Article de méthode

Techniques de laboratoire utilisées pour maintenir et différencier les biotypes de Vibrio cholerae Isolats cliniques et environnementaux

DOI :

10.3791/55760

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30 mai 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit les bonnes techniques de maintenance de Vibrio cholerae en plus d'une série de tests biochimiques, utilisés collectivement pour une différenciation rapide et fiable entre V clinique et environnementale. Biotypes de cholérae en laboratoire.

Résumé

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La bactérie aquale Gram négatif Vibrio cholerae est l'agent étiologique de la maladie gastro-intestinale infectieuse choléra. En raison de la prévalence et de la gravité mondiales de cette maladie, V. Cholerae a été largement étudié à la fois dans les environnements environnementaux et de laboratoire, nécessitant des techniques de maintenance et de culture appropriées. Classique et El Tor sont deux biotypes principaux qui composent le V. Le sérogroupe de cholerae O1, présentant chacun des caractéristiques génotypiques et phénotypiques uniques qui fournissent des mécanismes fiables pour la caractérisation du biotype et nécessitent des conditions de culture induisant une virulence distincte. Indépendamment du biotype de la souche causale pour une infection ou une flambée donnée, le traitement standard pour la maladie implique une thérapie de réhydratation complétée par un régime d'antibiotiques. Cependant, la classification des biotypes peut être nécessaire pour les études de laboratoire et peut avoir des impacts plus larges dans le domaine biomédical.Au début des années 2000, des isolats cliniques ont été identifiés et présentent des caractéristiques génotypiques et phénotypiques à la fois des biotypes classiques et El Tor. Les hybrides nouvellement identifiés, appelés les variantes El Tor, ont fait que l'identification des biotypes isolés cliniques et environnementaux devient plus complexe que les protocoles d'identification traditionnels précédents. En plus de décrire V. Cholerae, maintenance générale et techniques de culture, ce manuscrit décrit une série d'écrans génétiques et de tests phénotypiques spécifiques à la gène ( ctxB et tcpA ) (résistance au polymyxine B, métabolisme du citrate, activité protéolytique, activité hémolytique, motilité et métabolisme du glucose via Voges- Analyse Proskauer) utilisé collectivement pour caractériser et / ou distinguer les biotypes classiques et El Tor. Ensemble, ces tests fournissent une approche systématique efficace pour être utilisée comme alternative, ou en plus, à des expériences coûteuses et à forte intensité de main-d'œuvre dans la caractérisationTion de V. Isolats cliniques (et environnementaux) de cholerae .

Introduction

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Le choléra est une maladie de l'intestin grêle distal causée par la consommation d'aliments contaminés ou d'eau contenant la bactérie Gram-négative Vibrio cholerae aquatique. Les symptômes du choléra incluent les vomissements et la diarrhée aqueuse incontrôlable, entraînant une déshydratation sévère qui, si elle n'est pas traitée correctement, entraînera la mort. V. Cholerae peut être divisé en plus de 200 sérogroupes basés sur la structure de l'antigène O de lipopolysaccharide de surface cellulaire. Cependant, seuls 2 sérogroupes, O1 et O139 ont montré un potentiel d'épidémie ou de pandémie 1 , 2 . En outre, le sérogroupe O139 a été principalement isolé dans le sud-est de l'Asie 3 , 4 , tandis que le sérogroupe O1 est distribué dans le monde entier. En outre, le sérogroupe O1 peut être divisé en 2 biotypes principaux: classique et El Tor. Le biotype classique était responsable de la première 6 pandémie de choléraS entre 1817 et 1923. La septième pandémie actuelle est le résultat du biotype El Tor, qui a déplacé globalement le biotype classique dans l'environnement 5 , 6 , 7 . Récemment, des souches ont eu des caractéristiques distinctives des biotypes classiques et El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 et ont été appelées variantes El Tor 13 , 17 . Certaines variantes d'El Tor ont démontré des capacités de virulence élevées avec une progression de la maladie plus rapide et plus sévère que celles observées précédemment, soulignantLa nécessité d'une approche plus complète de l'identification des agents et de la prévention et du traitement des maladies 8 , 9 , 18 . Bien que l'identification des biotypes ne dicte pas immédiatement le traitement, d'autres progrès dans le développement du vaccin et les futurs agents thérapeutiques peuvent bénéficier de la distinction du biotype.

