L'invention concerne un protocole pour déterminer les densités de phase vitreuse de gouttes de taille micro-à pico-litre de mélanges aqueux à des températures cryogéniques.
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Article de méthode
Mesurer les densités des verres aqueux aux températures cryogéniques
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous démontrons une méthode pour déterminer les densités de température cryogénique de la phase vitreuse des mélanges aqueux et d'autres échantillons nécessitant un refroidissement rapide, pour préparer la phase de température cryogénique souhaitée. Les gouttes de Microlitre à picolitre sont refroidies par projection dans un mélange liquide d'azote-argon (N2-Ar). La phase de température cryogénique de la goutte est évaluée à l'aide d'un essai visuel qui est en corrélation avec les mesures de diffraction des rayons X. La densité du mélange liquide de N 2 -Ar est ajustée en ajoutant N 2 ou Ar jusqu'à ce que la goutte soit neutre. La densité de ce mélange et donc de la goutte est déterminée à l'aide d'une masse d'essai et du principe d'Archimède. Avec les soins appropriés pour la préparation des gouttes, la gestion des gaz au-dessus du mélange liquide de cryogène pour minimiser le givrage et un mélange régulier du mélange cryogénique pour éviter la stratification de la densité et la séparation des phases, des densités précises jusqu'à <0,5% de gouttes aussi petites que 50 pL peuventFacilement déterminé. Les mesures sur les mélanges cryoprotecteurs aqueux donnent un aperçu de l'action des cryoprotecteurs et fournissent des données quantitatives pour faciliter la contraction thermique dans la cryoconservation biologique.
Introduction
Les propriétés physiques de l'eau et des mélanges aqueux dans leurs différentes phases sont d'un intérêt fondamental et sont importantes pour la compréhension in vivo et in vitro des systèmes biologiques. Dans la cryobiologie contemporaine et la cryoconservation biologique, les phases vitreuses ou amorphes des mélanges cryoprotecteurs aqueux présentent un intérêt particulier 1 , 2 . La nucléation et la croissance des cristaux de glace peuvent perturber les cellules et les tissus et favoriser la dénaturation et l'agrégation des protéines, de sorte que les protocoles de cryoconservation qui vitrifient le solvant sont devenus de plus en plus populaires. Dans la cristallographie biomoléculaire, la cristallisation du solvant dans les canaux entre les biomolécules perturbe les réseaux cristallins et dégrade les propriétés de diffraction. La vitrification s'effectue grâce à une combinaison de refroidissement rapide, de déshydratation et d'addition de solutés cryoprotecteurs tels que le glycérol, l'éthylène glycol, les polyéthylèneglycols (PEG)Les alcools et les sels.
La vitrification limite la cristallisation et la croissance de la glace, mais n'élimine pas tous les dégâts des échantillons liés au refroidissement. Par exemple, la mosaïque des cristaux (une mesure de la distribution des orientations du plan de cristaux) augmente régulièrement de 10 à 100 lorsque les cristaux de protéines sont refroidis dans un état vitrifié 3 et les taux de survie post-décongélation des spermatozoïdes et des ovocytes vitrifiés varient considérablement .
Un mécanisme de dégâts est la contraction différentielle du solvant et du matériau environnant pendant le refroidissement 3 , 4 , 5 . Les concentrations de solvant et de soluté à l'équilibre dans un cristal, une cellule ou un tissu dépendent de la température, et le solvant plus le soluté et le matériau environnant peuvent se contracter par des quantités différentes. Un refroidissement rapide peut empêcher la redistribution des solvants et des solutés avant la vitrification et le contraction différentielle Peut conduire à des contraintes de déséquilibre, non homogènes, qui causent des dommages à l'échantillon.
