^{1, 2, 3.} Les systèmes de cellules d' insectes aussi nécessitent généralement moins de ressources et moins de temps et d' efforts pour l' entretien de lignées cellulaires de mammifères ^{4, 5.} Le système d'expression baculoviral est un tel système à base de cellules d'insectes qui est maintenant largement utilisé dans de nombreuses disciplines, y compris la production de protéines recombinantes pour la caractérisation des protéines et de la thérapeutique, la présentation immunogène de peptides étrangers et des protéines virales pour la production de vaccins, la synthèse de plusieurs complexes-protéine, La production de protéines glycosylées, etc. ^{1, 2, 4, 6.} Il existe cependant des situations dans lesquelles l' expression baculoviral peuvent ne pas être applicable ^{3, 7,} et l'utilisation de systèmes d'expression d'insectes non lytique et transitoires peuvent être plus appropriés. Plus précisément, l' expression de cellules d'insecte transitoire offre la possibilité pour la synthèse rapide de protéine recombinante, nécessite moins de développement et de maintenance, ne concerne pas la lyse cellulaire imposée-virale, et fournit un moyen de mieux étudier le trafic cellulaire au cours de la synthèse des protéines ^{7, 8, 9, 10.}

Ce protocole décrit la génération rapide de vecteurs d'expression en utilisant deux étapes extension de chevauchement PCR (OE-PCR) ^{11 et le standard de clonage d'ADN de plasmide dans Escherichia coli. Les plasmides sont utilisés pour transfecter des cellules double d'insecte cultivées et disponibles dans le commerce pour produire des protéines représentatives. Le protocole décrit la production et l' utilisation de deux différentes protéines marqueurs subcellulaire marquées par fluorescence et montre une colocalisation avec deux protéines d'aquaporines du Bemisia tabaci insecte. Le protocole qui suit présente la méthode de base pour OE-PCR, l'entretien de cellules d'insectes et la transfection, et la microscopie à fluorescence pour la localisation cellulaire des protéines cibles.}

Protocol

1. OE-PCR pour la construction de Plasmides d'expression

Note: Voir le tableau 1 pour toutes les amorces utilisées dans OE-PCR. L'utilisation d'une ADN polymérase haute fidélité est recommandée pour tous les amplifications. Cependant, parce que ces enzymes fréquemment ne laissent pas de 3' A, il est nécessaire d'effectuer une brève incubation non-amplification avec une ADN-polymérase Taq à « A-tail » Les produits de PCR avant de les cloner dans une expression de cellules d'insecte TA vecteur. Ce protocole illustre une méthode pour générer des plasmides d'expression d' insecte abritant des protéines chimères, les protéines fluorescentes fusionnées dans le cadre à l'extrémité carboxy - terminale des gènes d'intérêt (dans ce cas, deux Bemisia tabaci protéines aquaporine) ou de protéines marqueurs subcellulaires (Figure 1).

