Dans ce protocole, "cage" protéine kinase A (PKA), un bioeffector de transduction du signal cellulaire, a été immobilisé sur une surface de nanoparticules, micro dans le cytosol et activé par l’upconvertis UV lumière par irradiation de proche infrarouge (NIR), induisant désintégration de fibre stress en aval dans le cytosol.
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Article de méthode
Un système intégré pour déclencher à distance Transduction de signaux intracellulaires par Photoactivation Kinase induite par l’Upconversion Nanoparticle
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nanoparticules de conversion ascendante (UCNP)-médiation photoactivation est une nouvelle approche de contrôle à distance des bioeffectors beaucoup moins phototoxicité et avec une pénétration plus profonde des tissus. Toutefois, les instruments existants sur le marché ne sont pas difficilement compatibles avec l’application de conversion ascendante. Par conséquent, modifier l’instrument disponible dans le commerce est essentiel pour cette recherche. Dans cet article, nous illustrons tout d’abord les modifications d’un fluorimètre conventionnel et le microscope à fluorescence pour les rendre compatibles pour des expériences de conversion ascendante de photon. Nous décrivons ensuite la synthèse d’un proche infrarouge (NIR)-a déclenché la sous-unité catalytique kinase A (PKA) de "cage" protéine immobilisé sur un complexe UCNP. On rapporte également les paramètres pour microinjection et procédures de photoactivation NIR. Après que la "cage" PKA-UCNP est microinjected dans les cellules de fibroblaste de REF52, l’irradiation de NIR, qui est nettement supérieure à une irradiation UV classique, déclenche efficacement la voie de transduction de signal PKA dans les cellules vivantes. En outre, les expériences positives et négatives de témoins confirment que la voie induite par la PKA menant à la désintégration des fibres de stress est spécifiquement déclenchée par une irradiation NIR. Ainsi, l’utilisation de protéines modifiées UCNP fournit une approche novatrice pour contrôler à distance les expériences cellulaires lumière modulée, dans lequel une exposition directe aux rayons ultraviolets doit être évitée.
Introduction
Modifiés chimiquement les protéines qui peuvent être photoactivées (par exemple, les protéines PKA en cage) ont été développés dans un domaine émergent en biologie chimique à manipuler non invasive des processus biochimiques intercellulaire1,2 ,3. En utilisant la lumière comme un stimulus offre une résolution spatio-temporelle excellente lors de l’activation de ces protéines mis en cage. Toutefois, lumière UV peut causer intempestif des changements morphologiques, l’apoptose et dommages à l’ADN de cellules4,5
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Protocole
Remarque : le protocole décrit une modification d’instrumentation détaillée de photoactivation upconversion assistée, une méthode de synthèse pour générer avec cage PKA-UCNP, microscopie électronique à transmission (TEM) de la UCNP enrobées de silice et mis en cage d’échantillons de PKA-UCNP, installation de photolyse UV et NIR, préparation de cellules, microinjection PKA-UCNP, une étude de photoactivation et la coloration de fibres de stress des cellules REF52.
1. fluorimètre Setup pour la mesure du spectre Upconversion
- installer un objectif 4 X à côté de la titulaire de la cuvette du spectromètre fluorescence afin que le laser....
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Résultats
La conception de la construction de la "cage" enzyme-UCNP est illustrée à la Figure 1. L’enzyme PKA a été tout d’abord réagir avec bromure de 2-nitrobenzyle pour générer un PKA inactif "cage", et il a été immobilisé puis électrostatiquement sur la surface du UCNP. UCNPs émettent de la lumière upconvertis et par conséquent photolyse cliver les groupes o-nitrobenzyle sur 199 Cys et 343 Cys, générant la PKA activé. Images TEM et analyse de Bradford a confirmé qu.......