La première série de protocoles répertoriés ici permettra aux enquêteurs de maintenir correctement V. Cholerae dans un milieu de laboratoire. La cohérence et l'analyse ultérieure nécessitent la préparation des stocks et la croissance des isolats, qui ne dépend pas du biotype. Cependant, pour induire de manière optimale l'expression du gène de la virulence, des techniques indépendantes de culture de biootype sont nécessaires 19 . En outre, la préparation de divers essais génétiques et biochimiques est présentée dans ce manuscrit.

La toxine du choléra (CT) et la toxine co-rePilus goudronné (TCP) sont deux principaux facteurs de virulence contrôlés par le régulateur principal ToxT dans les deux biotypes du V. Cholerae O1 serogroup 20 . CT est une toxine bipartite composée de cinq CtxB Sous-unités entourant une seule sous-unité CtxA, et est responsable de la perte rapide d'électrolyte associée au choléra. TCP est un pilus de type IV codé par l'opéron tcp ( tcpABQCRDSTEF ) et implique l'attachement et la colonisation de l'intestin grêle distal. TcpA est le premier gène de l'opéron tcp qui code les sous-unités individuelles de piline essentielles à la construction du pilus 8 . La séquence génétique pour ctxA est complètement conservée entre les biotypes classiques et El Tor, tandis que ctxB et tcpA diffèrent selon les deux biotypes mais sont conservés au sein de chaque biotype 8 . CtxB est complètement conservé entre les biotypes sauf à deux positions de baseTions (115 et 203). Dans le biotype El Tor, la thymine réside aux positions de base 115 et 203, tandis que le biotype classique contient de la cytosine à ces bases. TcpA est complètement conservé au sein de chaque biotype, mais diffère à plusieurs bases entre les biotypes. Ces distinctions génétiques servent de marqueurs d'identification de biotype primaires et, après séquençage du produit d'amplification de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), y compris ces sites, les séquences isolées peuvent être comparées aux O395 ou WT El Tor N16961 de type sauvage (WT) pour déterminer l'arrière-plan du biotype De CT et TCP, respectivement, dans un isolât donné V. cholerae .

De nombreux protocoles ont été développés pour caractériser les distinctions phénotypiques entre les biotypes classiques et El Tor 21 , 22 , 23 . La polymyxine B est un antibiotique peptidique qui compromet l'intégrité de la membrane cellulaire externe dans un bac Gram négatifEt la résistance à la polymyxine B peuvent être visualisées à travers le test de résistance à la polymyxine B 21 . La citrate est un substrat primaire du cycle du Kreb et la capacité de métaboliser le citrate comme seule source de carbone peut être déterminée en utilisant le dosage du métabolisme citrate 22 . HapR code un régulateur global et le régulateur de détection de quorum maître dans V. cholerae, HapR, qui se lie à différentes régions de promoteur et régule l'expression de gène et d'opéron 24 . Certaines souches pathogènes de V. cholerae ont une mutation de changement de cadre naturelle dans le gène hapR qui a causé la perte de cette régulation dépendante de la densité de l'expression du gène de la virulence 24 , 25 . La mesure de l'activité de protease régulée par HapR en utilisant des milieux de gélose au lait permet au chercheur d'identifier si un isolât particulier contient un HapR 23 fonctionnel. leTests de dosage de l'hémolyse pour la capacité d'une souche à sécréter des enzymes hémolytiques qui lyse les globules rouges; Le degré d'hémolyse peut être visualisé sur les plaques d'agar sanguin 23 . La motilité est souvent associée à la virulence chez V. cholerae et peut être analysée à l'aide de plaques d'agarine de motilité 23 . Le test Voges-Proskauer teste la capacité d'une souche à fermenter le glucose en tant que seule source de carbone et produit le sous-produit acétoïne 21 . Avec l'émergence de variantes d'El Tor, il est difficile de prédire les résultats d'un dosage phénotypique donné sans dépistage génotypique étendu et avant de déduire le fond de biotype de V. Cholerae, il est recommandé d'effectuer cet assemblage des dosages 23 et de comparer les résultats aux souches de référence comme dans le tableau 2 .

