Article de méthode

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

DOI :

10.3791/55794

⸱

14 juin 2017

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1School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The University of Hong Kong

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit un moyen d'enrichir les progéniteurs neuronaux de la population de cellules stromales de la moelle (MSC) et ensuite de les diriger vers le sort de la maladie de Schwann mûr. Nous avons soumis les MSC de rat et humains à des conditions hypoxiques transitoires (1% d'oxygène pendant 16 h), suivies d'une expansion sous forme de neurosphères sur un substrat à faible adhérence avec un supplément de facteur de croissance épidémique (EGF) / supplément de fibroblaste basique (bFGF). Les neuro-sphères ont été ensemencées sur du plastique de culture de tissu revêtu de poly-D-lysine / laminine et cultivées dans un cocktail gliogénique contenant la β-Hereguline, le bFGF et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour générer des cellules de type Schwann (SCLC). Les SCLC ont été dirigés vers l'engagement du devenir par coculture pendant 2 semaines avec des neurones de ganglions de racines dorsales purifiés (DRG) obtenus à partir de rats Sprague Dawley enceintes E14-15. Les cellules Schwann d'âge mûr démontrent une persistance dans l'expression de S100β / p75 et peuvent former des segments de myéline. Les cellules générées de cette manière ont un potentielPplications dans la transplantation de cellules autologues après une lésion de la moelle épinière, ainsi que dans la modélisation de la maladie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transplantation de progéniteurs neuronaux et leurs dérivés se révèle prometteuse en tant que stratégie de traitement suite à une lésion du nerf traumatique 1 , 2 et une neurodégénérescence 3 , 4 . Avant l'application clinique, il est essentiel d'assurer: i) une méthode pour accéder et développer une source autologue de cellules souches / progénitrices et ii) un moyen de les diriger vers des types de cellules adultes pertinents 3 . Notre intérêt pour la thérapie cellulaire pour la lésion de la moelle épinière nous a permis de rechercher une source cellulaire autologue robuste de progéniteurs neuronaux à partir de tissus adultes.

Une sous-population de MSC provient de la crête neurale et est facilement accessible à partir de la cavité de la moelle. Ces cellules sont des progéniteurs neuronaux qui peuvent générer des neurones et de la glie 5 . Les modèles animaux d'ischémie cérébrale démontrent que l'hypoxie favorise le prolapsus L'infiltration et la multiplicité des progéniteurs neurologiques dans le cerveau 6 . Ceci a servi de base à l'utilisation du préconditionnement hypoxique comme moyen d'expansion sur les progéniteurs neurologiques dérivés de la moelle.

La transplantation de cellules de Schwann dans la moelle épinière lésée favorise la régénération 2 . Les SCLC peuvent être générés à partir de MSC au moyen de suppléments avec des facteurs gliogéniques ( p. Ex., Β-Heregulin, bFGF et PDGF-AA) mais démontrent une instabilité phénotypique. Lors du retrait des facteurs de croissance, ils reviennent à un phénotype de type fibroblaste 7 . L'instabilité phénotypique est indésirable dans la transplantation cellulaire en raison du risque de différenciation aberrante et de carcinogenèse. Comme les précurseurs de cellules de Schwann sont associés à des faisceaux d'axones dans le nerf périphérique embryonnaire 8 , nous avons été conduits à des SCLC de coculture avec des neurones DRG embryonnaires purifiés 7 ,Ass = "xref"> 9. Les cellules Schwann matures résultantes sont engagées et démontrent une fonction in vitro 7 , 9 et 10 in vivo .

Notre protocole pour l'enrichissement des progéniteurs neuronaux des MSC est simple et efficace et entraîne une augmentation du nombre de cellules pour les tests ultérieurs. La dérivation des cellules Schwann engagées par le biais de la plate-forme coculture permet l'étude de la différenciation gliale et la génération de cellules Schwann stables et fonctionnelles pour une application clinique potentielle.

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Protocole

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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en stricte conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le Comité sur l'utilisation des animaux vivants pour l'enseignement et la recherche, la Faculté de médecine Li Ka Shing, l'Université de Hong Kong. Des échantillons humains de moelle osseuse ont été obtenus à partir de la crête iliaque de donneurs sains après avoir obtenu leur consentement éclairé. Les protocoles ont été approuvés par le Conseil d'examen institutionnel, l'Université de Hong Kong.

