Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Résumé

L'établissement de circuits neuromusculaires fonctionnels repose sur des liens précis entre le développement des axones moteurs et les muscles cibles. Les neurones moteurs étendent les cônes de croissance pour naviguer selon des voies spécifiques en répondant à un grand nombre de repères d'axones qui émanent de l'environnement extracellulaire environnant. La reconnaissance de la cible de cône de croissance joue également un rôle critique dans la spécificité neuromusculaire. Ce travail présente un protocole standard d'immunohistochimie pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. Ce protocole comprend quelques étapes clés, y compris une procédure de génotypage, pour trier les embryons mutants désirés; Une procédure d'immunocoloration, pour marquer les embryons avec un anticorps fasciclin II (FasII); Et une procédure de dissection, pour générer des préparations en filets à partir d'embryons fixes. Les projections d'axones moteurs et les modèles musculaires dans la périphérie sont mieux mieux visualisés dans des préparations plates d'embryons en filets que dans whEmbryons montés à l'huile. Par conséquent, la préparation en filets d'embryons fixés colorés avec de l'anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes nécessaires à la détection des axones et à la reconnaissance des cibles des axones, et peut également être appliqué à la fois aux écrans génétiques de perte de fonction et de gain de fonction .

Introduction

Des liaisons précises et sélectives entre les axones moteurs et les muscles cibles pendant le développement embryonnaire sont essentielles pour la locomotion normale dans les larves de Drosophila . Le modèle embryonnaire de 30 fibres musculaires dans chacun des hémisogravages abdominaux A2-A7 est établi par étape 16 ¹ . Les 36 neurones moteurs qui sont générés dans le cordon nerveux ventral étendent leurs axones à la périphérie pour inerver les muscles cibles spécifiques ² . L'identification par voie axonale motrice et la reconnaissance des cibles peuvent être visualisées par immunohistochimie avec un antic....

Protocole

1. Préparation

1. Préparer 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une solution de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (PBT) en ajoutant 0,5 g de sérumalbumine bovine (BSA) et 0,5 ml de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (voir la Table des matières) à 500 ml de PBS 1X Et en remuant pendant au moins 30 minutes. Conserver à 4 ° C. Utiliser quand il s'agit relativement frais et conserver la solution dans une bouteille propre.
2. Faire 10 ml de paraformaldéhyde à 4% en ajoutant 2,5 ml de solution de paraformaldehyde stock à 16% et 1 ml de PBS 10x à 6,5 ml d'eau désionisée. Conserver à 4 ° C et utiliser dans une semaine.
   ATTENTIO....

Résultats

Les connexions précises entre les axones moteurs et les muscles cibles pendant le développement neuronal dépendent de la répulsion axon-axonique sélective et de la reconnaissance de cible à des points de choix spécifiques ⁴ . Chez Drosophila , la répulsion sélective entre les axones moteurs est en partie régie par l'action combinée des semaphorines de classe 1 et 2 (Semas), y compris Sema-1a, Sema-2a et Sema-2b ^{8 ,} <.......

Discussion

Les détails des défauts de guidage de l'axone motrice sont évalués plus rapidement et avec une meilleure précision par la préparation en filets d'embryons colorés au DAB que par microscopie confocale à balayage laser d'étiquettes fluorescentes. Par conséquent, la préparation en filets d'embryons fixés et colorés au 1D4 convient le mieux à la caractérisation fonctionnelle des molécules de guidage. Quatre grandes classes de repères d'orientation, y compris les netrins, les fentes, les demi-éthers (Sema.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol
16 % Paraformaldéhyde Solution	Ted Pella	18505
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S5886
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P5405
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	30435
Phosphate de sodium monobasique	Sigma-Aldrich	71500
Substrat X-Gal	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8266
Hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté	Sigma-Aldrich	P9387
Hexacyanoferrate de potassium(III)	Sigma-Aldrich	244023
Peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tétrachlorhydrate	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Plat de culture (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	Ceci est utilisé pour fabriquer une cage de bécher en plastique pour la collecte d’embryons.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII	Anticorps Études développementales Hybridoma	Bank 1D4 anti-Fasciclin II
Anticorps	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment de chèvre Anti-souris IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycérol	Sigma-Aldrich	G9012
Verre	de lame Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Seringue	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Aiguille en tungstène	Ted Pella	#27-11	Fil de tungstène, ø ; 0,13 mm/6,1 m (ø ;. 005"/20 pi)
Nutator (Mini twister)	KO de la science coréenne	. VS-96TWS	Alternativement, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)

Chèvre Anti-souris-HRP