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Article de méthode

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

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DOI :

10.3791/55832

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28 septembre 2017

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1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

Dans cet article

Résumé

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

Résumé

Le rythme circadien est un processus physiologique fondamentaux présent dans tous les organismes qui régule les processus biologiques allant de l’expression des gènes au comportement de sommeil. Chez les vertébrés, le rythme circadien est contrôlé par un oscillateur moléculaire qui fonctionne dans le noyau suprachiasmatique (YVERT ; stimulateur central) et des cellules individuelles comprenant les tissus plus périphériques. Plus important encore, la perturbation du rythme circadien par l’exposition à la lumière nuit, facteurs de stress environnementaux et/ou des substances toxiques est associée à un risque accru de maladies chroniques et le vieillissement. La capacité d’identifier les agents qui peuvent perturber les horloges biologiques centrales ou périphériques et qui peut prévenir ou atténuer les effets de désorganisation du rythme circadienne, a des implications importantes pour la prévention des maladies chroniques. Bien que les modèles de rongeurs peuvent servir à identifier les expositions et les agents qui induisent ou à prévenir ou atténuer les perturbations circadiennes, ces expériences nécessitent un grand nombre d’animaux. Des études in vivo aussi requièrent l’infrastructure et des ressources importantes et les chercheurs à travailler toute la nuit. Ainsi, il est un besoin urgent d’un type cellulaire appropriée en vitro système pour dépister les environnementales endocriniens circadiennes et exhausteurs de types de cellules de différents organes et états pathologiques. Nous avons construit un vecteur qui anime la transcription de la luciférase déstabilisé dans les cellules eucaryotes sous le contrôle du promoteur du gène humain des période 2 . Cette construction de rythme circadien journaliste était stablement transfectée dans des cellules épithéliales mammaires humaines et cellules circadienne journaliste sensible ont été sélectionnés pour développer le test de bioluminescence in vitro . Nous présentons ici un protocole détaillé afin d’établir et de valider le test. Nous fournissons plus amples détails pour preuve d’expériences de concept démontrant la capacité de notre essai in vitro à récapituler les effets in vivo de divers produits chimiques sur l’horloge biologique cellulaire. Les résultats indiquent que le test peut être adapté à une variété de types de cellules à l’écran pour les perturbateurs endocriniens environnementaux et exhausteurs chimiopréventif des horloges circadiennes.

Introduction

L’horloge circadienne réglemente un large éventail de processus biologiques de diurne expression des gènes dormir comportement dans un rythme prévisible avec une périodicité d’environ 24 h. épidémiologique études suggèrent fortement que les perturbations chroniques du rythme circadien rythme augmente le risque de cancer du sein et cancer de la prostate dans les travailleurs de quarts, y compris les infirmières et les équipages de vol1,2,3. Ces résultats sont corroborés par des études sur les rongeurs, ce qui démontre que l’exposition aux cycles de lumière nuit ou lumière de lumière constante, qui imitent l’incidence des tumeurs au décalage augmentation et accélère la croissance de tumeur4,5. Basé sur des données issues des études humaines et rongeurs, le Centre International de recherche sur le Cancer a classé travail par quarts comme un carcinogène humain probable (Type 2 a) en 2010,6.

