Article de méthode

Création d’un modèle de rongeur d’anévrisme de l’aorte abdominale en bloquant adventitiels Vasa Vasorum Perfusion

DOI :

10.3791/55763

⸱

8 novembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Hamamatsu University School of Medicine, 2Division of Vascular Surgery, Second Department of Surgery, Hamamatsu University School of Medicine, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Kindai University, 4Department of Organ & Tissue Anatomy, Hamamatsu University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insertion du cathéter en polyuréthane dans la lumière aortique et la ligature de l’aorte de suture induisent une hypoxie chronique en raison de l’hypoperfusion de l’adventitiels vasa vasorum. Cet article décrit un nouveau modèle animal d’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) présentant des caractéristiques semblables à celles de AAA chez les humains.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’adventitiels vasa vasorum (VV) fournit l’oxygène et nourriture à la paroi aortique. L’hypoxie dans la paroi aortique peut causer des anévrismes aortiques abdominaux élargies (AAAs). Cet article présente et décrit un protocole standard utilisé pour induire l’AAAs à travers l’hypoperfusion VV adventitiels créée avec une combinaison d’insertion du cathéter en polyuréthane dans la lumière aortique et ligature de suture de l’aorte abdominale de l’anévrisme.

Le protocole implique l’utilisation de rats mâles pesant 300-400 g, qui sont fournis de nourriture et eau ad libitum. Après laparotomie avec une incision abdominale médiane ventrale, exfoliation de l’aorte est effectuée, ce qui bloque la circulation sanguine dans les tissus périvasculaires. Aortotomy impliquant une petite incision adjacente aux branches de l’artère rénale est effectuée et un cathéter en polyuréthane est inséré à l’aide d’une aiguille de calibre 18 à demeure. Après avoir réparé l’incision, ligature serrée de l’aorte sur le cathéter bloque la circulation sanguine VV de la direction proximale à travers la paroi aortique sans déranger le flux de sang aortique. Cette technique peut induire un AAA avec dilatation aortique progressive.

Le plus grand avantage de ce modèle est que VV hypoperfusion provoque l’hypoxie tissulaire et l’élaboration d’une approche AAA, qui présente des caractéristiques morphologiques et pathologiques semblables à celles d’un humain AAA.

Introduction

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L’aorte abdominale est composée de trois couches suivantes : la paroi vasculaire interne (intima), la couche médiane (médias) et paroi vasculaire externe (adventice), et parmi ceux-ci, l’adventice a un sang unique alimentation système dénommé le vasa vasorum (VV). Le tissu aortique est fourni avec l’oxygène à travers la perfusion VV adventitiels et diffusion de l’oxygène simple dans le flux de sang aortique1. Toutefois, sur le plan géographique, l’aorte abdominale a la distribution moins de VVs comparativement à celle dans d’autres parties de l’aorte. 2

Une étude antérieure a signalé sur hypoxie tissulaire dans l’anévrisme de l’aorte abdominale humaine murs épais intraluminal thrombus (ILT)3(AAA). En outre, il a été démontré qu’un VV adventitiels en murs anévrysmal est obturé avec changements Artérioscléreux à un taux significativement plus élevé, qui est lié à l’hypoxie tissulaire dans les murs de AAA4. Basé sur ces résultats, un nouveau modèle de rongeur AAA a été créé par induction adventitiels VV hypoperfusion5. Dans ce modèle, VV hypoperfusion causé hypoxie tissulaire et l’élaboration d’une approche AAA, qui avait des caractéristiques morphologiques et pathologiques semblables à celles d’un humain AAA6. Exemples sont la présence d’ILT et l’accumulation d’adipocytes hyperplasiques6et le potentiel de causer la rupture7,8. Ces résultats ont été rarement observées dans les modèles précédents de rongeurs. Donc, ce modèle peut grandement contribuer à une meilleure compréhension du mécanisme responsable de la rupture et le développement de l’AAA. Nous introduisons et décrire un protocole standard utilisé pour induire l’AAAs à travers adventitiels VV hypoperfusion et nous expliquer comment induire l’hypoxie dans la paroi aortique à l’aide de techniques chirurgicales.