Les approches rationnelles pour réduire les dommages induits par le refroidissement pourraient ainsi bénéficier de la connaissance des densités dépendant de la température des mélanges aqueux liquides et vitrifiés. À des concentrations de soluté supérieures à 50% en poids de soluté en poids de solution (p / p), la plupart des mélanges de cryoprotecteurs aqueux peuvent être vitrifiés avec des taux de refroidissement modérés de 10 K / s ou moins, permettant une production et des mesures de densité à l'aide de grands échantillons de vitre 6 . La densité peut ensuite être déterminée en utilisant le principe d'Archimède, en mesurant le poids apparent de l'échantillon lorsqu'il est mis en suspension dans un cryogène liquide comme l'azote. Cependant, au fur et à mesure que la concentration de soluté diminue, les vitesses de refroidissement requises pour la vitrification augmentent rapidement: les taux de refroidissement des mélanges aqueux de glycérol augmentent de <10 K / s à 50% en poids de soluté en volume de solution en ml (p / v) à> 1 000 K / s à 25% p / vAss = "xref"> 7. Le transfert de chaleur devient limité à la couche limite, de sorte que l'obtention de plus grands taux de refroidissement nécessite des échantillons plus petits et plus petits 8 .
Des mesures de la densité de l'eau vitreuse pure et de la glace ont été réalisées en déposant des quantités de diamètre micrométrique (volume femtoliter) dans un vide sur une surface cryogénique afin de constituer un échantillon macroscopique (masse gramme). La densité de cet échantillon a été déterminée par cryoflotation dans un mélange azote-argon liquide, dans lequel la densité du liquide cryogénique a été ajustée jusqu'à ce que l'échantillon soit neutre 9 . Cependant, générer de gros échantillons à partir d'un grand nombre de petites gouttes d'une manière qui minimise les volumes de vide - une source importante d'erreur dans les mesures précédentes de la densité de la phase vitreuse - n'est pas trivial. Pour les mélanges aqueux, l'évaporation différentielle des composants de la solution pendant l'aérosolisation et le dépôt sous vide peut conduire àIncertitudes substantielles dans les concentrations déposées.
Nous avons développé une méthode, basée sur la cryoflotation, qui permet une détermination précise de la densité des mélanges aqueux en utilisant des gouttes individuelles aussi petites que 50 pL 10 . Ces gouttes peuvent être rapidement refroidies tout en conservant leurs concentrations initiales, et leur état de température cryogénique (vitrifié ou cristallin) peut être évalué à l'aide d'un test visuel simple qui est en corrélation avec les mesures de diffraction des rayons X. Cette méthode est largement applicable aux mélanges aqueux et non aqueux, et peut être étendue à une variété d'échantillons biologiques comprenant des cellules ( p . Ex . Tige et œuf), des échantillons de tissus et des cristaux de protéines ayant des densités à basse température comprises entre 0,8 et 1,4 g / Ml.
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Protocole
ATTENTION: Veuillez consulter toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de l'utilisation de gaz comprimés, y compris les régulateurs et soupapes de gestion de gaz calibrés appropriés, ainsi que des tubes à gaz approuvés. Le contact avec des cryogènes liquides peut provoquer des gelures sévères et une nécrose. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié (écran facial, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées), qui doivent être imperméables à l'azote liquide. Restez debout et assurez-vous un chemin de sortie dégagé de l'appareil lors de l'utilisation de cryogènes liquides. Soyez conscient des risques d'asphyxie lors de l'utilisation de gaz comprimés et de liquides liquides, et travaillez dans une zone bien ventilée avec un air de maquillage adéquat (une hotte aspirante ou une grande capacité de rotation de l'air).
1. Préparation de solutions aqueuses pour la mesure de la densité
REMARQUE: les poids étant plus faciles à mesurer avec une précision élevée que le volLes concentrations en solution sont mesurées en unités w / w. Toutes les densités et les températures de fusion ou d'ébullition prennent une pression atmosphérique de ~ 100 kPa. Les étapes suivantes décrivent la préparation d'une solution de glycerol à 35% p / p. La même procédure peut être utilisée pour d'autres concentrations et solutés.
- Pour chaque type de soluté et concentration d'intérêt, estimer approximativement la masse de soluté requise pour obtenir la concentration finale souhaitée ( p . Ex. , Entre 25% p / p et 100% p / p) pour un volume total de solution, V tot = 10 ml de volume de solution . Par exemple, pour une solution de glycérol à 35% p / p ( ρ s = 1,26 g / mL), la masse de soluté, m s est:
Où x est la fraction de masse de soluté (0,35) et ρ w = 1 g / mL est la densité d'eau. - Placer un tube de centrifugeuse de 15 mL (ou un autre récipient imperméable à l'eau calibré en volume) sur la poêleD'une microbalance analytique. Distribuer la masse souhaitée de soluté / cryoprotecteur ( p . Ex. , 3,77 g de glycérol pour une solution à 35% p / p) dans le tube et enregistrer la masse réelle de soluté.