Auparavant, nous avons démontré qu’une dose unique de cancérogène de la tumeur mammaire spécifique comme agent cancérigène, N- nitroso-N- méthylurée (NMU), perturbé l’expression circadienne des principaux gènes circadiens (CGs) (p. ex., période 2 , Per2) et plusieurs circadienne contrôlée par gènes (NGCC), y compris les principales lésions de l’ADN réactive et réparer les gènes (DDRR) dans la glande mammaire de la cible (mais pas dans le foie). Réinitialisation de plus, l’expression circadienne des gènes Per2 et DDRR vers la normale par un régime chemopreventive de diététique L-méthyl-sélénocystéine (MSC) a réduit l’incidence de tumeur de 63 %. Ces résultats ont été les premiers à montrer un lien mécaniste entre rythme circadien, cancérogenèse chimique et chimioprévention7,8. Exposition aux autres toxiques environnementaux semblent perturber circadienne gene expression in vivo est également associée à un risque accru de maladies environnementales9,10. Comprendre les mécanismes qui lient la désorganisation circadienne de substances toxiques environnementales et la pathogenèse peut conduire à des approches mécaniste de la prévention des maladies. Toutefois, des études visant à définir les interactions entre les expositions et rythme circadien sont généralement effectués in vivo. Un typique en vivo expérience étudie que l’impact sur le rythme circadien nécessite un grand nombre d’animaux, comme le contrôlent de tissus provenant d’au moins trois et trois animaux exposés doivent être prélevés tous les 3-4 h sur une période de 24 ou 48 h. Développement d’un système validé in vitro qui récapitule en vivo observations et mécanismes serait donc non seulement de réduire le nombre d’animaux nécessaires, mais également considérablement réduire coûts expérimentales et l’exigence qui les chercheurs travaillent en permanence sur une période de 24 à 48 h. En outre, un système validé in vitro pourrait servir pour le criblage à haut débit des composés et/ou des altérations génétiques qui influent sur le rythme circadien, ou sa réponse aux facteurs de stress environnementaux ou de substances toxiques. Par conséquent, la combinaison stratégique de modèles in vitro et in vivo et expériences sont nécessaires pour obtenir différents points de vue avec une orientation différente.

Chez les mammifères, les oscillateurs circadiens existent non seulement dans les neurones spécialisés du SCN, mais aussi dans les types de cellules plus périphériques. Ces horloges moléculaires sont semblables à ceux dans les lignées cellulaires établies des fibroblastes et primaire fibroblastes d’embryons ou d’animaux adultes ; Cependant, il y a un besoin de tissu modèles cellulaires spécifiques au type11. Par conséquent, les études traditionnelles de l’activité locomotrice dans vivo, YVERT explants ex vivo, et basés sur les cellules in vitro tests dans les cellules de fibroblaste immortalisées sont largement utilisés pour étudier les cellules autonomes défauts circadiennes. Cependant, il n’y a aucune preuve indiquant qu’un dosage de cellulaire des fibroblastes in vitro peut récapituler les mécanismes circadiennes et réponses présent dans les cellules des autres organes périphériques en vivo. Différents types de cellules peuvent avoir des profils distincts de DDRR, métabolisme des xénobiotiques et l’expression des gènes, et les liens entre la toxicité et l’expression des gènes circadiens peuvent être de type cellulaire spécifique et/ou modulé par différents paramètres physiologiques. En outre, oscillateurs circadiens dans des systèmes axés sur les fibroblastes n'ont pas été dûment évalués de réponses aux substances toxiques environnementaux, les facteurs de stress et les agents préventifs qui relient les expositions à des mécanismes de prévention et de développement de la maladie. Ainsi, il y a un besoin spécifique de type cellulaire facile, validés et in vitro des épreuves bioluminescence pour étudier l’orgue spécifique environnement circadienne des perturbateurs. Bien qu’une variété de modèles d’horloge cellulaire (par exemple, dans le foie, les kératinocytes, cellules adipeuses, ainsi une lignée de cellules d’ostéosarcome) ont été développés au cours des dernières années12,13,14, 15, l’essai décrit ici est le premier modèle d’horloge cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires et la première démonstration de récapituler en vivo réponses aux facteurs de stress environnementaux, substances toxiques, des médicaments et agents chimopréventifs.

Renilla luciférase (rLuc) et la luciférase firefly sont les protéines de monomère 30-61 kDa qui ne nécessitent pas de posttranslational de traitement à l’activité enzymatique et peuvent fonctionner comme un journaliste génétique dès sa traduction. Une fois que le substrat s’associe à l’enzyme luciférase, la réaction biochimique catalysée génère un éclair de lumière. Ainsi, les constructions de luciférase sont largement utilisées comme un gène expression journaliste système in vitro et in vivo. Toutefois, dans les études de rythme circadien, l’utilité du reporter de la luciférase est limitée par la demi-vie relativement longue de la protéine de la luciférase (T1/2 = 3,68 h) par rapport à la période (en particulier pour la courte période) pour les changements de rythme circadien gène expression ; Cependant, de nombreuses études au cours des années ont utilisé avec succès le gène de la luciférase dans le vecteur pGL3, indiquant que la luciférase rapidement dégradable n’est peut-être pas nécessaire pour la déclaration des rythmes circadiens, en particulier pour les rythmes avec une période plus longue, tels que 24h. Par conséquent, un plasmide de journaliste à l’aide de vecteur de la luciférase déstabilisé, pGL [Luc2Pcopié], qui contient des hPEST (une séquence de déstabilisation de protéine) a été développé, ce qui nous permet de l’utiliser comme un vecteur de rythme circadien reporter pour notre actuel in vitro test de bioluminescence. La protéine codée par Luc2P a une demi-vie beaucoup plus courte (T1/2 = 0,84 h) et donc, répond plus rapidement et avec une plus grande ampleur aux changements dans l’activité transcriptionnelle de type sauvage, j’aindicating qu’il peut être utilisé pour surveiller l’expression rythmique de la luciférase réglementé par le promoteur PER2 avec précision en temps réel16.