1. Préparation des cultures de rat MSC

  1. Récolte de CSM du fémur
    1. Autoclavez tous les outils de dissection ( p. Ex., Ciseaux à dissection fine , ciseaux à coupe oblique et pinces dentées) à 180 ° C pendant au moins 2 h avant utilisation.
    2. Préparer le milieu de croissance MSC comprenant une modification minimale du milieu essentiel - alpha (αMEM) complétée par 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et de pénicilline / streptomycine (P / S, 1% v / v).
    3. Sacrifiez les jeunes rats mâles Sprague Dawley (200-250 g de poids corporel) par overdose au pentobarbitone (240 mg / kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale).
      REMARQUE: Les prélèvements de moelle de différents rats doivent être traités séparément.
    4. Placez les animaux sacrifiés en position couchée. Nettoyez soigneusement leur abdomen et les membres inférieurs avec 70% d'éthanol.
    5. Retirez la peau et le tissu sous-cutané sur les cuisses médianes en utilisant des ciseaux et des pinces à dissection fine. Retirer les muscles de la cuisse circonférentiellement jusqu'à ce que le fémur soit exposé. Continuez ceci de manière proximale et distale jusqu'à ce que les articulations du genou et de la hanche soient observées. Désarticuler le fémur à travers l'articulation de la hanche et du genou en utilisant des ciseaux à coupe oblique.
      REMARQUE: Ne pas transposer le fémur pour exposer la cavité de la moelle à ce stade. Transférer les fémurs intacts dans un capuchon de culture de tissu à flux laminaire pour un traitement ultérieur.
    6. Utilisez des ciseaux à coupe oblique pour transposer les extrémités distale et proximale du fémur par la métaphyse.
    7. Placez un filtre cellulaire de 70 μm sur un tube conique de 50 ml. Insérez une seringue de 21 G, 10 mL contenant une solution salée tamponnée au phosphate (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) dans le canal fémoral exposé et rincer la teneur en moelle dans le tube conique par un rinçage répété.
      REMARQUE: Environ 20 ml de PBS sont utilisés pour éliminer chaque fémur. Si la couleur du contenu rincé reste colorée au sang et trouble, un volume plus important peut être utilisé.
    8. Recueillir les cellules par centrifugation à 480 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de croissance MSC. Placer les cellules sur un plat de culture tissulaire de 10 cm. Placer les plats de culture tissulaire dans un incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ). Enregistrez le jour initial du placage au jour 0.
      REMARQUE: Dans toutes les étapes de centrifugation, régler le frein pour une décélération maximale.
  2. Établissement et expansion des colonies MSC
    NOTE: Ce protocole estÉlimine l'adhérence plastique de la culture des tissus comme moyen de sélectionner des MSC dans la cavité de la moelle 11 . La teneur en moelle osseuse est autorisée à adhérer à la culture de culture tissulaire pendant 2 jours.
    1. Le jour 2, rincer les plaques de culture trois fois avec 10 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes. Remplacer le PBS avec 10 ml de milieu de croissance MSC après rinçage. Lavez les cellules avec du PBS et rallumez avec un milieu de croissance MSC tous les 3 jours.
      NOTE: Les colonies MSC devraient être visibles au jour 6-7 ( Figure 2A ).
    2. Passer les cellules au jour 10 en enlevant le milieu de croissance et en rinçant les cellules avec du PBS. Ajouter 1,5 ml de réactif de dissociation de cellules enzymatiques recombinantes et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 3 ml de milieu de croissance MSC pour neutraliser la réaction. Recueillir les cellules détachées par centrifugation à 250 xg pendant 5 min.
    3. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée dans du PBS.
    4. Cellules passées à la semence à une densité de 40 000 cellules / cm 2 dans une plaque de culture de 10 cm dans un milieu de croissance MSC.
      NOTE: Les MSC de rat doivent atteindre 80 à 90% de confluence dans les 2 jours suivant le passage ( figure 2B ). Les cellules peuvent être passées comme décrit à l'étape 1.2.2 pour jusqu'à 8 passages. Les MSC peuvent être caractérisés par l'immunocytochimie et leur capacité à la différenciation trilineuse ( figure 3 ) 12 . Seules les cultures MSC entre les passages 3 et 8 sont soumises au préconditionnement hypoxique et à l'enrichissement des progéniteurs neuronaux. Les MSC de plus grand nombre de passages adoptent une morphologie aplatie ( Figure 2C ) et ne produisent pas un nombre suffisant de progéniteurs neuronaux. Ces cultures devraient être abandonnées.