Dans ce cas, nous avons avancé une série de protocoles, en utilisant collectivement ce qui précèdeDes tests génotypiques et phénotypiques pour une approche plus globale pour caractériser V. Biotypes de choléra. De plus, nous avons décrit les distinctions génotypiques et phénotypiques des V connus. Cholerae El Tor variantes (MQ1795 et BAA-2163), par rapport aux souches de référence de biotype couramment utilisées (WT classique O395, WT El Tor C6706 et WT El Tor N16961, tableau 1 ). L'émergence de variantes d'El Tor a présenté des défis à la fiabilité des protocoles de caractérisation de biotype à dosage unique précédemment employés; Cependant, ce système d'identification par dosage multiple permettra une caractérisation plus sûre des V cliniques et environnementales. Isolats de cholerae .

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Protocole

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Remarque: Les considérations de temps pour chaque essai doivent être effectuées car les préparations multimédias individuelles nécessitent des temps différents. Par exemple, les supports de plaque de gélose solide doivent être suffisamment frais et sécher (1-2 jours). Des considérations de temps supplémentaires ( c.-à-d. Une colonie unique et une croissance de la culture pendant la nuit) sont spécifiées dans chaque protocole et se trouvent dans le tableau 2 .

1. Préparation des médias

  1. 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
    1. Peser 4,0 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,72 g de Na 2 HPO 4 et 0,12 g de KH 2 PO 4 . Mélanger les constituants dans un flacon Erlenmeyer de 1 L, ajuster le volume à 500 mL avec de l'eau désionisée, ajuster le pH à 7,2 en utilisant un pHmètre et ajouter HCl goutte à goutte à la solution, et autoclave ou filtrer stériliser à l'aide d'un filtre de 0,22 μm. 1x PBS peut être conservé à température ambiante indéfiniment.
      ATTENTION: Le HCl est un acide concentré et doit être manipulé selonAux règlements institutionnels, locaux, étatiques et fédéraux. Pour les directives de manutention appropriées, reportez-vous à la fiche de données de sécurité fournie par le fabricant.
  2. Luria-Bertani (LB) Bouillon
    1. Peser 5,0 g de triptonne, 2,5 g d'extrait de levure et 2,5 g de NaCl. Mélanger les constituants dans une bouteille de 1 L, ajuster le volume à 500 mL avec de l'eau désionisée, autoclave et conserver à température ambiante jusqu'à 6 mois. Pour les conditions classiques de la virulence du biotype, ajustez le pH à 6,5 en utilisant HCl avant l'autoclavage.
  3. AKI Medium contenant 0,03% (p / v) de NaHCO 3
    1. Pour le composant 1 (milieu AKI): peser 7,5 g de peptone, 2,0 g d'extrait de levure et 2,5 g de NaCl. Mélanger les constituants dans une bouteille de 1 L, régler le volume à 450 ml avec de l'eau désionisée et l'autoclave. Le milieu AKI peut être conservé à température ambiante jusqu'à 6 mois.