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Protocole

1. construction du PER2 promoteur conduit de déstabilisé de Luciferase Reporter vecteur

  1. acheter un sur mesure en pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vecteur contenant l’ADNc codant pour la rLuc et l’homme Fragment de promoteur PER2 (hPER2P, 941 bp) sur le site entre le Sac j’ai et Hind III dans les multiples de la région clonage 17.
  2. Couper le fragment de promoteur PER2 humain (hPER2P, 941 bp) hors du vecteur. Tampon d’enzyme de restriction
    1. Ajouter 2,5 µL, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vecteur et 1 µL de chaque des enzymes de restriction, Sac I (10 unité/µL) et Hind III (10 unité/µL), dans un DNA/RNA/nucléotides libres tubes de microcentrifuge. Ajouter l’eau ultrapure (10,5 µL) jusqu'à 25 µL et mélanger doucement par pipetage.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 90 min dans un bloc chauffant à.
    3. Exécuter l’intégralité du volume (25 µL) de la réaction de l’enzyme de restriction sur gel d’agarose de 0,7 % contenant 0,0001 % du bromure d’éthidium (EtBr) pour séparer le vecteur de la hPER2P.
      NOTE : Bromure d’éthidium, bromure de 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (numéro d’enregistrement CAS : 1239-45-8), est un liquide inodore rouge. C’est un agent intercalant qui est couramment utilisé comme un fluorescent tag (tache acide nucléique) en gel d’agarose et visible comme une couleur orange sous la lumière ultraviolette. Les risques éventuels d’effets mutagènes irréversibles sont survenus chez des animaux de laboratoire, bien qu’aucun des organismes réglementaires il catégorisé comme un cancérogène 18. Donc, nous avons récolté agarose utilisé gel et électrophorèse tampon contenant du bromure d’éthidium parmi les déchets de risque chimique et a demandé à Rutgers Environmental Health & sécurité (REHS) pour ramasser et d’éliminer en toute sécurité.
    4. , Couper un morceau de gel d’agarose contenant une bande de fluorescence du bromure d’éthidium à 941 bp et purifier les fragments de hPER2P partir du gel avec un kit d’extraction de gel ADN, suivi de quantification sur un spectrophotomètre en mesurant la densité de l’absorption (do) à longueur d’onde de 260 nm.
  3. Linéariser 1,0 µL (1 µg) du vecteur d’expression luciférase firefly déstabilisé, pGL [Luc2P / Neo] avec la même méthode que décrite dans les étapes 1.2.1-1.2.2. Extraire le vecteur avec un kit de nettoyage ADN suivi de quantification comme décrit ci-dessus à l’aide d’un spectrophotomètre.
  4. Ligaturer le hPER2P dans la pGL vecteur linéarisé [Luc2P / Neo].
    NOTE : par le fabricant ' instruction de s, le rapport molaire idéal d’insertion et de vecteur est 2:1. Pour 50 vecteur ng, la quantité idéale de l’insert est calculée comme 23,6 ng avec un formule, vecteur de Ko [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242] x (1/2) = 23,6 ng insert]. Basé sur les concentrations de hPER2P (7,26 ng/µL) et pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), les volumes de 50 ng pGL [Luc2P / Neo] et 23,6 ng hPER2P sont calculées en 1 µL à 3,26 µL, respectivement. Réaction de
    1. Ajouter 2 µL T4 DNA ligase tampon (10 X) (Tris-HCl 50 mM, 10 mM MgCl 2, ATP 1 mM et 10 mM DTT), 3,26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], et 13.74 µL d’eau jusqu'à 20 µL , mélanger doucement.
    2. Ajouter ligase d’ADN T4 1 µL (400 unité/µL), mélanger doucement et laisser incuber à 16 ° C durant la nuit dans un thermocycleur et puis réfrigérer le vecteur ligaturé sur glace par le fabricant ' instruction de s.
  5. Transformer le pGL ligaturé vecteur [hPer2P / Luc2P / Neo] chimiquement compétent e. coli 19.
