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Évaluations neurocomportementales dans un modèle murin de lésion cérébrale hypoxique-ischémique néonatale

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DOI :

10.3791/55838

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24 novembre 2017

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1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

Dans cet article

Résumé

Nous avons effectué une occlusion unilatérale de l’artère carotide jour postnatal 7-10 CD-1 chiots pour créer un modèle de (HI) hypoxique-ischémique neonatal de souris et ont étudié les effets des lésions cérébrales HI. Nous avons étudié les fonctions neurocomportementales chez ces souris par rapport à des souris normales non exploités.

Résumé

Nous avons effectué une occlusion unilatérale de l’artère carotide sur souris CD-1 pour créer un modèle de (HI) hypoxique-ischémique néonatal et étudié les effets d’une lésion cérébrale néonatale HI en étudiant les fonctions neurocomportementales chez ces souris par rapport à non exploitées (c.-à-d., souris normales). Au cours de l’étude, méthode de riz-Vannucci a été utilisé pour induire des lésions cérébrales HI néonatale chez les souris (P7-10) 7-10 jours après la naissance. L’opération de HI a été effectuée sur les chiots par ligature de l’artère carotidienne unilatérale et l’exposition à l’hypoxie (8 % O2 et 92 % N2 pendant 90 min). Une semaine après l’opération, le cerveau endommagé ont été évalué à le œil nu à travers le crâne semi-transparente et ont été classé en sous-groupes selon l’absence (groupe « aucune lésion corticale ») ou la présence (groupe « lésion corticale ») de lésions corticales, comme une lésion dans l’hémisphère droit. Semaine 6, les tests neurocomportementaux suivants ont été réalisés afin d’évaluer les fonctions cognitives et motrices : échelle (PAT), de tâche évitement passif marche test et test de force de préhension. Ces tests comportementaux sont utiles pour déterminer les effets d’une lésion cérébrale néonatale HI et sont utilisés dans les autres modèles murins de maladies neurodégénératives. Dans cette étude, souris néonatales de la lésion du cerveau HI a montré des déficits moteurs qui correspondaient aux dommages de l’hémisphère droit. Les résultats des tests comportementaux sont pertinentes pour les déficits observés chez des patients humains de HI néonatales, telles que la paralysie cérébrale ou AVC néonatal. Dans cette étude, un modèle de souris d’une lésion cérébrale néonatale HI a été établi et a montré les différents degrés de déficits moteurs et cognitifs par rapport aux souris non exploités. Cet ouvrage fournit des informations de base sur le modèle de souris de HI. Images d’IRM montrent les différents phénotypes, séparés selon la gravité des lésions cérébrales par des épreuves motrices et cognitives.

Introduction

Une lésion cérébrale néonatale HI se produit au cours de la petite enfance (environ deux patients pour 1 000 enfants)1,2,3,4,5. Études concernant une lésion cérébrale néonatale HI sont importantes, et en utilisant un établi néonatale HI cerveau lésions souris modèle peut faciliter en vivo recherche préclinique sur les lésions cérébrales HI.

Les modèles traditionnels de HI sont utilisés sur des rats adultes6. Pour le modèle de nouveau-né, la méthode Rice-Vannucci est communément utilisée sur P7 rats7,8. Toutefois, étant donné que les rats et les souris sont légèrement différents9,10, même s’ils sont les deux rongeurs, nous avons réalisé une méthode modifiée de riz-Vannucci sur CD-1 chiots à P7-10, basé sur des études antérieures qui montraient que la période est de P7-10 mettant en vedette oligodendrocytes immatures, correspondant à peine humaine P011,12. Le modèle de souris néonatal HI est établi par les deux la ligature de l’artère carotidienne unilatérale et l’exposition des souris à une hypoxie avec 8 % d’oxygène en P7-10 chiots.

Les souris soumis à la procédure ont montré divers degrés de lésions cérébrales dans la région postéro-latérales de l’hémisphère droit. Pour identifier les déficits cognitifs et moteurs, les évaluations neurocomportementales que se fondant sur la PAT, échelle marche test et test de force de préhension ont été effectuée. Les différences entre souris HI non exploitées (c.-à-d., normale) et ont été analysés. Cet ouvrage présente des informations de base sur le modèle de souris de HI. Les images d’IRM montrent les différents phénotypes, séparés selon la gravité des dommages de cerveau à l’aide de tests de moteurs et cognitifs.