1. Utilisation OE-PCR, qui se compose de deux tours indépendantes d'amplification, pour produire: (1) les séquences codant pour les gènes d'intérêt (B. tabaciaquaporine 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporine 2: BtDrip2_v1) fusionnée dans le cadre avec un variant de la protéine fluorescente verte appelée EGFP ou (2) les marqueurs subcellulaires (récepteur du peptide de sexe Drosophila melanogaster: DmSPR; Homo sapiens phospholipase A2: HsPLA2) avec la séquence codant pour mCherry. Directement ligaturer les produits finaux OE-PCR dans le pib / plasmide V5-His-TA.
   1. Pour le premier tour de OE-PCR (indiqué par la MA et A'-D » sur la figure 1), utiliser une amorce sens spécifique du gène (en gras dans le tableau 1) et une amorce antisens chimérique ( en italique dans le tableau 1) correspondant le 15 pb final (sans le codon d'arrêt) du gène de marqueur d'intérêt / subcellulaire et de 15 pb de l'extrémité 5 'du afin de générer un produit avec un surplomb en 3' protéine fluorescente souhaitée (EGFP ou mCherry).
      Note: Voir le tableau 2 pour les conditions de PCR.
   2. Dans un tube séparé, en utilisant un gène spécifamorce antisens de la protéine fluorescente ic (représenté avec un trait de soulignement dans le tableau 1) et une amorce sens chimère qui contient 15 pb de l'extrémité 3 'du gène de marqueur d'intérêt / subcellulaire et 15 pb de l'extrémité 5 ' de la fluorescence souhaitée protéine pour générer un produit avec un surplomb 5' .
      Note: Voir le tableau 2 pour les conditions de PCR. La matrice de PCR peut être soit un produit de PCR de la séquence validée ou, de l'ADN de manière davantage préférée, le plasmide portant la séquence souhaitée. L'étude décrit ici utilise des plasmides validés séquence.
   3. Séparer les produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% d'agarose (en utilisant la norme de qualité moléculaire).
   4. Accise et purifier les produits des tailles attendues (voir Tableau 2) en utilisant un kit d'extraction de gel d'ADN disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour le kit spécifique utilisé dans ce protocole).
   5. Utilisation des produits de PCR purifiés sur gel provenant de l'étape 1.1.4 pour générer le chevauchement finale eproduits XTension (indiqué par A '' - D '' sur la figure 1). Utiliser une amorce sens spécifique du gène pour le gène d'intérêt / marqueur subcellulaire et l'amorce anti-sens spécifique du gène correspondant à la protéine fluorescente pour générer la séquence chimère souhaitée.
      Note: Voir le tableau 2 pour les conditions de PCR. Il peut être nécessaire de déterminer de façon empirique les quantités optimales de produits d'extension de chevauchement du premier tour à ajouter au mélange réactionnel pour obtenir le dernier, de pleine longueur produit de PCR chimère.
   6. Séparer les produits de second tour OE-PCR par électrophorèse sur 1% d'agarose gel. Accise et purifier les produits en utilisant un kit d'extraction de gel d'ADN disponible dans le commerce.
   7. Incuber purifiés sur gel des produits de second tour OE-PCR avec une unité de mélange maître de l' ADN polymerase Taq pendant 10 min à 72 ° C pour produire les produits 3' polyadénylé (c. - A-tailed) nécessaires pour le clonage TA.
   8. Ligaturer les produits résultant adénylédans le vecteur d'expression FRP et en utilisant des techniques classiques de clonage moléculaire pour transformer chimiquement compétentes (choc thermique) ou électrocompétentes (électroporation) des cellules Escherichia coli. Pendant une nuit à plaques sur un milieu contenant le marqueur de sélection approprié ( par exemple, l' ampicilline ou à la carbénicilline).
   9. Effectuer colonie PCR ¹² utilisant une amorce spécifique de vecteur et une amorce spécifique à l' insert pour identifier les colonies d'insertion positives qui ont été transformées avec des plasmides d'expression abritant un insert dans l'orientation 5'-3 ' . Préparer les cultures des colonies de nuit générant des produits de PCR des tailles attendues.
   10. Isoler l' ADN de plasmide en utilisant un kit de purification d'ADN disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux pour le kit spécifique utilisé dans ce protocole). Valider l'intégrité de la séquence de chaque insert par séquençage d'ADN direct.

2. Entretien de la culture de cellules d'insectes

Remarque: Pour maintenir des conditions stériles, effectuer toutes les manipulations cellulaires nécessitant l'ouverture du flacon de culture de tissu dans une hotte à flux laminaire. Allumer la hotte à flux laminaire lampe UV germicide au moins 1 h avant manipulations cellulaires. Porter des gants en nitrile et décontaminer la surface du banc, des pipettes, des ustensiles, des tubes et des flacons avec 70% d'éthanol avant leur utilisation. La connaissance des techniques de culture cellulaire de base est recommandé ^13.