    1. Mettre le bain d’eau à 42 ° C, réchauffer de Super bouillon optimale avec support (S.O.C.) la répression catabolique (2 % Tryptone, 0,5 %, extrait de levure, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 et 20 mM de glucose) à température ambiante , s’échauffer Luria-Bertani (LB) Gélose (contenant 100 µg/mL ampicilline, 80 µg/mL X-gal et 0,5 µM IPTG) dans incubateur à 37 ° C et dégel sur glace un flacon d' compétent e. coli cellules pour chaque transformation.
    2. Ajouter 6 µL (21 ng) ligaturé vecteur ou 1 µL (30 ng) vider le vecteur (témoin négatif) dans une éprouvette de chimiquement compétent e. coli (50 µL) et puis doucement retourner le tube pour mélanger. Incuber sur glace pendant 30 min.
    3. Chauffer le choc dans un bain-marie à 42 ° C pendant 30 s sans agitation et puis retour à Ice.
  6. Choisir une colonie d’e. coli transformée avec un vecteur ligaturé à l’aide de dépistage bleu/blanc.
    1. Ajouter 250 µL O.S.C. de milieu dans le transformé e. coli tube et il incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
    2. Répartir 10-50 µL de transformé e. coli sur la surface de la gélose LB. Mettre la plaque à l’envers dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
      Remarque : Une réaction efficace de clonage devrait produire plusieurs colonies de centaines. Deux volumes différents de placage est recommandé pour s’assurer qu’au moins une plaque aura grand, clair blanc ou bleu et colonies bien espacées. Lorsque les colonies sont trop petits et la couleur ne se distingue pas, à l’aide d’un microscope (10 X ou 50 X) est utile.
    3. Pick 3-6 colonies blanches des plaques avec des bâtons de dent stérilisé et libérer chaque colonie en tube à une culture contenant 4 mL de milieu de culture LB avec de l’ampicilline 50 µg/mL.
    4. Incuber les tubes à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min pendant la nuit. Extraire l’ADN à l’aide de 2 mL de 4 mL de la culture d’e. coli avec un plasmide DNA extraction mini préparation kit par le fabricant ' instruction s.
  7. Vérifier et analyser l’insert (hPER2P, 941 bp)
    1. digérer l’ADN de plasmide avec des enzymes de restriction et exécutez électrophorèse comme décrit dans les étapes 1.2.1-1.2.3 pour confirmer s’il y a un encart.
      Remarque : Contrôle positif (hPER2P purifié à l’étape 1.2.4) et le contrôle négatif (Escherichia coli transformé avec un vecteur vide) ont été incluses.
    2. Séquencer l’ADN de plasmide sélectionnés à l’aide de M13 forward et M13 reverse amorces pour confirmer l’orientation et la séquence de l’insert dans le plasmide 19.
      Remarque : Seule colonie qui avait un encart avec la bonne taille de hPER2P en électrophorèse et une orientation correcte et la séquence dans le résultat de séquençage a été sélectionnée.
    3. Analyser le fragment de promoteur PER2 humain (hPER2P, 941 bp) séquence pour les éléments de régulation circadiennes, y compris le motif de l’armoire (site de la liaison Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, boîte de GC et transcription démarrer le site (CAGCGG) 20.
  8. Amplifier la certains e. coli en ajoutant le reste 2 mL cultivé e. coli dans 200 mL LB milieu de culture contenant 50 ampicilline µg/mL et ensuite l’incubation pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min.
  9. ADN extrait avec un maxi de plasmide exempte d’endotoxine prép. kit par le fabricant ' instruction de s et ensuite de le quantifier en mesurant OD à longueur d’onde de 260 nm avec un spectrophotomètre. Aliquote et stocker l’ADN de plasmide, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], au congélateur-80 ° C pour une utilisation future.