Protocole

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soin des animaux et des expériences ont été effectuées conformément aux directives de la Hamamatsu Université école de médecine Animal Care Committee au Centre pour la protection des animaux.

1. intervention chirurgicale pour créer le modèle

Remarque : Placez les instruments chirurgicaux dans un stérilisateur à billes pour 10 s avant l’opération. Utiliser des gants stériles manière.

  1. Rats mâles utilisation pesant de 300 à 400 g. les rats accès à la nourriture et eau ad libitum.
  2. Anesthésier le rat inhalation isoflurane (2,0 à 3,0 mL/L). Pour confirmer anesthetization bonne pincée orteil.
  3. Se raser les cheveux sur l’abdomen avec un rasoir électrique et frottez l’abdomen avec l’alcool et une solution de povidone-iode.
  4. Placer le rat en décubitus dorsal sur la table d’opération. Vétérinaire la pommade sur le rat ' yeux s à prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  5. Effectuer une laparotomie avec une incision abdominale médiane ventrale à l’aide d’une paire de ciseaux. Pour garantir un champ clair chirurgical, emballer le contenu abdominal à l’intérieur de la cavité abdominale avec de la gaze stérile à l’aide d’un écarteur de plaie.
  6. Pour détacher l’aorte du tissu périvasculaire, doucement ramasser et déchirer le rétropéritoine avec des pincettes pour exposer la paroi aortique et exfolier l’aorte d’anévrisme dans l’espace rétropéritonéal du niveau de la veine rénale gauche à la bifurcation de la tissu périvasculaire ( Figure 1 a).
  7. Ligate les vaisseaux ramification de l’aorte abdominale avec une chaîne de soie de 5-0 au sang de bloc d’alimentation à un endroit loin de l’aorte qui ne pas réduire la lumière aortique.
  8. Pour bloquer la circulation sanguine aortique, placer les clips vasculaires juste en dessous de l’artère rénale et juste au-dessus de la bifurcation de l’aorte.
    NOTE : La taille des clips doit être plus grande que le diamètre aortique pour bloquer le flux sanguin complètement. Un temporaire ligature soie 5-0 est également suffisante pour bloquer le débit sanguin au lieu des clips.
  9. Similaire à la création d’une hémorragie de points sur la surface de la paroi aortique, coupée la paroi aortique antérieure avec une micro-ciseaux de 5 mm dans la partie distale de l’agrafe aortique, adjacent aux branches de l’artère rénale, d’insérer un cathéter en polyuréthane.
  10. Insérer un cathéter en polyuréthane (diamètre 0. 55 mm, diamètre intérieur extérieur 0.37 mm) en utilisant un calibre 24 à demeure à aiguille superficiellement dans l’incision pour évacuer le sang dans l’aorte avec de l’eau. Administrer une seringue de 1 mL remplie d’eau dans le cathéter en polyuréthane et laver le sang restant dans l’aorte avec de l’eau. Après irrigation, retirer le cathéter de l’aorte.
  11. Avant d’insérer un cathéter en polyuréthane (diamètre 1. 20 mm, diamètre intérieur extérieur 0,94 mm) à l’aide d’une aiguille de calibre 18 à demeure, couper le cathéter en polyuréthane 10 mm de long ( Figure 1 b).
    1. Insérer la coupe totale du cathéter en polyuréthane dans la lumière aortique de l’incision effectuée à l’étape 1.9. Placer le cathéter de 10 mm dans la lumière aortique complètement et repositionner le point médian du cathéter pour correspondre à l’emplacement de l’incision (c'est-à-dire couvrir l’incision avec le cathéter).
  12. Réparer l’incision avec des sutures interrompus à l’aide d’une chaîne de monofilament de 8-0 ( Figure 1).
  13. Ligaturer l’aorte abdominale à l’aide d’une combinaison de 5-0 chaîne soie et le cathéter en polyuréthane ( Figure 1).
    NOTE : La lumière aortique peut être maintenue par le cathéter à demeure. Ligaturer l’aorte fermement pour éviter de faire la position du cathéter. Le chirurgien ' noeud s est recommandée, car elle ajoute une touche supplémentaire en attachant le premier lancer du noeud, formant un nœud de pêcheur double, et un tour supplémentaire fournit plus de friction et peut réduire les desserrant.
  14. Après la ligature, retirer le clip vasculaire à la bifurcation aortique et ensuite, enlever la pince vasculaire sous l’artère rénale pour restaurer le flux de sang antérograde. Confirmer les pulsations aortiques brute.
  15. Fermer l’incision abdominale en deux couches, le péritoine et autres couches, avec une suture en polypropylène de 4-0. Étroitement de suture l’incision pour empêcher un organe mini-reflex.
  16. Appliquer lidocaïne topique sur l’incision abdominale. Placez le rat sur un coussin chauffant jusqu’au retour de la conscience. N’abandonnez pas un rat jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Ne retournez pas un rat qui a subi une opération à la compagnie des autres rats jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré.
  17. Surveiller étroitement le rat après l’opération. Injecter un bolus de sérum physiologique (1,0 à 2,0 mL) par voie sous-cutanée, si un rat montre des signes de perte de poids de corps ou de la détresse.
  18. Après l’opération, observer le développement de l’évolution temporelle de l’aorte élargie sur un échogramme échographie. Mesure le diamètre maximal de l’intérieur edge vers le bord extérieur de l’aorte abdominale comme décrit 5.