1. Utiliser des cellules TNI (e de la ligne de culture cellulaire établie dérivée de tissu ovarien Trichoplusia ni) qui sont adaptées à un milieu sans sérum et les conserver en tant que culture en monocouche adhérente en milieu insecte dépourvu de sérum à 28 ° C dans des flacons de culture de tissu T25.
2. Maintenir les cellules Sf9 (une lignée de culture cellulaire établie dérivée de Spodoptera frugiperda tissu ovarien) De même , mais en utilisant la culture d'insecte TNM-FH supplément de milieued avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
3. Semences de la culture initiale de Sf9 congelés ou des cellules TNI en enlevant des flacons stock de -80 ° C et en leur permettant de dégeler dans un bain d'eau à 37 ° C. Décontaminer les flacons avec 70% d'éthanol après décongélation et placez-les sur la glace.
4. Ajouter 4 ml de milieu de cellules d'insecte à un nouveau flacon T25 et le transfert de 1 ml de la suspension de cellules d'insecte décongelé. Placer le ballon dans un 28 ° C, incubateur non humidifiée et permettent aux cellules de se fixer pendant 30-45 min.
5. Remplacer le milieu d'ensemencement avec 5 ml du milieu approprié et transférer les flacons à un 28 ° C incubateur non humidifié. Surveiller la confluence des cellules par jour. Passage des cellules quand ils atteignent 90% de confluence.
   Remarque: la couverture complète du flacon T25 correspond à environ 5 x 10 ⁶ cellules.
6. Passage de cellules d' insecte.
   1. Pour le passage des cellules, d'abord éliminer le milieu épuisé du flacon contenant des cellules confluentes en utilisant une pipette sérologique de 5 ml stérile.Incliner le flacon de sorte que le milieu circule dans un coin, à l'écart de la monocouche cellulaire. Retirez délicatement le milieu à l'aide d'une pipette sans perturber les cellules.
   2. Déloger les cellules TNI en rinçant doucement les flacons T25 contenant la monocouche confluente avec 4 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum en utilisant de nouveau, stérile, 5 mL pipette sérologique. Déplacez la pointe de la pipette dans le flacon et l'irrigation lentement pour éliminer les cellules lâchement au fond du flacon.
      1. Vérifiez que le détachement adéquat de cellules en supprimant tous les médias, en tournant le ballon sur, et en observant que le fond du flacon est clair.
   3. Pour les cellules Sf9, qui adhèrent plus étroitement, ajouter 4 ml de milieu frais TNM-FH et utiliser un grattoir cellulaire pour déloger les cellules attachées. Utiliser une pipette sérologique 5 ml à mélanger délicatement et réduire agglomérante cellulaire.
   4. Utiliser un compteur de cellules automatisé pour estimer le nombre de cellules d'insectes viables par volume de milieu. Transférer 0,1 ml de mélange de cellules / milieu à 1,5 mlle tube microfuge. Dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation séparé, ajouter 10 ul de mélange de cellules / milieu de 10 pi de bleu trypan.
   5. Retirer une lame de chambre de compteur de cellules de son emballage et ajouter 10 ul de la cellule / support / mélange de bleu trypan à chaque côté de la lame de comptage. Insérer la diapositive dans le compteur de cellule et déterminer la densité de cellules et la viabilité.
   6. En utilisant la densité cellulaire, calculer et ajouter le volume approprié de milieu de cellules d'insectes (jusqu'à 5 ml) à de nouveaux flacons T25 stériles.
   7. Transférer environ 1 à 1,5 x 10 ⁶ cellules dans des flacons T25 avec du milieu frais; étiqueter les flacons avec la lignée cellulaire, la date, le milieu utilisé, le nombre de cellules ajoutées, et le numéro de passage (P _n + 1 de génération, où P _n est le nombre de passage pour la génération précédente de cellules); et placer les flacons dans un incubateur à 28 ° C pendant jusqu'à 72 h.
      Remarque: Les cellules d'insectes peuvent être propagées de façon continue, bien que les cellules peuvent être moins réceptifs à la transfection et / ou hétérologueexpression de la protéine après 30 passages. Traiter toutes les cellules mis au rebut / support avec une solution d'eau de Javel à 10% et autoclave articles en plastique jetable avant d'être éliminés.