2. Transfection transitoire

  1. achat et de la culture de cellules MCF10A
    1. achat une immortalisées, non transformées normal mammaire épithéliale lignée cellulaire humaine (MCF10A) d’un commercial Banque de cellules, où les cellules sont cytogénétiquement testé et authentifié avec court répété en tandem analyse avant la congélation. Décongeler et maintenir chaque flacon de cellules congelées dans la culture pour un maximum de 8 semaines.
      Remarque : Contrairement aux autres cellules, ces cellules ont une inhibition de contact une fois qu’ils arrivent à la confluence d’environ 70 %. Elle exige cette sous-culture se déroule à environ 70 %.
    2. Culture des cellules avec milieu de culture de cellules épithéliales mammaires (MEGM), contenant le milieu basal épithélial mammaire (MEBM), les suppléments de croissance et la toxine cholérique dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO 2.
      NOTE : Acheter prêt à l’emploi des facteurs de croissance fournies dans SingleQuot (SQ) et obtenir la toxine cholérique séparément. La concentration finale de suppléments de croissance est extrait pituitaire bovine de 0,4 %, 0,1 % d’insuline, hydrocortisone de 0,1 %, 0,1 % des facteurs de croissance épidermiques humains, 100 ng/mL de toxine de choléra et 0,05 % sulfate de gentamicine et 0.05 % amphotéricine B.
    3. Se dissocient les cellules de 10 cm de Petri par incubation avec 10 mL de trypsine/EDTA pour ~ 20 min et puis neutraliser la trypsine en ajoutant la trypsine 10 mL, solution de neutralisation. Recueillir toutes les cellules avec HEPES tamponnée de solution saline (HBSS).
    4. Compter les cellules avec un hémocytomètre sous un microscope inversé et calculer la concentration de la suspension cellulaire unique graine puis un certain nombre de cellules que nécessaire. Agiter les plaques soigneusement pour obtenir une répartition uniforme des cellules dans chaque assiette. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO 2.
      Remarque : Acheter un pack de réactif de sous-culture contenant la trypsine/EDTA, solution neutralisante de la trypsine et HBSS utiliser.
  2. Transfection transitoire des cellules avec le vecteur circadiens construit.
    1. Graines 2 x 10 5 MCF10A cellules uniformément dans la culture de 35 mm plat avec MEGM et poussent à la confluence de 20 à 30 % (le lendemain).
      2. Médias sérum
    2. warm up réduites (par exemple, Opti-MEM) à 37 ° C eau bain et transfection réactif à température ambiante pendant 30 min. diluer le plasmid DNA construit (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) à 30 ng/µL avec endo-toxine gratuite Tampon Tris-EDTA (TE) et gardez à température ambiante.
    3. Préparer le mélange de transfection de plasmide dans un tube de microtubes de 1,5 mL par ajout de médias de sérum réduit chaud 63,6 µL tout d’abord, puis en ajoutant 33,4 µL (0,1 µg) ADN plasmidique et mélanger doucement en pipettant également, puis enfin 3 µL de transfection réactif directement dans le centre du tube sans toucher le mur. Après le mélange doucement en pipettant également, conserver à température ambiante pendant 30 min.
    4. Déposer le mélange de plasmide entier (100 µL) directement sur la surface du centre du milieu de la plaque, puis mélanger doucement en agitant le plat. La culture des cellules dans un incubateur à CO 2 pour supplémentaire 48-72 h.
      Remarque : Il est prédit que la plus grande efficacité de transfection serait au confluent de 40 à 70 % de ces cellules en raison de leur inhibition de contact à ~ 70 %. Par conséquent, transfection fonctionne mieux à partir de ~ 20 % et s’arrêter à ~ 70 % confluent.