    2. Pour le composant 2 (NaHCO 3 ): peser 1,5 g de NaHC03 et régler le volumeÀ 50 ml avec de l'eau désionisée dans une vésicule stérile. Filtrer stériliser le NaHC03 en utilisant un filtre de 0,22 μm. Le NaHC03 doit être préparé immédiatement avant utilisation.
    3. Combinez aspechement les deux composants en créant un rapport 1:10 en filtrant le composant 2 dans le composant 1 avant utilisation.
  4. Plaques d'agartes Luria-Bertani (LB)
    1. Peser 5,0 g de triptonne, 2,5 g d'extrait de levure, 2,5 g de NaCl et 7,5 g d'agar. Mélanger les constituants dans un flacon Erlenmeyer de 1 L, régler le volume à 500 mL avec de l'eau désionisée, l'autoclave et préparer dans des boîtes de Petri stériles standard de 100 mm x 15 mm. Les supports plaqués peuvent être stockés en plastique jusqu'à 6 mois, le couvercle vers le haut à 4 ° C.
  5. LB Agar Plates Supplémentées avec Polymyxine B
    1. Pour la Composante 1 (agar LB): pesez 5,0 g de triptonne, 2,5 g d'extrait de levure, 2,5 g de NaCl et 7,5 g d'agar. Mélanger les constituants dans une fiole Erlenmeyer de 1 L, ajuster le volume à 500 mL wiEau désionisée et autoclave.
    2. Pour la Composante 2 (polymyxine B): dissoudre la polymyxine B dans de l'eau désionisée dans un tube de microcentrifugeuse stérile de 2 mL jusqu'à une concentration de 50 000 UI / μL et filtrer la stérilisation à l'aide d'un filtre de 0,22 μm.
    3. Une fois que le Composant 1 est frais au toucher, mais pas encore solidifié, ajouter soigneusement 500 μL de Composant 2 au Composant 1 en créant une concentration finale de 50 UI / μL et bien mélanger. Préparez dans des boîtes de Petri stériles standard de 100 mm x 15 mm en versant du mélange de milieu d'agar dans les boîtes de Petri. Les supports plaqués peuvent être stockés en plastique jusqu'à 3 mois, côté couvercle vers le haut à 4 ° C.
  6. Plaques d'agartes moyennes de citrate minimale
    1. Pour le composant 1 (agar avec du bleu de bromothymol): pèser 7,5 g d'agar et 0,02 g de bleu de bromothymol. Mélanger les constituants dans une fiole Erlenmeyer de 1 L, régler le volume à 450 mL avec de l'eau désionisée et autoclaver le mélange.
    2. Pour le composant 2 (10x VBMM): pesez 10,00 g de MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g d'acide citrique H 2 O, 50,0 g de K 2 HPO 4 anhydre et 17,5 g de NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Mélanger les constituants dans un flacon Erlenmeyer 1 L, régler le volume à 500 ml Avec de l'eau désionisée et un autoclave ou filtre une stérilisation à l'aide d'un filtre de 0,22 μm. 10x VBMM peuvent être conservés à température ambiante jusqu'à 6 mois.
    3. Ajouter 50 ml du composant 2 au composant 1 et préparer dans des boîtes de Petri stériles de taille standard de 100 mm x 15 mm en versant des milieux de gélose mélangés dans les boîtes de Petri. Les supports plaqués peuvent être stockés en plastique jusqu'à 6 mois, le couvercle vers le haut à 4 ° C.