2. Préparation des cultures humaines BMSC

  1. Diluer 1 mL d'aspiration de moelle osseuse humaine avec 9 mL de milieu de croissance MSC et plaquer leCellules sur un plat de culture de tissu de 10 cm. Maintenir les cultures dans un incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ).
  2. Retirez le milieu après 2 jours et rincez doucement les cultures trois fois avec 10 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes. Après le rinçage final, retirer le PBS et le remplacer par 10 ml de milieu de croissance MSC. Remplacer le milieu de croissance après chaque 3 jours de culture après le rinçage PBS.
    NOTE: Les colonies MSC devraient être visibles au jour 6-7. Le nombre de colonies peut varier selon les sujets.
  3. Passer les cellules au jour 10, comme décrit à l'étape 1.2.2. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée dans du PBS. Graisser les cellules passées à une densité de 40 000 cellules / cm 2 sur une plaque de culture de 10 cm dans un milieu de croissance MSC.
    NOTE: Les MSC humains ( Figure 2D ) démontrent une morphologie similaire aux MSC de rat et devraient également atteindre 80 à 90% de confluence dans les 2 jours suivant le passage. Ils devraient être charaCtérite par immunocytochimie et leur capacité de différenciation trilineuse 12 . Comme pour les MSC de rat, les MSC humains qui se situent entre le passage 3 et le 8 sont soumis à un préconditionnement hypoxique et à un enrichissement de progéniteurs neuronaux.

3. Préconditionnement hypoxique

  1. Démonter les composants de la chambre d'hypoxie ( c.-à-d. Base, couvercle, plateaux) après avoir relâché la pince de l'anneau et essuyer les pièces individuelles à l'aide d'éthanol à 70%. Placez les composants de la chambre dans un capot de culture de tissu à flux laminaire pour la stérilisation sous la lumière UV pendant 15 minutes.
  2. Avant le préconditionnement hypoxique, enlever le milieu et rincer les cultures de rat et MSC humaines (sections 1 et 2) avec 10 mL de PBS. Remplacer le PBS avec 10 ml de milieu de croissance MSC complété par 25 mM d'HEPES.
    NOTE: Les MSC cultivés sur des plats de 10 cm devraient avoir atteint 80 à 90% de confluence avant d'être soumis à un préconditionnement hypoxique.
  3. Placez le culDans la chambre d'hypoxie. Remontez les composants de la chambre et serrez la pince de l'anneau. Rincer un mélange gazeux de 99% N 2 /1% O 2 dans la chambre à un débit de 10 L / min pendant 5 min.
  4. Sceller les extrémités de connexion de la chambre d'hypoxie pour s'assurer qu'il n'y a pas de fuite de gaz. Placer la chambre à l'intérieur de l'incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 16 h.
  5. Après achèvement du préconditionnement hypoxique, retirer les cultures de la chambre en prévision de la culture d'enrichissement des progéniteurs neuronaux.