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Protocole

Tous les animaux étaient logés dans une cage standard (27 × 22,5 × 14 cm3) dans un établissement accrédité par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation du laboratoire Animal Care (AAALAC) et donné la nourriture et l’eau ad libitum en vertu de l’alternance lumière/obscurité de 12 h cycles. Les auteurs ont suivi des règlements de protection des animaux, et les procédures expérimentales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Yonsei University College of Medicine (IACUC no 2010-0252 ; 2013-0220).

1. souris modèles de lésion cérébrale néonatale HI

  1. Anesthésier les chiots à l’isoflurane.
    1. Placer les chiots (moins de 5) dans une boîte anesthésier et refermer le couvercle.
    2. Allumez le système anesthésiant pendant environ 15 min ; ajuster le gaz et l’isoflurane utilisant une machine anesthésie haut de tableau. Ajuster le débitmètre oxygène à 1,5 L/min. ajuster le vaporisateur isoflurane à 3-5 % pour l’induction de l’anesthésie.
    3. Après 15 min, ajuster le vaporisateur isoflurane à 1-2 % pour le maintien de l’anesthésie.
  2. Posez un chiot totalement anesthésié sous un microscope à dissection (face à la chercheure de l’abdomen) et fixez-le avec du ruban adhésif.
  3. Faire une incision de ~0.7-mm dans le cou à l’aide de ciseaux stérilisés.
  4. Retirez le tissu adipeux à l’aide de forceps stérilisé soigneusement et exposer l’unilatérale de l’artère carotide droite.
  5. Ligaturer l’unilatérale de l’artère carotide droite avec une suture résorbable 5-0.
  6. Suture de l’incision au niveau du cou avec suture de 5-0.
  7. Placer chaque chiot en chambre hypoxique tiède 37 ° C pendant 1 h pour la récupération. Ne pas fermer le couvercle de la chambre.
  8. 1 h après la chirurgie, lorsque les chiots sont tout à fait réveillés, fermer le couvercle de chambre hypoxie et diminuer les niveaux de gaz afin d’établir des conditions d’hypoxie (8 % O2 et 92 % N2).
  9. Après 90 min d’hypoxie, retourner les chiots à leurs cages.
  10. Une semaine après la lésion cérébrale HI, répétez l’étape 1.
    1. Après l’anesthésie, faites une incision dans le cuir chevelu avec des ciseaux stérilisés et forceps pour identifier la lésion du cerveau dans la région postéro-latérales de l’hémisphère droit.
      Remarque : Ce traitement induit une hypoxie chez les chiots. La présence et l’étendue des lésions cérébrales chez toutes les souris est évaluée visuellement à le œil nu à travers le crâne semi transparent. Tel que déterminé par la taille ou le volume de la décoloration (c.-à-d., la lésion du cerveau), les chiots sont classés en groupes. S’il n’y a aucune lésion corticale visible, la souris est classée dans le groupe « aucune lésion corticale ». S’il y a une lésion corticale visible (c'est-à-dire, une lésion à l’hémisphère droit), la souris est classée dans le groupe « lésion corticale ». Classification des souris en groupes est effectuée une semaine après l’opération, les groupes peuvent être modifiés lorsque les morphologies des échantillons de cerveau sont clairement définies au moment du sacrifice1,2,3, 4.

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Figure 1 : Modélisation des blessures de cerveau HI néonatale chez les souris.
(A) un chiot de souris âgées de sept jours a été opéré, et l’artère carotide droite unilatérale a été ligaturé. (B) les chiots ont été placés dans une chambre hypoxique pendant 90 min avec 8 % O2 et 92 % N2. (C, D et E) Le cerveau néonatal blessure HI a montré divers gravité des dégâts et ont été classé selon le degré de dommages. À la semaine 14, les cerveaux ont été obtenues, et les lésions ont été visualisées. (C) Image d’un cerveau classé comme une « aucune lésion corticale ». Les deux (D) et (E) ont été classés dans le groupe « lésion corticale ». (F, G et H) MRI représentatif de (C), (D) et les souris (E), respectivement. (F) les dommages à l’hippocampe sont indiqué par une flèche jaune, et des lésions à l’hémisphère droit sont également indiquées par les flèches jaunes (G et H). Barreaux de l’échelle = 1 mm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. néonatales Tests comportementaux

Remarque : Ici, les tests comportements ont été effectuées à l’âge de 6 semaines.