  7. Plaques Agar au lait
    1. Pour le Composant 1 (lait): pesez 8,0 g de lait sec non grasse instantané dans un flacon Erlenmeyer de 1 L, réglez le volume à 200 mL avec de l'eau désionisée et l'autoclave.
    2. Pour le composant 2 (agar avec infusion cérébrale): peser 3,68 g de perfusion cérébrale et 6,0 g d'agar. Combinez le conDans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml, ajustez le volume à 200 ml avec de l'eau désionisée et de l'autoclave.
    3. Combinez les deux composants en versant le Composant 2 dans le Composant 1, après l'autoclavage et bien mélanger. Préparez dans des boîtes de Petri stériles de 150 mm x 15 mm. Les plaques de lait peuvent être stockées jusqu'à une semaine en plastique, côté couvercle vers le bas à 4 ° C. Préparez dans des boîtes de Petri stériles de 150 mm x 15 mm en versant du mélange de milieu d'agar dans les boîtes de Petri.
  8. Plaques d'agate de motilité
    1. Pour le Composant 1 (agar LB): pesez 5,0 g de triptonne, 2,5 g d'extrait de levure, 2,5 g de NaCl et 2,0 g d'agar. Mélanger les constituants dans une fiole Erlenmeyer de 1 L, régler le volume à 500 mL avec de l'eau désionisée et l'autoclave.
    2. Pour le composant 2 (1% (p / v) de chlorure de triphényltétrazolium; TTC): pesez 0,25 g TTC. Réglez le volume à 25 mL avec de l'eau désionisée dans une vésicule stérile et filtrez-le en utilisant un filtre de 0,22 μm. Conserver jusqu'à 6 mois à la température ambiante emballéeEn aluminium pour minimiser l'exposition à la lumière.
    3. Ajouter 2,5 ml de TTC stérile à 1% (p / v) sur des supports autoclavés.
    4. Verser le milieu aussi épais que possible (≥50 mL / plaque) dans de grandes boîtes de Petri stériles de 150 mm x 15 mm. Les supports plaqués peuvent être stockés enveloppés en plastique jusqu'à une semaine, côté couvercle vers le haut à 4 ° C. Préparez dans des boîtes de Petri stériles de 150 mm x 15 mm en versant du mélange de milieu d'agar dans les boîtes de Petri.
  9. Voges-Proskauer (VP)
    1. Pour le composant 1 (bouillon Methyl Red-Voges-Proskauer, MR-VP): pesez 1,7 g de milieu MR-VP dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml, réglez le volume à 100 ml avec de l'eau désionisée et de l'autoclave. Le bouillon stérile MR-VP peut être conservé à température ambiante jusqu'à 6 mois.
    2. Pour le composant 2 (5% (p / v) alpha (α) naphtol): peser 1,0 g d'α-naphtol dans une vésicule stérile et ajuster le volume à 20 ml avec de l'éthanol à 95%. L'α-naphtol peut être stocké à température ambiante pendant jusqu'à 1 semaine enveloppé en feuille pour minimiser l'exp.Osure.
    3. Pour le composant 3 (40% (p / v) d'hydroxyde de potassium, KOH): pesez 20,0 g de KOH dans une vésicule stérile, ajustez le volume à 50 ml avec de l'eau désionisée stérile. KOH peut être conservé jusqu'à 6 mois à température ambiante dans un récipient en plastique.