4. Culture d'enrichissement de progéniteurs névralgiques

  1. Préparer le milieu progéniteur névralgique composé du milieu aigle modifié de Dulbecco / mélange nutritif de jambon F12 (DMEM / F12) complété par B27 (2% v / v), facteur de croissance de fibroblastes basique (bFGF, 20 ng / mL), facteur de croissance épidermique (EGF, 20 ng / mL) et P / S (1% v / v).
  2. Détacher le rat préconditionné hypoxique / MSC humain, comme décrit à l'étape 1.2.2.Recueillir les cellules détachées par centrifugation à 250 xg pendant 5 min. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée dans du PBS.
  3. Remettre en suspension les cellules dans le milieu progéniteur neural et les semences sur des plaques à faible collage, à 6 puits à une densité de 6 000 cellules / cm 2 . Placer la culture dans un incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 12 jours. Remplacer 75% du milieu progéniteur neural tous les 3 jours.
    REMARQUE: Des grappes de cellules non adhérentes importantes doivent être observées au jour 6-7. Au jour 10-12, on peut observer des neurosphères d'un diamètre ≥ 100 μm ( figure 4 ). Les MSC préconditionnés hypoxiques devraient produire plus de neurosphères par rapport aux MSC cultivés dans des conditions normoxiques 9 .
  4. Recueillir des neurosphères au jour 12 en les aspirant dans une pipette de 10 ml et en les transférant dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les neurosphères à 250 xg pendant 5 min.
    NOTE: Les neurosphères peuvent êtreCaractérisé le jour 12 pour les marqueurs de progéniteurs neuronaux, tels que le nestin et le GFAP 7 .