3. Mise en place de l’essai de Bioluminescence In Vitro dans les cellules de MCF10A à transfectées transitoirement

  1. affamer les cellules cultivées à confluence d’environ 70 % (après la transfection pendant 48 à 72 h) pour MEBM sans facteurs de croissance pendant 24 h.
  2. Traiter les cellules avec l’agent de synchronisation (par exemple, 50 % de sérum de cheval (HS)) en MEBM pour 1,5 h dans un incubateur à CO 2.
    Remarque : Pour la sélection d’un agent de synchronisation idéale, 10 µM forskoline, 1 nM mélatonine, dexaméthasone 0.1 µM, 50 % HS et 100 % SQ ont été comparées en termes d’amplitude circadienne et période dans les cellules de rythme circadien vecteur transfectée. Vecteur vide transfecté des cellules sont traitées avec 100 % SQ comme témoin négatif.
  3. Pre-prepare 20 mL support (pour 10 sur les récipients de culture de 30 mm) en ajoutant 5 mL de MEGM, 15 mL de MEBM, 150 µL de bicarbonate de sodium, 200 µL HEPES et luciférine de 40 µL de solution (50 mM) dans un tube à centrifuger 50 mL stérilisé mère.
    Remarque : Les concentrations finales de chaque composants : 20 % SQ et 20 ng/mL de toxine de choléra, bicarbonate de sodium 0,06 %, 1 % pénicilline/streptomycine et 10 mM HEPES. Faire chauffer préalablement préparés, support d’enregistrement et stérilisé 1 x PBS pendant 30 min au bain-marie à 37 ° C. Ajouter 100 luciférine µM immédiatement avant l’emploi.
  4. Laver les cellules avec chaud 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) pour 3 fois après l’incubation avec l’agent de synchronisation et puis ajouter 2 mL de support d’enregistrement.
  5. Joint le plat avec une classe de couverture stérilisé à l’aide de graisse silicone pour éviter l’évaporation et l’étiquette puis sur le côté.
  6. Placer la capsule scellée dans le siège à l’intérieur le luminomètre et activez l’option pour enregistrer l’emplacement du fichier dans le dossier (pour le détail, voir la section 6).

4. Sélection de manière stable des cellules transfectées

  1. optimiser une concentration idéale de G418 (800 µg/mL) avec un test de courbe de tuer selon le fabricant ' instruction de s pour la sélection des cellules transfectées stablement.
  2. Après transfection transitoire pendant 48 h ou 72 h, sous-culture et graines les cellules avec MEGM dans les plus grands plats à 5 000 cellules/plat (100 mm). Après 24h, la culture dans l’incubateur de culture cellulaire (37 ° C, humidité de 95 % et 5 % CO 2), traiter les cellules avec 800 µg/mL de G418 en remplaçant le milieu ancien par nouveau média contenant 800 µg/mL G418 tous les 3-4 jours pour 2 semaines.
  3. Sous-culture survivant stablement transfected colonies pour 1 à 3 passages avec MEGM contenant 500µg/mL G418 à maintenir l’expression stable d’hPer2P/Luc2P et congélation dans l’azote liquide pour une utilisation future.
  4. Traiter 500µg/mL G418 après une sous-culture générale à sélectionner à nouveau la population stablement transfectée des cellules, si l’intensité de bioluminescence dans le résultat de l’essai in vitro bioluminescence avec diminue progressivement après utilisation dans nombreux passages.

5. Traitement avec des produits chimiques

  1. à 48 h ou 72 h après la transfection, mourir de faim les cellules de facteurs de croissance dans MEBM pendant 24 h.
  2. Après la synchronisation avec 50 % HS pendant 2 h, traiter les cellules avec 0,25 ou 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM dans MEBM contenant 20 % pendant 1 heure SQ.
  3. Après le lavage avec 1 x D-PBS, ajouter enregistrement moyen contenant 12,5 µM MSC, seuls ou en combinaison avec 20 nM EX527 ou cambinol de 1 µM, aux cellules. Surveillance de la bioluminescence avec le luminomètre.
  4. Traiter les MCF10A stablement transfectées / PER2-dLuc cellules avec NMU à 0,5, 1 ou 2 mM, EX527 à 40 nM, ou Cambinol à 2,0 µM, pendant 1 h après la synchronisation avec 50 % HS et puis incuber les cellules dans l’enregistrement moyen contenant 12,5 µM du SMC ou différentes doses (5, 10 ou 20 µM) de n-acétylcystéine (NAC). Placer les plaques dans le luminomètre, enregistrement et enregistrez la bioluminescence par luminomètre pour 4-8 jours tel que décrit à la section 3.6.
    NOTE : NMU est une nitrosourée méthylée composée ayant des propriétés mutagènes, tératogènes et cancérigènes. NMU est un agent alkylant action directe et a une demi-vie courte (T 1/2 = ~ 30 min). Il est stable dans des conditions acides (pH 4-5), mais instable, dans des conditions alcalines (pH 9 et 10) et à des températures au-delà de 20 ° C. Par conséquent, eau de Javel à 10 % peut être utilisé comme un agent désactivant efficace pour le nettoyage des surfaces de banc et de marchandises de laboratoire potentiellement contaminées par NMU solutisur. Solution mère reste est ramassés et éliminée en toute sécurité par REHS. Selon le mode d’action des produits chimiques, cellules synchrones peuvent être traitées pour des temps plus courts avant mise en culture dans un support d’enregistrement. Les cellules peuvent également être traitées dans le support d’enregistrement pendant une longue période (plusieurs jours).