2. Entretien et croissance de V. Cholerae Strains

  1. Préparation et utilisation des cultures de stock congelées
    1. Pellet 1,8 ml de culture liquide pendant une nuit pendant 2 min par centrifugation (≥8,600 xg) dans un tube de microcentrifugeuse stérile de 2 mL, enlever le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 900 μL de bouillon LB frais par pipettage.
    2. Ajouter 900 μL de glycerol stérile à 60% (v / v) à la culture et mélanger par vortexage.
    3. Transférer le mélange dans un tube cryogénique stérile de 2 ml et conserver indéfiniment à -80 ° C.
    4. Pour l'utilisation, enlever une petite quantité de produit congelé en utilisant une boucle d'inoculation stérile et une strie pour des colonies simples sur LB agAr plates. Retourner immédiatement le stock congelé à -80 ° C après utilisation pour empêcher les cultures de décongeler complètement. Incuber les plaques au couvercle vers le bas pendant 12 à 16 h à 37 ° C.
  2. Croissance des cultures de nuit en milieu liquide
    1. Séquence pour les colonies simples (selon la section 2.1.4) à partir du stock congelé sur des plaques d'agar LB. Incuber les plaques au couvercle vers le bas pendant 12 à 16 h à 37 ° C.
    2. Inoculer 4 mL de bouillon LB liquide dans un tube de culture stérile de 10 mL avec une seule colonie en touchant la surface de la colonie unique avec un bâton applicateur stérile et en transférant la colonie dans le bouillon liquide.
    3. Incuber avec une aération dans un incubateur à agitateur à 225 tr / min pendant 12 à 16 h à 37 ° C.
  3. Courbe de croissance
    1. Préparez une culture de nuit dans un bouillon LB liquide comme indiqué précédemment dans le protocole 2.2.
    2. Faire une dilution 1: 100 de la culture de nuit en transférant 250 μL de culture de nuit à 25 ml de bouillon LB frais dans un ballon Erlenmeyer stérile de 250 ml.
    3. Mesurer la densité optique des cultures liquides à 600 nm (OD 600 ) toutes les heures à partir du moment de l'inoculation (T 0 ).
    4. Incuber une dilution 1: 100 de culture pendant une nuit avec une aération dans un incubateur à agitateur à 225 tr / min pendant jusqu'à 30 h à 37 ° C, ou jusqu'à ce que la culture atteigne une densité maximale.
    5. Graphisez le OD 600 vs Time et utilisez une régression linéaire pour déterminer le temps de doublement approximatif pour chaque souche.
  4. El Tor Biotype Virulence Inducing Conditions
    1. Séquence pour les colonies simples à partir de stocks congelés sur des plaques d'agar LB. Incuber les plaques du couvercle vers le bas, pendant 12 à 16 h à 37 ° C.
    2. Inoculer 10 ml de milieu AKI contenant 0,03% (p / v) de NaHC03 avec une colonie unique.
    3. Incuber la culture sans aération à 37 ° C pendant 3,5 h.
    4. Retirer 7 mL de culture et incuber les 3 mL restants de cultuRe avec une aération dans un incubateur de secoueur à 225 tr / min pendant 4 h supplémentaires.
  5. Conditions classiques de l'induire de la virginité du biotype
    1. Séquence pour les colonies simples à partir de stocks congelés sur des plaques d'agar LB. Incuber les plaques au couvercle vers le bas pendant 12 à 16 h à 37 ° C.
    2. Inoculer 4 ml de bouillon LB liquide (pH 6,5) avec une seule colonie.
    3. Incuber avec une aération dans un incubateur à agitateur à 225 tr / min pendant 12 à 16 h à 30 ° C.
  6. Pellet de cellule de lavage dans 1x PBS
    1. Pellet 1,8 ml de culture pendant une nuit pendant 2 minutes par centrifugation (≥8 600 xg) dans un tube de microcentrifugeuse stérile de 2 ml et enlever le surnageant en utilisant une pipette. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1,8 mL 1x PBS par pipettage.
    2. Répéter la procédure de lavage trois fois suivie d'une resuspension finale dans 1,8 mL 1x PBS.