- Ajouter de l'eau désionisée à haute pureté (> 18 MΩ) pour porter la masse totale jusqu'à 10,0 g
- Vortez le récipient pendant 30 s (pour les solutés liquides) ou 5 min (pour les solutés solides), jusqu'à ce que la solution soit optiquement homogène.
- Mesurez et enregistrez la masse finale de la solution. Sceller le récipient avec un capuchon hermétique et conserver à température constante (293-298 K).
2. Préparation de l'échantillon de la chambre de refroidissement
- Placez l'appareil expérimental décrit ci-dessous dans une enceinte et évacuez l'air sec (> 5% d'humidité relative (rh)) dans l'enceinte.
REMARQUE: L'enceinte peut être un cadre métallique simple avec son dessus et ses trois côtés scellés avec une feuille de plastique transparent et avec un accès expérimental via un quatrième côté recouvert d'une feuille de plastique souple. PorterLes boucliers faciaux et le recouvrement complet du corps pour minimiser l'humidité introduite par l'expérimentateur. La condensation de l'humidité et la formation de glace peuvent interférer avec les mesures cryogéniques de la densité de la température de plusieurs façons et doivent donc être minimisées. - Placez un disque de caoutchouc néoprène au fond d'un flacon de verre Dewar de 4,5 L pour protéger le flacon Dewar contre les dommages.
- Insérer avec précaution une chambre de cuivre haute conductivité thermique (un cylindre creux avec un fond scellé) dans le flacon jusqu'à ce qu'il repose sur le disque en caoutchouc. Ajustez les entretoises faisant saillie vers l'extérieur de la chambre vers les murs de Dewar afin que la chambre soit centrée et qu'elle n'ait aucune tendance à basculer.
REMARQUE: Le flacon de Dewar contiendra de l'azote liquide et la chambre de cuivre de volume beaucoup plus petite tiendra un mélange liquide de N 2- Ar. L'azote liquide fournit un bain thermal qui maintient la chambre de cuivre et son contenu à une température constante de 77 K et réduit les pertes d'ébullition et d'évaporation dans la chambre. La chambre&#Le petit diamètre supprime les ondes de surface qui peuvent interférer avec les mesures de flottabilité et aide à isoler le liquide à l'intérieur de la chambre contre la gelée et la glace formées ailleurs dans l'appareil. - Insérez la sortie d'un tube à gaz avec du N2 gaz sec qui coule à ~ 2 L / min jusqu'au fond de la chambre en cuivre et purgez la chambre d'air humide.
- Verser lentement de l'azote liquide dans le flacon de Dewar, à l'extérieur de la chambre de cuivre, en laissant passer l'ébullition de l'azote.
REMARQUE: Le niveau de remplissage final, après l'arrêt de l'ébullition, devrait être à environ 4 cm du haut de la chambre de cuivre. - Couvrir la partie extérieure du flacon Dewar avec un couvercle isolant en mousse annulaire. Retirer le tube de purge de gaz sec N 2 de la chambre en cuivre et l'insérer dans une ouverture correspondante dans le couvercle.
REMARQUE: La combinaison de gaz N 2 provenant de l'ébullition dans le flacon Dewar et de l'écoulement de purge évite tout air humide et l'empêche de se condenser et de cristalliserN surfaces froides. - Verser lentement de l'azote liquide dans la chambre de cuivre. Le niveau de remplissage final, après l'arrêt de l'ébullition, devrait être à environ 4 cm du haut de la chambre de cuivre.
- Placez une feuille de plastique mince, optiquement transparente sur l'ouverture centrale ou l'évent dans le couvercle, et réduisez le débit de gaz N 2 à ~ 0,2 L / min, laissant une légère surpression de gaz N 2 dans les espaces gazeux au-dessus des liquides cryogéniques.
REMARQUE: tant que les liquides cryogéniques sont présents dans le Dewar et la chambre, continuez à ajuster le débit de gaz N 2 comme nécessaire pour maintenir cette surpression et empêcher l'humidité d'entrer dans le Dewar et de former de la glace.