6. Collecte de données, analyse et présentation

Remarque : la viabilité cellulaire doit être déterminée à l’aide de méthodes standard (par exemple, le test MTT) après traitement des cellules aux mêmes concentrations pour les mêmes délais indiqués. Toutes les concentrations de traitement utilisées dans le test de bioluminescence in vitro étaient inférieures à la concentration létale de 30 % (LC30). Toutes les expériences ont été menées en trois exemplaires et ont été présentés les résultats représentatifs.

  1. Après avoir scellé le plat (étape 3.5), charger la vaisselle sur les sièges dans le luminomètre, qui est conservé à l’intérieur d’un incubateur à 37 ° C sans H 2 O et CO 2 et connecté à un ordinateur.
  2. Click " enregistrer " et entrez le nom du dossier et le dossier où sera enregistré le signal enregistré luminescence de la capsule correspondante.
    Remarque : Le système détecte le signal de luminescence en temps réel à partir des cellules dans le plat à différentes positions. Les signaux sont transférées vers l’ordinateur par le biais de comptage de photons-4 tubes photomultiplicateurs et enregistrés et affichés par le logiciel de collecte de données dans l’ordinateur.
  3. Analyser les signaux après avoir enregistré pendant 4 à 7 jours, ce qui pourrait être suivie de changement médiatique et d’enregistrement continu pour une deuxième semaine si nécessaire.
    Remarque : Pour obtenir les paramètres circadiennes, y compris la phase, la longueur de la période, amplitude de rythme et d’amortissement taux, nous avons utilisé le logiciel d’analyse luminomètre pour analyser les données de bioluminescence.
  4. Detrend données brutes avec une moyenne en cours d’exécution et d’analyser le meilleur-s’adapte à une sinusoïde pour obtenir la période, phase, amplitude et amortissement taux 21 , 22.
  5. En raison de la bioluminescence transitoire haute sur le traitement et le changement moyen, exclure le premier cycle de données analyse.
  6. Pour la présentation des données, tracer des données brutes (bioluminescence, comte/s) contre la montre (h ou journée). Lorsque cela est nécessaire, soustraite à la base de données peuvent être tracées à comparer l’amplitude et la phase.

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Résultats

Vecteur de journaliste circadienne bioluminescence : PER2 pilotée par le promoteur l’expression humaine de la variante de la luciférase déstabilisé

La séquence d’ADN contenant un fragment de bp 941 dérivé du promoteur PER2 humain utilisé pour construire le vecteur journaliste circadienne, pGL [hPer2P/Luc2Pcopié, a été tout d’abord analysé la présence d’éléments régulateurs connus pour réguler exp...