2. Récolte, fixation et Elastica-van Gieson (EVG) coloration

  1. vingt-huit jours après l’opération, administrer le pentobarbital de sodium ≥ 100 mg/kg par voie intrapéritonéale pour euthanasier les rats.
  2. Fend le rat ' cavités abdominale s sur le ventre. Faire l’incision initiale à l’aide d’un scalpel. Récolter l’anévrisme à l’aide de ciseaux et de placer les aortes récoltés dans du formol 10 % neutre mis en mémoire tampon pendant 24-48 h
    Remarque : Le chirurgien doit être prudent prévenir les blessures lors de l’exposition de l’anévrisme à l’aorte et d’autres organes. Un organe abdominal élevé doit être observé, indiquant la formation AAA. la figure 2 illustre un in vivo et image ex vivo ; Cet échantillon représentatif d’AAAs n’est pas rompu.
  3. Coloration EVG 9
    1. Préparation de solutions
      1. Prepare Verhoeff ' hématoxyline s en mélangeant ce qui suit dans l’ordre indiqué : hématoxyline alcoolique 20 mL, chlorure ferrique 10 % 8,0 mL, et soluté iodo-ioduré ' iode s 8 mL. Mélanger la solution entre chaque addition. Cette solution peut être préparée fraîche comme nécessaire.
      2. Prepare Van Gieson ' solution s en mélangeant la fuchsine acide 1 % 1 mL et acide picrique saturé 45 mL. Laisser reposer toute la nuit et bien mélanger. Cette solution est stable pendant 2 semaines.
      3. Préparer la solution de différenciation (le chlorure ferrique 2 %) en mélangeant 10 % FeCl 3 10 mL dans 40 mL d’eau distillée. Cette solution peut être préparée fraîche comme nécessaire.
      4. Hypo 5 % Prepare en dissolvant du thiosulfate de sodium 5,0 g dans 100 mL d’eau distillée. Cette solution est stable pendant 1 an.
    2. Procédure de coloration
      Remarque : voir référence 9 pour plus de détails.
      1. Brièvement, hydrater les sections de paraffine fixe des aortes récoltés dans l’eau distillée pour 10 min. Placer les aortes de Verhoeff ' hématoxyline s pour 25 min. laver à l’eau et dip 10 à 30 fois en différenciant la solution (2 % FeCl 3). Rincer à l’eau. Placer à 5 % hypo pendant 1 min. laver à l’eau. Place en Van Gieson ' solution s pendant 5 min.
        2. Ordre
      2. Dehydrate dans de l’alcool dans ce qui suit : 75 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 % de l’alcool pendant 30 s de chaque. Puis, désactivez dans le xylène pendant 5 minutes, deux fois. Place sur un lamelle couvre-objet avec milieu de montage résineuse.
        Remarque : les fibres élastiques apparaissent bleu-noir au noir ; noyaux : bleu à blaCK ; collagène : rouge ; et d’autres éléments de tissu : jaune.