3. Transfection cellulaire d'insecte

1. Ensemencer un flacon T25 avec un maximum de 1 x 10 ⁶ TNI ou des cellules Sf9 dans un milieu de cellules d'insecte approprié (milieu insecte dépourvu de sérum pour Tni et TNM-FH de Sf9) et de croître jusqu'à confluence pendant 72 heures à 28 ° C.
2. Retirez et jetez l'ancien milieu et déloge les cellules avec 4 ml de milieu d'insectes sans sérum frais (voir les étapes 2.6.2 et 2.6.3, ci-dessus).
3. Estimer la densité cellulaire en utilisant un compteur de cellules automatisé (voir l'étape 2.6.4, ci-dessus).
4. Ajouter environ 7 x 10 ⁵ cellules à des boîtes individuelles à fond de verre de 35 mm et laisser les cellules se fixer pendant 20 à 25 min à 28 ° C.
5. Pour chaque transfection, on ajoute 2 pg d'ADN de plasmide (soit à partir d'un plasmide unique ou pour des transfections 2 pg de chacun des deux plasmides pour dotransfections üble) à 0,1 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum (sans FBS pour les deux transfections Sf9 et TNI) dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation stérile.
6. Dans un tube séparé, mélanger 8 pi de réactif de transfection avec 0,1 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum, puis transférer cette solution dans le tube contenant l'ADN plasmidique d'intérêt. vortex légèrement et incuber à température ambiante pendant 20 - 30 min.
7. On dilue le mélange plasmide-transfection des étapes 3,5 et 3,6 avec 0,8 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum de sorte que le volume total est égal à 1 mL.
8. Retirez délicatement les médias de la vaisselle en verre contenant des cellules attachées. Superposer les cellules fixées avec le milieu plasmide-transfection diluée.
9. Incuber les cellules à 28 ° C pendant 5 h.
   Remarque: Les conditions de transfection nécessitent une optimisation empirique pour une efficacité maximale de transfection (par exemple, la transfection pendant la nuit au lieu de 5 h, la quantité d'ADN de plasmide utilisé, la chimie du réactif de transfectionutilisé, etc.).
10. Enlever et jeter le milieu de transfection et doucement laver les cellules avec 1 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum, en faisant attention à ne pas déloger les cellules.
11. Ajouter 2 mL de milieu de cellules d'insecte frais (milieu insecte dépourvu de sérum pour Tni et TNM-FH de Sf9) et incuber à 28 ° C pendant 48-72 h.
    Remarque: Encore une fois, les conditions exigent une optimisation empirique pour l'expression de la protéine hétérologue maximale.