5. Génération de cellules Schwann commises par le destin par coculture avec DRG Neurones

  1. Préparation de neurones DRG de rat purifiés
    1. Autoclavez tous les outils de dissection ( p. Ex. Ciseaux à dissection, pinces, deux pince à microdissection et ciseaux à microdissection) à 180 ° C pendant au moins 2 h avant utilisation.
    2. Incorporer des plaques de culture tissulaire de 6 puits avec de la poly-D-lysine (PDL, 10 μg / mL dans PBS) à 4 ° C pendant la nuit. Retirer le PDL et rincer avec 1,5 ml de PBS par puits.
    3. Procéder au revêtement des plaques avec de la laminine (10 μg / mL dans PBS) à 37 ° C pendant 2 h. Rincer les plaques avec 1,5 ml de PBS par puits.
    4. Préparer le milieu de maintien des neurones DRG, composé de milieu neurobasal complété par B27 (2% v / v), L-glutamine (1% v / v), facteur de croissance nerveuse (NGF, 20 ng / mL) et P / S (1 % V / v).
    5. Préparer le milieu de purification des neurones DRG, composé de milieu neurobasal complété par B27 (2% v / v), L-glutamine (1%), NGF (20 ng / mL), P / S (1%), fluorodésoxyuridine (FDU, 10 Μg / mL) et de l'uridine (10 μg / mL).
    6. Sacrifiez des rats enceintes au jour de gestation 14-15 par overdose au pentobarbital (240 mg / kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale).
    7. Placez les animaux sacrifiés en position couchée. Nettoyez soigneusement leur abdomen avec 70% d'éthanol.
    8. Couper la paroi abdominale inférieure de l'animal longitudinalement à l'aide de ciseaux et de pinceaux à dissection fine. Identifiez et retirez l'utérus à l'aide de ciseaux à dissection. Couper le mur utérin pour exposer et extraire les embryons. Transférer les embryons dans un plat de culture stérile de 10 cm rempli de PBS. Placez le plat de culture sur de la glace.
    9. Transférer l'embryon destiné à la dissection dans un plat de culture stérile de 10 cm rempli de PBS (température ambiante) et le positionner sous un microscope à dissection. Avoir l'embryon en position vulnérable.
      NE PASE: La moelle épinette blanchâtre et les DRG attachés peuvent être vus sur l'aspect dorsal de l'embryon, à travers sa peau translucide.
    10. Insérez une pince à microdissection entre les deux côtés de la moelle épinière et utilisez une dissection émoussée pour commencer à séparer la moelle épinière des tissus mous environnants. Couper la moelle épinière sans l'animal en utilisant des pinces microdissantes le long de l'ouverture du cou et du talon de la queue. Effectuer une dissection brusque sur l'aspect ventral du cordon pour le libérer des tissus mous environnants.
    11. Utilisez un pince à microdissection pour éliminer les tissus mous résiduels sur l'aspect dorsal de la moelle épinière.
      REMARQUE: à ce stade, seule la moelle épinière, les racines nerveuses et le DRG attaché devraient rester.
    12. Détachez les DRG individuels de leurs racines nerveuses en utilisant des pince à microdissection. Utilisez un stylo à pipette attaché à une pointe de 1 ml pour transférer les DRG dans un tube de centrifugation stérile de 1,5 ml contenant du PBS.
      NOTE: Pour chaque tube de 1,5 mL, un maximum de100 DRG peuvent être logés.
    13. Centrifuger les DRG à 250 xg pendant 5 min et les réinstaller dans un réactif de dissociation des cellules enzymatiques recombinantes (200 μL par tube). Incuber (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 10 min. Centrifuger les DRG à 250 xg pendant 5 min, enlever le surnageant et ré-endiguer dans le milieu de maintenance des neurones DRG. Dissocier la pastille par trituration douce à l'aide d'une pointe de pipette de 200 μL. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée.
    14. Graisser les cellules à une densité de 5 000 cellules / cm 2 dans des plaques de 6 puits revêtues de PDL / laminine dans 1,5 ml de milieu de maintenance de neurone DRG par puits. Après deux jours de culture, retirer le milieu de maintien des neurones DRG, rincer avec du PBS et le remplacer par un milieu de purification des neurones DRG.
      NOTE: Pour chaque cycle de purification, traiter les cultures DRG avec un milieu de purification pendant 2 jours, suivi d'un jour d'incubation en milieu de maintenance. Après 3-4 cycles de purification, le remL'ovale de toute la glande endogène est attendue 7 . Cela devrait prendre environ 14 jours. Les cultures purifiées testent positivement le marqueur neuronal TUJ1 et sont absentes pour l'expression de S100β ( figure 5 ).
  2. Génération de cellules cellulaires de Schwann
    1. Préparer un milieu d'induction glial composé d'αMEM complété par β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%) et P / S (1% v / v).
    2. Placer les neurosphères préparées dans la section 4 dans des plaques à 6 puits revêtues de PDL / laminine à une densité de 5-10 sphères par cm 2 dans 1,5 ml de milieu d'induction gliale par puits. Remplacer le milieu d'induction gliale tous les 2 jours après le rinçage des cellules avec du PBS.
      NOTE: Les cellules provenant des neurosphères ensemencées sont migrées vers l'extérieur au jour 2. Au jour 7, les cellules migratrices ont un aspect effilé et devraient démontrer une immunopostivité pour la cellule de SchwannMarqueurs p75 neurotrophin récepteur (p75) et S100β 7 . Ces cellules sont appelées SCLC.
  3. Coculture de SCLC avec des neurones DRG
    1. Préparer un milieu de coculture composé de milieu de maintenance des neurones DRG (étape 5.1.4) et du milieu d'induction glial (étape 5.2.1) à un rapport volume / volume 1: 1.
    2. Préparer le milieu de maintenance cellulaire de Schwann composé de DMEM / F12 complété par FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / mL) et P / S (1% v / v).