3. Détermination du volume et de la densité de la masse d'essai à T = 298 K et T = 77 K
- Déterminer la masse apparente d'une masse d'essai de PTFE de ~ 1 g, ~ 0,4 mL ( Table of Materials ) dans l'air à T = 298 K en le plaçant sur la casseroleD'une microbalance analytique calibrée.
- Déterminer le volume V (298 K) de la masse d'essai à T = 298 K en utilisant un pycnomètre à gaz, ou par des mesures dimensionnelles à l'aide d'étriers. Si vous utilisez des mesures dimensionnelles, la masse d'essai doit avoir une forme simple et précise (pas de coin ou de coins arrondis) et le volume du trou traversant (pour la ligne de suspension) doit être déterminé.
- Calculez la masse m de la masse d'essai en corrigeant la masse apparente mesurée pour la force de flottement exercée par l'air selon ce qui suit:
Où ρ air = 1,23 g / L (~ 0,1% de correction). - Placez la microbalance sur une plate-forme stable à environ 10 cm au-dessus du ballon Dewar et vérifiez son étalonnage. Suspendre la masse d'essai en utilisant une ligne de monofilament de 2 mille (50 μm) enfilée du crochet sur la face inférieure de la microbalance (conçue pour suspendre les mesures de masse) et à traversUn trou dans la masse d'essai. Déterminer la masse apparente dans l'air, et comparer avec la mesure à l'étape 3.3, en corrigeant au besoin pour la masse de la ligne.
- Déterminer le volume V (77 K) de la masse d'essai à T = 77 K en mesurant sa masse apparente dans l'azote liquide pur, m app dans LN2 . Abaisser la masse d'essai dans l'azote liquide dans la chambre de cuivre jusqu'à ce qu'il soit complètement immergé. Lorsque l'ébullition a cessé, mesurez la masse apparente.
REMARQUE: si l'azote liquide dans la chambre de cuivre est à l'arrêt et que les courants d'air entre la microbalance et la surface du liquide sont minimes, cette masse peut être mesurée à une précision supérieure à ± 0,0002 g. - Estimez la force de flottement sur la partie immergée de la ligne et vérifiez qu'elle est petite par rapport aux erreurs de mesure.
- Calculer le volume et la densité de la masse d'essai à 77 K en utilisant sa masse connue m et la masse apparente mesurée dans LN2 à 77 K, m app iN LN2, selon ce qui suit:
Où ρ LN2 ( (77 K) = 0,807 g / mL.
4. Préparation du mélange liquide initial N 2 -Ar
- Flow Ar gas à un débit de ~ 2 L / min à travers un tube enroulé vers sa sortie. Placez le tube enroulé sur les montants supérieurs qui stabilisent la position de la chambre de cuivre, juste au-dessus du niveau d'azote liquide et en dessous de la surface supérieure du Dewar. Le gaz Cold N 2 et Ar se développera au-dessus des liquides cryogéniques, et la conduction thermique, la convection et le rayonnement refroidiront le tube et le gaz Ar à l'intérieur.
- Après avoir laissé refroidir le tube enroulé pendant 5 minutes, placez la sortie du tube dans la chambre de cuivre, au moins à 10 cm sous la surface de l'azote liquide. Ensuite, couvrez le Dewar avec le couvercle annulaire et la feuille transparente.
- Réglez le débit Ar jusqu'à ce que les bulles Ar augmententDe la sortie du tube à la surface supérieure de l'azote liquide. Ensuite, réduisez le débit jusqu'à ce que les bulles se forment à la sortie mais se dissolvent ou se liquéfient juste avant de briser la surface de l'azote liquide.
REMARQUE: Lorsque la concentration d'Ar dans la chambre de cuivre augmente, ajustez périodiquement le débit d'Ar au besoin pour maintenir la formation de bulle. Si le débit Ar est trop bas, Ar peut congeler à l'intérieur du tube et bloquer le débit. - Ajouter l'azote liquide au besoin pour maintenir son niveau dans les environs de Dewar. Retirer la glace car elle s'accumule sur des surfaces froides.
- Mélangez périodiquement le liquide en insérant une feuille de cuivre mince ( par exemple , 35 microns) de coton attachée à une fine tige isolante dans la chambre en cuivre et en la remontant lentement comme un piston. Cela réduira les gradients de concentration et la tendance pour que Ar se cristallise hors de la solution.