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Discussion
Auparavant, Hofmann et ses collaborateurs ont trouvé que des changements morphologiques spectaculaires ont été observés dans les cellules de REF52 après la microinjection des PKA libre19. Dans une autre étude, le groupe de Lawrence a démontré que le PKA en cage peut être activé en vivo, conduisant à des changements morphologiques et la désintégration des fibres de stress lorsqu’ils sont soumis aux UV photolyse20. Rapports précédents sur l’exploitation de lumière po.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Nous remercions la Nano sciences et technologie Programme de l’Academia Sinica et le ministère des sciences et de technologie de Taiwan pour le financement (101-2113-M-001-001-MY2 ; 103-2113-M-001-028-MY2).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| réactif | |||
| Tris(hydroxyméthyl)aminométhane | Sigma | 154563 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Chlorure de sodium ; | Sigma | 31434 | |
| Chlorure de potassium | Sigma | 12636 | |
| Acétate d’yttrium ; hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · ; xH2O |
| Hydrate d’acétate de thulium(III) | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · ; xH2O |
| Acétate d’ytterbium(III) tétrahydraté | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · ; 4H2O |
| 1-Octadécène | Sigma | O806 | |
| Acide oléique | Sigma | 364525 | |
| Méthanol ; | macron | 304168 | |
| Hydroxyde de sodium | Sigma | 30620 | |
| Fluorure d’ammonium | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL ; CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Hydroxyde d’ammonium (28 % - 30 %) | J.T.Baker | 972101 | |
| Ammonia Tetraethyl Orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaléimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA réactif bloquant l’activité |
| Solution stabilisante protéique Prionex à partir de collagène porcin | Sigma | 81662 | Solution stabilisante protéique |
| Bromure de 2-nitrobenzyle (NBB) | Sigma | 107794 | PKA Réactif de cage |
| 8-(4-Chlorophénylthio)adénosine 3&prime ;,5&prime ;--Sel sodique monophosphate cyclique | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate kinase/Déshydrogénase lactique enzymes du muscle du lapin | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adénosine 5'-triphosphate disodique | Sigma | A2387 | ATP |
| &beta ;-NADH réduite à partir du dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoénolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Réactif d’analyse de la protéine, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Réactif d’essai Bradford |
| Protéine kinase dépendante de l’AMPc | Promega | V5161 | Contrôle de l’activité PKA |
| Plasmide pET15b-PKACAT | Addgene | #14921 | |
| Plasmide pKaede-MC1 | CoralHue | AM-V0012 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, glycémie élevée, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cellule milieu de culture |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Milieu de culture cellulaire |
| Sérum de veau fœtal | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldéhyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Colorant de coloration du noyau |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | Colorant colorant d’actine F |
| 5(6)-Carboxytétraméthylrhodamine ; | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Kit de dosage des protéines | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubulures/Puissance nominale du filtre MWCO 12 000 - 14 000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Membrane de dialyse |
| Millex-HV Unité de filtre pour seringue, 0,45 & micro ; m, PVDF, 13 mm, stérilisé aux rayons gamma | EMD Milipore | SLHVX13NL< | |
| strong>Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Microscope électronique à transmission | JEOL | JEM-1400 | |
| Spectrophotomètre à fluorescence | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse ; |
| Spectrophotomètre UV-Vis | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 ; |
| Microscope à fluorescence | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm filtre passe-long ; | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm miroir dichroïque passe-court | Chroma | NC265609 | |
| RT3 système CCD couleur | SPOT | RT2520 | |
| Éclairage par fluorescence | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Laser à diode infrarouge | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Source lumineuse | UVATA | UVATA-UPS412 | Avec une LED UPH-056-365 nm à 200 mW/cm2 |
| Capteur thermique à pile thermique | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Systèmes de distribution par micro-injection intracellulaire |
| PC-10 Extracteur d’aiguille | Narishige | PC-10 | |
| MANOMÈTRE Manomètre numérique | Lutron | PM-9100 | |
| Mono-axe Micromanipulateur hydraulique à huile | Narishige | MMO-220A | |
| Centrifugeuse Heraeus Fresco 17, réfrigérée | Thermo Scientific | 75002421 |
Références
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged"....
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Réimpressions et autorisations
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