Résultats

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Les techniques opératoires décrits créer un nouveau modèle animal d’un Anévrysme aortique d’induite par l’hypoxie chronique en utilisant une combinaison d’insertion du cathéter en polyuréthane et la ligature de l’aorte abdominale de l’anévrisme de suture chez les rats. Les rats décrits dans la section protocole ont été euthanasiés à 28 jours après l’intervention. Les aortes ont été récoltées et imagés afin de visualiser la formation de l’anévrisme. La figure 2 illustre le développement de l’AAA fusiforme. Les extrémités supérieures et inférieures de l’aorte par ex vivo ont un diamètre normal sans dilatation. Les diamètres aortiques ont été mesurées à l’aide de l’échographie transabdominale (Figure 3). Le diamètre atteint généralement sa taille maximale à environ 14 jours après l’intervention ; par la suite, il reste inchangée ou augmente légèrement. La figure 4 montre l’image histopathologique de l’anévrisme à son diamètre maximal après coloration EVG. L’image du tissu sur 28 jours (anévrisme) a montré une dégradation importante des fibres élastiques par rapport à celle au jour 0.

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Figure 1 : Interventions chirurgicales afin d’induire un anévrisme de l’aorte abdominal (AAA).
(A) l’anévrisme aorte est exfoliée des tissus environnants. (B) un cathéter en polyuréthane coupe 10 mm de long est inséré par une petite incision dans l’aorte. (C) l’incision est réparée avec une suture de monofilament de 8-0 et la circulation sanguine est rétablie. (D) l’aorte est ligaturé avec une suture de soie de 5-0 sur le cathéter inséré. Echelle = 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Résultats représentatifs postopératoires.
Vue macroscopique du développement jour postopératoire 28 montrant des anévrismes de l’aorte abdominales fusiformes. La marge élevée du rétropéritoine correspond au bord extérieur de l’anévrisme (lignes brisées ; gauche). Les extrémités supérieures et inférieures de l’aorte par ex vivo sont normale (à droite). Echelle = 3 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Aortique diamètre diamètre maximal mesuré à l’aide de l’échographie transabdominale.
Le diamètre aortique a augmenté régulièrement dans ce modèle de rat. Les diamètres aortiques sont présentés comme un moyenne ± écart-type (n = 12). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Images représentatives du tissu anévrysmal Elastica van Gieson coloration.
Évaluation histologique avec EVG coloration montrant la lame élastique dégénérative dans les médias et la formation d’un thrombus intraluminal 28 jours après l’intervention (à droite). Fragmentation de la fibre élastique dans la média aortique et de fibre de collagène éparse dans l’adventitia aortique sont observées sur 28 jours. Jour 0 est avant l’intervention (à gauche). Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Dans des conditions physiologiques, les couches internes de la paroi aortique sont nourris par diffusion de l’écoulement de sang luminale, tandis que les couches extérieures et intermédiaires sont nourris par le VV, qui pénètrent de l’adventice dans la médiale VV1. Flux sanguin VV dans la paroi aortique abdominale peut provenir de trois directions/les suivantes : (1) la direction proximale à travers la paroi aortique, direction (2) distale à travers la paroi aortique et de tissus périvasculaires (3)10. Notre analyse histologique des tissus humains relevées précédemment, sténose significative ou une occlusion de la VV dans le mur de l’AAA, ce qui suggère que le flux sanguin VV dans la paroi aortique abdominale peut être réduite4. C’est un point extrêmement important dans le présent protocole qui un anévrisme AAA a été causé par une combinaison d’insertion du cathéter en polyuréthane et ligature de suture de l’aorte abdominale de l’anévrisme. Pour soigneusement exfolier la couche de tissu, chirurgiens doivent facilement insérer un cathéter en polyuréthane dans l’aorte et ligaturer solidement l’aorte pour provoquer une hypoxie chronique en raison de l’hypoperfusion de la formation de l’anévrisme et d’adventitiels VV. Utilisant ces techniques, la circulation sanguine dans la paroi aortique est donc diminuée, et un milieu hypoxique est induit. La réduction du débit sanguin et l’anévrisme induite par l’hypoxie formation indique que le débit sanguin dans la paroi aortique abdominale VV joue un rôle dans la pathogenèse de la formation de l’AAA.