    3. Enlever le milieu de culture des SCLC du jour 7, les rincer avec du PBS et les incuber avec 0,5 mL / puits de réactif de dissociation des cellules enzymatiques recombinantes à 37 ° C pendant 5 min. Resuspendre les SCLC en milieu coculture.
    4. Quantifier les cellules en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée.
    5. Graisser les SCLC sur des cultures de neurones DRG purifiés à une densité de 1000 cellules / cm 2 . Maintenir les coculures pendant 14 jours, avec un remplacement moyen tous les 2 jours.
      NOTE: Pendant la coculture, les SCLC ont acquis la morphologie de type fusible typique des cellules Schwann matures ( Figure 6 ). Ces cellules persistent dans leur phénotype après le retrait des facteurs de croissance et sont capables de myéliniser les axones in vitro et in vivo 7 , 10 . La positivité des marqueurs de cellules de Schwann (p75 et S100β) doit être surveillée par immunofluorescence.
    6. À la fin de la coculture, les cellules de Schwann commises par le destin du passage, comme décrit à l'étape 1.2.2. Utiliser 0,5 ml de réactif de dissociation par puits. Quantifier les cellules en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée.
    7. Réanimer les cellules Schwann engagées dans le milieu de maintenance cellulaire de Schwann à une densité de 10 000 cellules / cm 2 . Cellules de graines dans des plaques de 6 puits revêtues de PDL / laminine pour immunofluorescence.
      NOTE: Les cultures contiennent inévitablement des MSC qui ont adopté un fibroblasteDestin de la cellule 7 . Ces cellules sont passées ensemble avec des cellules Schwann engagées par le destin à la fin de la coculture. Les cellules de Schwann situées au-dessus de ce substrat de fibroblastes peuvent être facilement détachées et expansées suite au rinçage avec des «jets froids» de PBS (4 ° C), comme cela a été décrit ailleurs 13 . Les cellules Schwann engagées par le destin peuvent être développées en milieu de maintenance pendant 1 mois.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un aperçu des étapes clés de notre protocole est illustré à la figure 1 . En résumé, les MSC de rat et humains sont sélectionnés par adhérence au plastique de culture tissulaire. Les MSC élargis sont préconditionnés avec une hypoxie et sont ensuite soumis à des conditions de formation de la neurosphère. Les neuro-sphères sont plaquées et autorisées à se différencier en SCLC. Les SCLC sont cultivés avec des neurones DRG purifiés pour générer des cellules Schw...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il est essentiel de préserver la «tige» des MSC avant l'enrichissement des progéniteurs neuronaux par un préconditionnement hypoxique et une culture de la neurosphère. De notre expérience, les MSC multipotents peuvent être identifiés de manière fiable par leur morphologie allongée de type fibroblaste. En revanche, les MSC qui ont adopté une morphologie quadrangulaire plus aplatie, avec des fibres de stress cytosquelettiques proéminentes, n'admettent pas facilement le devenir des cellules neurales et devraient êt...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs de ce manuscrit n'ont aucune divulgation à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs souhaitent remercier le Dr Nai-Sum Wong d'avoir fourni l'appareil de chambre hypoxique et Mme Alice Lui pour le soutien technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
et alpha ; MEMSigmaaldrichM4526
DMEM/F12Thermofisher scientific12400-024
Milieu neurobasalThermofisher scientific21103-049
FBSBioseraFB-1280/500
B27Thermofisher scientific17504-001
Facteur de croissance épidermique (EGF)Thermofisher scientific
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)Peprotech100-18B/100UG
Facteur de croissance nerveuse (NGF)  ;MilliporeNC011
Facteur de croissance dérivé des plaquettes-AA (PDGF-AA)Peprotech100-13A
Heregulin beta-3, domaine EGF (&beta ;-Her)Millipore01-201
UridineSigmaaldrichU3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)SigmaaldrichF0503
Poly-D-lysine (PDL)SigmaaldrichP7886-1G
LamininThermofisher scientific23017015
GlutaMAXThermofisher scientific35050061
Pénicilline / streptomycine (P/S)Thermofisher Scientific15140-122
TrypLE ExpressThermofisher Scientific12604-013
Plaque de 10 cm pour cultureadhérenteTPP93100Utilisé pour la sélection des CSM par adhérence de la culture tissulaire
Plaque à 6 puits pour la culture adhérenteTPP92006Utilisé pour l’expansion des CSM après le passage
Plaque à 6 puits UltraLow pour la culture non adhérenteCorning3471Utilisé pour l’enrichissement neural des progéniteurs
CD90(Thy-1)BD Biosciences555593
CD73anti-humainBD Biosciences550256
anti-humain/rat STRO-1R& D SystemsMAB1038
laR& D SystemsMAB1259
anti-rat CD45BD Biosciences555480
anti-rat CD90(Thy-1)BD Biosciences554895
anti-rat CD73BD Biosciences551123
anti-rat nestinBD BiosciencesMAB1259
anti-rat CD45BD Biosciences554875
Anti-S100&beta ;DakoZ031101
Anti-p75MilliporeMAB5386
Anti-GFAPSigmaaldrichG3893
Anti-Classe III-bêta tubuline (Tuj-1)CovanceMMS-435P
Anti-Noyaux HumainsMilliporeMAB1281
Chambre d’hypoxieBillups-RothenbergMIC-101
HEPES tamponSigmaaldrichH4034-100G
PHG0313

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Cellules stromales de la moelle osseuseprog niteurs neurauxdiff renciation des cellules de Schwannculture de neurosph resganglions de la racine dorsaletechnique de co culturemilieu d induction glialeexpression de S100 b taformation de segments de my line

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