  1. Tâche d’évitement passif.
    Remarque : Afin d’évaluer la fonction de mémoire basée sur l’apprentissage et l’évitement d’un stimulus aversif, un à deux compartiments pas à PAT doit être menée13,14,15,16.
    1. Placer une souris dans le compartiment lumineux de la boîte en Plexiglas-navette (41,5 × 21 × 35 cm3) d’un appareil de PAT.
    2. Après 30 s, ouvrez la porte guillotine et enregistrer le temps de latence de la souris pour le déplacer dans le compartiment sombre (jusqu'à 300 s).
    3. Fermez la porte guillotine lorsque tous les quatre membres de la souris sont entièrement à l’intérieur du compartiment sombre.
    4. Administrer des chocs électriques pied (0,5 mA) pour 2 s et retour la souris dans sa cage.
    5. Remplacer la souris dans le compartiment lumineux 24 h après le choc électrique pied.
    6. Ouvrez la guillotine porte 10 s après que la souris est entièrement placée dans le compartiment lumineux et enregistrer le temps de latence de la souris pour le déplacer dans le compartiment sombre (jusqu'à 300 s).
  2. Test à pied de l’échelle.
    Remarque : La tâche de marche rung échelle permet la discrimination entre les perturbations subtiles de motricité en combinant qualitatif et analyses quantitatives des qualifiés marche17,18.
    1. Allumez une caméra vidéo.
    2. Placez la souris sur le panneau de début de l’échelle et immédiatement commencer l’enregistrement.
    3. Enregistrer la vidéo, en se concentrant sur les membres de la souris.
    4. Arrêter l’enregistrement quand la souris touche le dernier panneau de l’échelle. Répéter le voyage de retour-et-vient quatre fois.
    5. Analyser l’enregistrement vidéo et manuellement de compter le nombre de feuillets de chaque patte avant, comme suit :
      1. Jouer l’enregistrement de la vidéo sur un ordinateur à une vitesse lente (0,1 x) et compter les étapes manuellement.
  3. Test de force de préhension.
    Remarque : Le test de force de préhension est effectué à l’aide d’un mesureur d’adhérence, qui comprend une jauge de contrainte de pousser-tirer.
    1. Fixer l’appareil de force de préhension sur un panneau acrylique.
    2. Placez la souris sur le panneau d’acrylique et tenir sa queue.
      1. Déplacez la main tenant la queue pour que la souris peut atteindre et grip le fil métallique de l’appareil.
    3. Autoriser plusieurs essais jusqu'à ce que la souris saisit un morceau triangulaire de fil métallique (2 mm de diamètre) ; la force maximale est automatiquement enregistrée en grammes par l’appareil.
      Remarque : Utilisez la force maximale moyenne de trois essais pour analyse19,20,21.

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Résultats

Toutes les données sont exprimées en la moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). La comparaison des variables entre les deux groupes a été réalisée à l’aide d’un indépendants ou appariés t-test sur le logiciel de statistiques SPSS. Une p-valeur < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Le cerveau néonatal blessure HI a montré différente gravité des dégâts et ont été classé en conséquence (<...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons induit des lésions cérébrales HI une souris néonatales à P7-10 CD-1 et nous avons identifié la lésion du cerveau avec les déficits cognitifs et moteurs. Au cours de cette procédure, l’occlusion de l’artère carotide droite unilatérale était critique. Dans cette étape, l’artère peut être endommagé et déchiré. La plupart des chiots qui ont connu une détérioration de l’artère est mort. Réciproquement, si les chercheurs ligaturé une autre veine de sang au lieu de la carotide droite unilatérale, le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions de la National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042 ; 2015M3A9B4067068), le ministère de la Science et technologie, République de Corée, la Korean Health Technology R & D Project (HI16C1012), ministère de la santé et Bien-être, République de Corée et le programme d’aide de recherches « Dongwha » Faculté de Yonsei University College of Medicine (6-2016-0126).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambre hypoxiqueJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
Appareil PATJeung Do Bio & Plant CoConstructeur
L’échelle en marchantJeung Do Bio & Plant CoConstructeur
SDI Système de force de préhensionSan Diego Instruments Inc.
Appareil de mesure de la force de préhensionUgo Basile47200
Harvard Apparatus Système d’anesthésie Fluovac  ;Harvard Apparatus
d’anesthésieboîte en acrylique
I-Fran Liquid (Isofluorane)Hana Pharm. Co., Ltd.Anesthésiques généraux (isoflurane 100ml)
CD-1 sourisOrient Co., Ltd.
Bleu Nylon Mono Suture Non Résorbable 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
Statistiques IBM SPSSIBMVer. 23
ExpérimentalexpérimentalBoîte

Références

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