Plus précisément, un modèle d’anévrisme de l’aorte doit satisfaire aux conditions suivantes : une augmentation de 1,5 fois le diamètre vasculaire par rapport au niveau de référence, dégénérescence des médias tunica et l’inflammation de la paroi aortique. Les plus populaire des modèles animaux ont été construits en induisant des réactions inflammatoires à l’aide de substances, telles que l’angiotensine II13CaCl211et élastase12. Ces modèles peuvent avoir une grande reproductibilité et évidemment causer des changements pathologiques, et ils ont été couramment utilisés dans les études de recherche. Dans notre modèle, nous avons évalué le diamètre aortique à l’aide de l’échographie tous les 7 jours d’avant que la procédure a été effectuée jusqu’au 28e jour après l’intervention (Figure 3). Les résultats ont montré que le diamètre aortique modérément augmenté au cours des 28 jours, ce qui indique que ce changement du diamètre est similaire à celle des précédents modèles de rongeurs. L’observation brute de la forme vasculaire indiqué une forme fusiforme lisse (Figure 2). Sur 28 jours, nous avons sacrifié les rats et effectué une analyse histopathologique du tissu aortique qui a été récupéré. Déchirement et la disparition des fibres élastiques et de collagène des médias de tunica et adventice ont été observés (Figure 4). En outre, des cellules inflammatoires, tels que les macrophages, étaient présents de l’adventice de la tunique pour les médias de tunica.

Actuellement, les options de traitement disponibles pour AAAs sont limitées à une réparation chirurgicale et le greffage des stent endovasculaire, avec les taux de mortalité de 30 à 50 % chez les patients atteints de rupture AAA14. Toutefois, aucun médicament n’a été approuvé pour l’usage clinique traiter l’AAAs. Il y a débat qu’il y a des différences dans les résultats pathologiques entre les humains et établi des modèles animaux utilisés en recherche de AAA. Similitudes dans la pathogenèse entre humain AAA et des modèles animaux de AAA sont essentiels pour le développement des traitements pharmacologiques. Au sujet de l’efficacité des modèles de rongeurs, notre modèle de rat est morphologiquement semblable aux humains en termes de5 et l’adipogenèse thrombus intraluminal8. En outre, environ 20 % des rats dans la présente étude avait rupture AAA et mourut dans les 28 jours après l’intervention. Bien que la rupture de l’anévrisme de l’aorte est l’événement le plus critique pour cette maladie, rupture est rare avec les modèles établis à AAA expérimentaux, et le mécanisme n’a pas encore été élucidé. Par conséquent, ce modèle est utile pour comprendre le mécanisme de la dilatation du diamètre aortique et de la rupture de l’anévrisme.

La création de ce modèle est nécessaire pour certaines interventions chirurgicales. Par conséquent, les chercheurs doivent pratiquer créer ce modèle, qui est une limitation de ce modèle. À l’avenir, nous aimerions créer un modèle de rongeur dans laquelle nous pouvons réduire le débit sanguin en épaississant progressivement les murs VV, résultant dans l’anévrisme de l’aorte spontanée.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par subventions pour scientifique recherche B (20291958) à l’unité naturelle ; Subventions pour les jeunes scientifiques (A) (25713024) à N.Z.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ratJapon SLC. IncSlc :SD ratSprague&ndash ; Dawley ratTM
povidone iode solutionLibatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 fil de soieAkiyama Medical MFG. CO., LTDJIS No.1
clips vasculairesNatsume Seisakusho Co., Ltd.C-42-S-2
(aiguille à demeure de calibre 24)MEDIKIT24GSupercath Z4VTM, cathéter en polyuréthane à aiguille à demeure de calibre 24
(aiguille à demeure de calibre 18)MEDIKIT18GSupercath Z3VTM, aiguille à demeure de calibre 18
Fil monofilament 8-0 Suture en polypropylèneEthiconSuture c-42-S-2PROLENE Suture en polypropylène, Réparer l’incision avec la suture
4987335 111457Cathéter en polyuréthane

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Hypoxie du tissu aortiqueInsertion de cath ter en polyur thaneTechnique de ligature par sutureMod le de rat d AAAProtocole de chirurgie vasculaireAnalyse histopathologiqueMesure par chographie ultrasonoreProc dure de coloration de Verhoeff

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