3. Caractérisation de V. Cholerae Biotypes

  1. PÉcrans génétiques à base de CR utilisant ctxB et tcpA
    1. Concevez un ensemble d'amorces qui recouvrent environ 50 à 70 pb en amont et en aval des sites de départ et d'arrêt translationnels de ctxB et tcpA respectivement.
    2. Préparez une culture de nuit dans un bouillon LB liquide comme indiqué précédemment dans le protocole 2.2.
    3. Isoler l'ADN chromosomique en utilisant un kit disponible dans le commerce conçu pour les bactéries Gram-négatives. L'ADN chromosomique purifié peut être conservé indéfiniment à -20 ° C. L'isolement chromosomique de l'ADN utilisant des kits disponibles dans le commerce prend généralement environ 4 h.
    4. Utilisez un spectrophotomètre à micro-volume pour s'assurer que l'échantillon d'ADN chromosomique est de haute qualité (A 260/280 > 1.8).
    5. Pour chaque isolat d'ADN chromosomique, préparez une (des) réaction (s) en chaîne par polymérase (PCR) sur de la glace dans un tube de PCR 200 μL stérile et amplifiez les régions de ctxB et tcpA en utilisant des composants de PCR standard: Taq polymerase and buFfer (ou équivalents), la solution dNTP et les amorces avant / inverses. Utilisez des paramètres de PCR standard (~ 3 h). Par exemple, utilisez le protocole suivant:
      1. Dénature initiale à 95 ° C pendant 120 s.
      2. Denature à 95 ° C pendant 60 s.
      3. Imbibes de recuit à 60 ° C pendant 45 s.
      4. Étendre à 72 ° C pendant 90 s.
      5. Répétez les étapes 3.1.5.2 à 3.1.5.4 pendant 34 cycles.
      6. Extension finale 72 ° C pour 600 s.
      7. Atteinte infinie à 4 ° C.
    6. Colorer 5 μL de produit (s) de PCR respectif en utilisant un colorant de chargement standard de gel d'ADN 6x et charger environ 10 μL d'échelle de 1 kb et 10 μL de produit de PCR sur un gel d'agarose à 1% dans 1x Tris-Borate-EDTA (TBE) tampon.
    7. Effectuez une électrophorèse sur gel à 130 V jusqu'à ce que le front de teinture atteigne la fin, mais pas éteint, du gel (environ 90 minutes). La surveillance constante est recommandée car la tension et les temps de fonctionnement peuvent varier en fonction de l'équipement.
    8. Lors de la vérification deUne amplification réussie par PCR à la taille attendue, purifie le (s) produit (s) de PCR de 45 μL restants en utilisant un kit de nettoyage et de concentrateur d'ADN disponible dans le commerce.
    9. Produit (s) de PCR nettoyé par séquence à l'aide des mêmes amorces utilisées pour l'amplification par PCR, et prépare selon les directives de l'installation de séquençage local.
    10. Comparez le format FASTA des séquences de gènes de chaque isolat à la séquence publiée disponible sur le site Web de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), en recherchant les numéros d'accession suivants dans la zone de recherche.
    11. CtxB : région (classique) entre VC0395_A1059 à VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. TcpA : (classique) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Essais phénotypiques pour la classification des biotypes via Spotting
    1. Préparez une culture de nuit dans un bouillon LB liquide comme indiqué précédemment dans le protocole 2.2.
    2. Laver la ou les pastilles cellulaires comme spécifié dans le protocole 2.6.
    3. Utilisez une pipette pourLocaliser 1 μL de culture lavée sur le milieu respectif. Pour les spécifications de sélection et d'incubation moyennes, se référer au tableau 2.
  3. Test de motilité
    1. Préparez une (ou des) culture (s) pendant la nuit dans un bouillon LB liquide comme indiqué précédemment dans le protocole 2.2.
    2. Laver la ou les pastilles cellulaires comme spécifié dans le protocole 2.6.
    3. Inoculer les plaques de gélose de motilité en insérant une cuvette d'inoculation dans la culture liquide lavée et à "couper le couteau" verticalement dans le milieu. Entre chaque inoculation, stériliser le coup de fil à l'aide d'un brûleur Bunsen, et en saisissant la gélose, assurez-vous que la piqûre d'inoculation ne se plie pas, car cela peut modifier les résultats.
    4. Incuber les plaques du couvercle vers le haut pendant 14 à 24 h à 37 ° C. Après 14 h, surveiller les plaques de motilité de manière étroite afin de prévenir le surcroît de culture.
  4. Ensemble Voges-Proskauer (VP)
    1. Préparez une (ou des) culture (s) pendant la nuit dans un bouillon LB liquide comme indiqué précédemment dans le protocole 2.2.
    2. Inoculer 4Ml de vermicelle de méthyle Voges-Proskauer, ou bouillon de MR-VP, en pipetant 10 μl de culture de nuit préalablement préparée dans 4 ml de bouillon MR-VP dans un tube de culture stérile et incuber avec une aération dans un incubateur à agitateur à 225 tr / min pendant 12 à 16 H à 37 ° C.
    3. Ajouter 150 μl de α-naphtol à 5% (p / v) et 50 μL de KOH à 40% (p / v) à 1 ml d'aliquotes de culture de nuit MR-VP dans des tubes de culture stériles, respectivement.
    4. En bref, tourbillonner et laisser reposer à température ambiante jusqu'à 4 h jusqu'à ce que le changement de couleur se développe.