4. confocale Microscopie Fluorescence

1. A 48-72 h après la transfection, laver les cellules une fois avec 1 ml de milieu d'insecte IPL-41, puis couvrir avec 2 ml d'IPL-41 pour l'imagerie.
   Note: Cette étape de lavage réduit l'auto-fluorescence de fond observée avec un milieu de cellules d'insectes utilisés dans l'entretien des cellules normales.
2. Ajouter 4 gouttes de réactif de coloration Hoechst direct des cellules (voir la table des matières pour la coloration nucléaire spécifique utilisé dans ce protocole) au milieu et incuber à 28 ° C pendant 20 à 25 min.
   Note: NUC supplémentairesles taches Lear peut être substitué, bien que le colorant doit avoir un profil de fluorescence unique à partir de EGFP et mCherry.
3. Placer une boîte de 35 mm dans le microscope confocal à balayage laser fermée auto-(voir la table des matières de l'appareil spécifique utilisé dans ce protocole).
4. Ajuster le microscope pour Hoechst, EGFP, et les conditions d'observation mCherry: Hoechst excitation / émission - 359/461 nm; EGFP excitation / émission - 489/510 nm; excitation mCherry / émission - 580/610 nm.
5. Effectuer une analyse initiale en utilisant un objectif 10x pour confirmer l'expression fluorescent, puis passer au mode de balayage en utilisant un objectif d'immersion dans l'eau de contraste de phase 60X.
6. Régler la puissance du laser (5-7%), de la sensibilité du détecteur (47-49%), la vitesse de balayage, la profondeur de l'axe Z, et le zoom numérique pour optimiser le contraste de l'image et la résolution. Imager les cellules à zoom 1,5x numérique pour donner un total d'amplification 90X.
   Remarque: Les paramètres de microscope nécessitent un réglage optimal empiriquecollection d'images et peut être spécifique à l'instrument utilisé.
7. Exporter les données brutes sous forme de fichiers d'images TIFF et modifier (culture et overlay) pour la production de la figure.

Results

OE-PCR

OE-PCR permet la synthèse de produits d'ADN chimères qui, une fois inséré dans un vecteur d'expression, de permettre la production de protéines chimères recombinantes correspondant à un gène de test d'intérêt et de la protéine marqueur fluorescent. La figure 1 représente un schéma général pour la production de vecteurs d'expression contenant FRP B. tabaci séquences codant pour l' aquaporine (BtDri...

Discussion

Systèmes d'expression de protéines hétérologues sont des outils importants pour la production de protéines recombinantes utilisées dans de nombreuses applications en aval ^4. Le choix des divers systèmes d'expression disponibles dépend de l'objectif final de la protéine d'intérêt. Plusieurs systèmes d'expression de cellules d' insectes sont disponibles qui offrent des alternatives flexibles aux systèmes d'expression de cellules procaryotes et eucaryotes

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA polymérase	EMD Millipore	71085-3	ADN polymérase haute fidélité utilisée pour la PCR Amplification de l’extension de chevauchement Produits PCR
ExTaq DNA polymérase	TaKaRa-Clontech	RR001B	ADN polymérase utilisée pour la découpe A des produits PCR
EconoTaq PLUS GREEN 2x ADN polymérase Master Mix	Lucigen	30033-1	ADN polymérase utilisée pour la PCR
de colonie bactérienneBiometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher		S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contient les composants nécessaires au clonage des produits de PCR d’extension de chevauchement, y compris le vecteur pIB/V5-His-TOPO activé par linéarisation et topoisomérase I, l’E. coli chimiquement compétent One Shot TOP10 et la solution saline.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Station de travail robotique	Qiagen	9001292
Purificateur Banc de nettoyage vertical	Labconco	3970401
Tni Lignée de cellules d’insectes cultivés	Allèle Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 Cellules d’insectes cultivés Lignée	Allèle Biotech	ABP-CEL-10002
Milieu de culture d’insectes sans sérum	Allèle Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Milieu de culture	d’insectes Allèle Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insecte Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Réactif de transfection	ThermoFisher	10362100
16 cm Grattoir cellulaire jetable	Sarstedt	83.1832	Cell grattoirs à lame à deux positions
25 cm2 (T25) Fioles de culture tissulaire avec capuchons filtrants d’évent	Produits des sciences de la vie	CT-229331
Pipettes de transfert	Fisher	1371120
stériles, 50 mL	Produits des sciences de la vie	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Sérologique Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0,5 mL Tubes PCR à capuchon plat	Fisher	14230200
Polypropylène Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Plats à fond en verre	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	Diamètre du plat 35 mm, diamètre du verre 14 mm, épaisseur du verre 1,5 mm, incubateur non revêtu,
modèle 1510E	VWR	35823-961
Compteur de cellules Countess II FL	Lames	AMQAF1000
Countess avec réactif bleu trypan à 0,4 %	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Microscope confocal à balayage laser	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 ADN plasmidique	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Réactif (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605