5. Mesurer et ajuster la densité du mélange initial N 2 -ArTure
- Calculer la densité cible pour le mélange N 2- Ar en estimant la densité T = 77 K de l'échantillon à mesurer, par exemple , des mesures à des concentrations plus élevées du composant non aqueux de l'échantillon.
- Fixez la masse d'essai à l'aide de la ligne de monofilament sur le crochet sur le dessous du bac de mesure de microbalance, mesurez sa masse apparente dans l'air et confirmez l'accord avec la mesure à l'étape 3.1.
- Mélangez la solution N 2- Ar pour éliminer les gradients de concentration et de densité comme à l'étape 4.5.
- Pré-refroidir la masse d'essai à T = 77 K en l'abaissant dans l'azote liquide à l'extérieur de la chambre de cuivre. Augmenter la masse d'essai dans la couche froide d'azote gazeux au-dessus de l'azote liquide, attendre que l'azote liquide résiduel évapore la masse d'essai, puis abaisser la masse d'épreuve froide et sèche dans le mélange N 2- Ar jusqu'à ce qu'elle soit complètement immergée et À moins de 2 cm de la surface du liquide.
- Après que les ondes de bouillonnement et de surface ont disparu, mesurez la masse apparente de la masse d'essai. Calculez la densité de la solution en utilisant sa vraie masse m et T = 77 K volume V (77K) de l'étape 3.7 selon ce qui suit:
- Augmenter la densité de la solution en faisant couler Ar supplémentaire jusqu'à ce que la densité initiale souhaitée soit obtenue. Des gouttes d'échantillons qui peuvent être évacuées peuvent facilement être perdues, de sorte que la densité initiale devrait être d'au moins quelques pour cent supérieure à la densité d'échantillon attendue. L'échantillon flottera ensuite, ce qui facilitera son suivi, et la densité du mélange N 2- Ar devra alors être ajustée vers le bas en ajoutant du liquide N 2 .
- Retirez le tube enroulé pré-refroidissement Ar et laissez le réchauffer et le sécher avant l'utilisation suivante.
6. Gouttes de refroidissement de la solution d'échantillon
- Immédiatement avant la distribution et le refroidissement, répétez l'étape 1.5 à miX le liquide cryogénique azote / argon. Veillez à ne pas introduire de bulles.
- Retirez le capuchon hermétique du tube d'échantillon. À l'aide d'une seringue propre de 1 ml, extraire jusqu'à 1 ml de solution et remplacer le capuchon. Fixez une aiguille de 27 à 33 G sur la seringue, puis poussez une petite quantité d'échantillon dans l'aiguille pour expulser l'air et les résidus de la distribution précédente.
- Deux méthodes peuvent être utilisées pour projeter des gouttes d'échantillon dans le mélange N 2 -Ar.
- Pour les échantillons avec de grandes concentrations en composants non aqueux (> 45% p / p) qui peuvent être vitrifiés avec des vitesses de refroidissement modestes, appuyez légèrement sur la seringue pour déplacer un petit (250 μm à 1 mm) de diamètre, ~ 10 nL à 1 μL de goutte Qui s'accroche de la pointe de l'aiguille par une tension superficielle. Appuyez délicatement sur l'aiguille pour détacher et projeter la goutte vers le mélange liquide de N 2 -Ar.
- Pour les échantillons qui nécessitent un refroidissement plus rapide pour la vitrification, placez la sortie d'un tube à gaz raccordé à un générateur de videOu (fourni par l'air comprimé de laboratoire) dans l'espace de gaz au-dessus du mélange liquide de N 2 -Ar, et sucez doucement la couche de gaz froid qui se forme. Cela augmente les taux de refroidissement pour les petits échantillons 11 .
- Touchez soigneusement la pointe de l'aiguille sur une bande de polymère transparent de 25 à 75 μm d'épaisseur pour distribuer un petit volume (<10 nL, correspondant à un diamètre de goutte <200 μm) d'échantillon.