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Résultats

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Pour un entretien et une utilisation appropriés de toute souche bactérienne, il est recommandé de connaître le temps de doublement de la (les) souche (s) d'intérêt. Dans ce cas, les taux de croissance variables des V couramment utilisés. Les souches de cholerae ont été démontrées par une courbe de croissance, et les temps de doublement approximatifs ont été calculés en utilisant une régression linéaire. WT El Tor N16961 et El Tor variante MQ1795 ont démontré de...

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Discussion

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Parmi les plus de 200 V identifiés. Sérogroupes de cholerae , seuls O1 et O139 ont un potentiel épidémique. Le sérogroupe O1 peut être divisé en deux biotypes: classique et El Tor. Cependant, des souches hybrides, appelées les variantes 13 , 17 d' El Tor, ont émergé et possèdent les antécédents de biotype El Tor, et portent les caractéristiques classiques 8 , 9 ,

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Recherche soutenue par New Hampshire-INBRE grâce à un Prix de développement institutionnel (IDeA), P20GM103506, de l'Institut national des sciences médicales générales du NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Échelle d’ADN de 1 kbNew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60 % de glycérolCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson and Co.214030http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
gélose avec perfusion cerveau-cœurBecto, Dickinson and Co.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
AgarosePeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrus K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Plaques de géloseRemelR01200Conserver à 4 ° ; C ;  ; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Acide boriqueFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol BleuFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Acide cirtrique et middot ; H2OFisherScientific S72836-3Kit
de solution de désoxynucléotide https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 (dNTP)New England BiolabsN0446SMagasinez à -20 ° ; C ;  ; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
EDTA disodiqueFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
ADN propre & Concentrateur & commerce ; -25 KitZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Teinture d’acide nucléiqueBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS SpectrophotomètreThermo Scientific840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. KitQiagen158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HClFisher ScientificA144-212Corrosif;   ; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH< sub>2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4· ; 7H2OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Système d’électrophorèse horizontalBio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP BouillonDifco216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaClFisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3FisherScientific S233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4· ; 4H2OFisher ScientificS218-500
https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID NanoDrop Lite SpectrophtometerThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Lait écrémé en poudreNestlé CarnationN/A/A
PeptoneBecto, Dickinson and Co.211677http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
boîtes de Pétri (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Boîtes de Pétri (150 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875714https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Sel de sulfate de polymyxine BSigma-AldrichP1004-10MUConserver à 2-4 ° ; C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US
Taq ADN polyméraseNew England BiolabsM0273SMagasinez à -20 ° ; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Tampon de réactionNew England BiolabsM0273SMagasin à -20 ° ; C ;  ; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
thermocycleur Bio-Rad C1000 Touch&trade ;   ;Bio Rad Labs1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Chlorure de triphényltétrazoliumAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TryptoneBecto, Dickinson et Co.211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
extrait de levureBecto, Dickinson and Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
&alpha ;-naptholMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189
N

Références

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Caract risation du biotypecriblages g n tiques par PCRessais ph notypiquesr sistance la polymyxine Bessai de Voges Proskauerplaques de g lose de motilitconservation en stocks de glyc rolplaques de g lose LBprotocole de centrifugation

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