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Discussion

Dans les cellules de mammifères, périodicité de l’horloge circadienne est régulée par des boucles de rétroaction transcriptionnelle/translationnelle interconnectés. Hétérodimères de Bmal1 et horloge ou Npas2 réglementer circadienne transcription en se liant à des éléments d’armoire dans les promoteurs de base CGs, y compris nombreux NGCC4 Per2 et cri. Comme ils s’accumulent dans la cellule, hétérodimères de par : cri sont sera modifié et transportés vers le noyau pour réprimer l’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la société de toxicologie du 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant pour la recherche alternative (M. Fang) et la recherche de collaboration internationale fonds de Animal and Plant quarantaine Agency, République de Corée (M. Fang), et accorde le du NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nous tenons à remercier le Dr Zheng Chen (McGovern Medical School de l’Université du Texas Health Science Center à Houston) pour son exposé utile, M. Juan de Shao-An pour son aide expérimentale et Mme Kimi Nakata pour sa relecture.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
vecteur pLS[hPER2P/rLuc/Puro] SwitchGearGenomicsS700000vecteur personnalisé
pGL4.18[Luc2P/Neo] vecteurPromega9PIE673vecteur d’expression de la luciférase déstabilisée
T4 ADN ligaseInvitrogen15224041Pour le sous-clonage
TOPO TA kit de clonageInvitrogenK4500-02avec One Shot TOP10 E. coli chimiquement compétent
Sac INew England BioLabsR0156SEnzyme de restriction
Hind III-HFNew England BioLabsR3104SEnzyme de restriction
CutSmart bufferNew England BioLabsB7204STampon d’enzyme de restriction
Kit d’extraction de gel d’ADNQiagen28704Purifier les fragments d’ADN du gel d’agarose
Kit de purification PCRQiagen28104Nettoyage de l’ADN
LB Miller’s modificationTEKNOVAL8600Pour la culture transformée d’E. Coli
LB Agar PlateTEKNOVAL1902Pour la sélection blanc/bleu
QIAprep spin miniprep KitQiagen27104Pour l’extraction de l’ADN du plasmide
EndoFree Maxi prep KitQiagen12362Pour l’extraction de l’ADN du plasmide
FuGene HDPromegaE2311Réactif de transfection
Opti-MEM milieu sérique réduitInvitrogen31985-062Pour la transfection
Lignée cellulaire MCF10AAmerican Type Culture CollectionCRL-10317Cellules épithéliales mammaires
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Milieu de croissance épithéliale mammaire
MEBMLonzaCC-3151Épithélial mammaire Basal moyen
MEGM SingleQuot KitLonzaCC-4136Suppliments & Facteurs de croissance
ReagentPackLonzaCC-5034Réactif pour sous-culture
D-PBS (10X)SigmaD1408Laver les cellules dans les boîtes de culture
Eau distillée ultra-pureInvitrogen10977Diluer 10X D-PBS
Boîte de culture tissulaire (35 mm)BD/Falcon353001boîte de culture cellulaire adaptée à la graisse au
siliconeLumiCycle FisherNC9044707Pour le scellement de la boîte avec le support d’enregistrement
Verre de couverture rondHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Pour le scellement de la boîte avec le milieu d’enregistrement
Toxine cholériqueSigmaC8052Supplément pour milieu de croissance
G418 sulfate (Geniticin)Invitrogen10131035Antibiotique pour la sélection des cellules transfectées en statique
AmpicillineSigmaA9393Pour la sélection des colonies
ForskolineSigmaF6886Agent de synchronisation
MélatonineSigmaM5250Agent de synchronisation
DexaméthasoneSigmaD4902Agent de synchronisation
Sérum de chevalSigmaH1138Agent de synchronisation
d-Luciférine, sel de sodiumInvitrogenL2912Substrat de la luciférase
IC261Sigma10658Contrôle positif pour le perturbateur circadien
Méthylnitrosourée (NMU)SigmaN1517Cancérogène spécifique du mammifère
Méthylsélénocystéine (MSC)SigmaM6680Sélénium organique (agent chimiopréventif)
EX527SigmaE7034Inhibiteur spécifique de SIRT1
CambinolSigmaC0494SIRT1 & Inhibiteur de SIRT2
Spectrophotomètre NanoDropThermo ScientificNanoDrop 8000Quantifier le nucléotide
GeneAmp PCR System 9700Applied BiosystemsN805-0200Pour l’expérience de biologie moléculaire
Incubateur de CO2NAPCOSeries 8000 DHPour la culture cellulaire à 5 % de CO2 à 37 ° ; C
Centrifugeuse de bureau avec réfrigérantEppendorf5430RPour l’expérience de biologie moléculaire
Centrifugeuse avec godet oscillantEppendorf5810 RPour la culture cellulaire
Microscope inverséNikon80124Contraste de phase en option
Capot de culture tissulaireLabconcoClasse II A2Certifié BSL-2
LumiCycle 32ActimétrieNon disponibleDétecteur de luminosité

Références

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