REMARQUE: Pour obtenir les gouttes les plus petites, les plus quasi sphériques et les plus facilement enlevées, tremper la bande dans une solution de revêtement hydrophobe pendant 10 min et laisser sécher avant la distribution de l'échantillon. - Prenez la bande en utilisant une tige en plastique ou en bois attachée, et plongez manuellement la tige plus la bande dans le mélange liquide de N 2 -Ar.
- Une fois que la goutte s'est solidifiée et que l'ébullition a cessé, saisissez le bord de la bande en face de la tige à l'aide d'une pince à épiler. Flexionnez la bande, en la maintenant immergée dans le liquide N 2 -Ar, jusqu'à ce que la goutte d'échantillon disparaisse et flotte vers le surfas.
- Touchez soigneusement la pointe de l'aiguille sur une bande de polymère transparent de 25 à 75 μm d'épaisseur pour distribuer un petit volume (<10 nL, correspondant à un diamètre de goutte <200 μm) d'échantillon.
7. Évaluation de l'état de l'échantillon
- À l'aide d'un microscope binoculaire de longue durée de travail (5-10 cm) et d'un éclairage lumineux et frais à partir d'un illuminateur à DEL ou à fibre optique, examinez attentivement la goutte tout en la maintenant immergée dans le liquide N 2 -Ar. Les gouttes vitrifiées devraient apparaître claires 12 , 13 . Rejeter les gouttes qui sont brumeuses ou nuageux (probablement contenant plus d'une phase) et / ou qui montrent des imperfections optiques, y compris des fissures (qui peuvent être associées à des vides qui changent la densité moyenne).
REMARQUE: La peinture de la surface intérieure de la chambre en cuivre pour fournir un fond noir peut faciliter l'identification des imperfections des échantillons.
8. Détermination de la densité de l'échantillon
- La goutte distribuée flottera initialement, évacue ou (rarement) sera neutre dans le mélange N 2 -Ar.Les gouttes flottantes peuvent parfois être maintenues par une tension superficielle, des bulles minuscules ou des particules de glace adhérentes. Inspectez la surface de chute entière au microscope. Déplacez la goutte vers le bas de la surface du liquide en utilisant une petite tige en bois ou en bois pré-refroidie (2-3 mm de diamètre, 10 cm de long) et observez sa réponse.
- Si la goutte coule, augmente la densité du liquide N 2 -Ar en utilisant la procédure à l'étape 4 jusqu'à ce que la goutte soit neutre ou flottante.
- Si la goutte flotte, diminuez la densité du liquide N 2 -Ar en ajoutant de l'azote liquide à l'aide d'un criovial de 1,8 ml. À de grandes densités de mélange initiales (1,2-1,3 g / mL), l'addition de N 2 dans des incréments de 1 ml donne des changements de densité appréciables, mais cela devrait être augmenté jusqu'à 5 mL à de faibles densités (0,8-0,9 g / mL). Mélangez doucement le N 2 -Ar (afin de ne pas perdre la trace de la chute d'échantillon) en utilisant la feuille de cuivre perforée mince vers le haut et vers le bas dans la chambre de cuivre.
- Après chaque addition N 2, Utilisez une petite tige pré-refroidie pour déplacer doucement la goutte flottante vers le bas dans le liquide et observer sa vitesse à mesure qu'elle revient sur la surface.
- Lorsque la densité de la solution a été ajustée de sorte que la goutte semble être neutre ou augmente très lentement (<50 μm / s assurera une précision de densité de 0,1% ou supérieure pour les gouttes avec des volumes jusqu'à 50 pL), mesurez le N 2 - Ar comme décrit à l'étape 5. Ensuite, ajoutez du liquide N 2 supplémentaire jusqu'à ce que la goutte commence à s'écrouler lentement et mesurez à nouveau la densité du mélange N 2 -Ar. Ces deux mesures fourniront des limites sur la densité de chute.
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Résultats
Les mesures de densité à T = 77 K pour des gouttes vitrifiées de glycérol aqueux et d'éthylène glycol par rapport à la concentration de cryoprotecteurs sont indiquées respectivement à la figure 1 A et à la figure 1 B et à la variation correspondante du volume spécifique entre T = 298 K et 77 K, calculée au préalable Déterminé T = 298 K densités, est montré à la
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Discussion
L'appareil et les méthodes actuels, développés principalement par les étudiants de premier cycle avec un accès limité aux outils et aux machines de construction d'instruments, offrent néanmoins des mesures de densité très précises pour des gouttes liquides individuelles aussi petites que 50 pL. Dans la plage de concentration proche et supérieure à 50% p / p, où de petites vitesses de refroidissement sont suffisantes pour obtenir des échantillons vitrifiés, les densités concordent avec celles obtenues lors de mes...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la NSF sous l'appellation MCB-1330685. DWM reconnaît le soutien partiel de la Subvention de formation en biophysique moléculaire de l'Université de Cornell (NIH T32GM0082567).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| tube à centrifuger | Falcon | 6029236 | 15 mL tube à centrifuger conique |
| glycérol, >99,5 % | Sigma ; | G9012-100 mL | |
| d’éthylène glycol, >99,8 % | Sigma | 324558-100 mL | |
| Mettler | AE240 | résolution de 0,01 mg, avec crochet sur le fond pour peser sous la balance. | |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Enceinte d’appareil encadrement | Unistrut ; | Charpente métallique de 1-5/8 » | 48 » de large x 24 » de profondeur x 40 » de hauteur ; |
| Appareil boîtier pare-air | toute feuille de plastique transparent | ||
| en caoutchouc | » de diamètre, 1/8 » | ||
| d’épaisseur flacon de dewar | Scilogix Dilvac | SS333 | 4,5 litres flacon de dewar avec boîtier en acier et couvercle à pince |
| chambre en cuivre | Cette pièce fabriquée est composée d’un tube en cuivre de 1,43 » de diamètre et d’une épaisseur de paroi de 0,017 » avec une base cylindrique solide en cuivre soudée pour sceller une extrémité. La base en cuivre mesure 0,87 » de haut et la hauteur totale de la chambre est de 7 ». | ||
| azote gazeux | Airgas | NI HP300 | 99,998 % pur N2 gaz |
| argon gaz | Airgas | AR HP300 | 99,998 % pur Ar |
| gaz rotamètre | Omega | FL3692ST | 2,52 L/min 2,52 L/min débit maximal |
| couvercle | Cette pièce est fabriquée à partir de mousse de polyéthylène réticulé de 4 lb/pi3 (fournie par Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), et a un diamètre extérieur de 2,42 », et un diamètre intérieur de 1,52 », et une épaisseur de 0,79 ». ; ; ; | ||
| Masse d’essai | Cette pièce fabriquée est un cylindre de 0,246 » de diamètre, 0,580 » de hauteur avec un trou de 0,060 » de diamètre perpendiculaire à l’axe du cylindre et le coupant à ~0,10 » d’une extrémité. | ||
| Plate-forme de microbalance | Unistrut | 1-5/8 » cadre métallique 11 » | de large x 24 » de long x 24 » de haut cadre rectangulaire avec une feuille d’aluminium supérieure contenant un trou pour le monofilament et une masse d’essai suspendue |
| Ligne monofilament de 2 mil (50 um) | Berkley | NF1502-CM | Ligne de pêche Nanofil |
| Tube de bobine de pré-refroidissement à l’argon | VWR | 60985-512 | Tube PVC |
| 1/8 » ID x 1/4 » ODMélangeur | 1,4 po de diamètre, disque de cuivre de 35 microns d’épaisseur, coupé à partir d’une feuille de cuivre de 1 once/pi2 et perforé avec des trous à l’aide d’un poinçon ou d’un autre outil pointu et tranchant. Insérez une tige rigide isolante thermique (plastique ou bois) de 1 à 2 mm de diamètre au centre et fixez-la à l’aide d’époxy si nécessaire. | ||
| seringue | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok embout seringue |
| générateur de vide | Gast | VG-015-00-00 | venturi à air comprimé générateur de vide mono-étagé |
| spray de revêtement hydrophobe | RainX | 620036 | plastique hydrofuge |
| longue focale stéréomicroscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0,67-4 x pod zoom avec oculaires 20X, distance de travail de 10 cm& nbsp ; | |
| Illuminateur annulaire LED | Amscope | LED144S | |
| Illuminateur spot LED | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W Lampe à pince à col de cygne LED |
| 1,8 ml flacon cryogénique | Nunc | V7634-500EA | N’importe quel flacon cryogénique de 1,8 ou 2 ml est adéquat |
Références
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
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