Le maintien de la couverture de la barrière hémato-encéphalique est la clé de l'homéostasie du système nerveux central. Ce protocole décrit des techniques in vitro pour délimiter les processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture de la barrière hémato-encéphalique.
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Article de méthode
Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau
Dans cet article
Résumé
Résumé
La couverture de la barrière hémato-encéphalique (BBB) joue un rôle central dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC). Le BBB est maintenu dynamiquement par les astrocytes, les pericytes et les cellules endothéliales du cerveau (BEC). Ici, nous détaillons les méthodes pour évaluer la couverture BBB en utilisant des cultures individuelles de BEC humains immortalisés, des cultures simples de BEC de souris primaires et un modèle de culture triple humanisé (BEC, astrocytes et pericytes) du BBB. Pour mettre en évidence l'applicabilité des tests aux états pathologiques, nous décrivons l'effet de l'amyloide-β (oAβ) oligomère, qui est un facteur important de la progression de la maladie d'Alzheimer (AD), sur la couverture BBB. De plus, nous utilisons le facteur de croissance épidermique (EGF) pour éclairer le potentiel de dépistage des techniques des médicaments. Nos résultats montrent que les BEC cultivés à une ou à trois fois forment des structures en forme de maille dans des conditions basales et que oAβ perturbe cette formation de maillage cellulaire et dégénère les structures de maille préformées,Mais EGF bloque cette perturbation. Ainsi, les techniques décrites sont importantes pour la dissection de processus fondamentaux et pathologiques qui modulent la couverture BBB.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique (BBB) des capillaires cérébraux est la plus grande interface de contact entre le sang et le cerveau et joue un rôle central dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC) 1 , 2 . Les processus dynamiques à la BBB empêchent l'absorption de molécules indésirables du sang, éliminent les déchets du SNC, fournissent des nutriments essentiels et des molécules de signalisation au SNC, et modulent la neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 ,....
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Protocole
Toutes les expériences suivent les protocoles du Comité institutionnel d'élevage et d'utilisation de l'Université de l'Illinois, Chicago Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Préparation générale
REMARQUE: La lignée de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau (hCMEC / D3) est une ligne 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Culturez les cellules hCMEC / D3 sur des flacons de culture de tissus revêtus de collagène type I (peau de ....
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Résultats
Dans les cultures uniques, les cellules hCMEC / D3 ( Figure 3A ) et les BEC de souris primaires ( Figure 3B ) forment des structures semblables à des mailles dans le puits. Les structures sont caractérisées par un maillage de noeuds interconnectés ( Figure 3 ). Dans tous les paradigmes décrits ( figure 1 ), les structures en forme de maillage sont similaires après 24 h .......
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Discussion
Les méthodes décrites peuvent être utilisées pour répondre à plusieurs questions biologiques fondamentales entourant la couverture vasculaire 24 . Plus précisément, ils peuvent identifier quels récepteurs et voies de signalisation jouent un rôle dans l'angiogenèse, la couverture vasculaire dans le tissu cancéreux et les cellules endothéliales périphériques pertinentes pour le cerveau. Les exemples comprennent les récepteurs du facteur de croissance angiogénique, l'oxyde nitrique, la signa.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Leon Tai est financé par des fonds de démarrage de l'Université d'Illinois à Chicago.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cellules hCMEC/D3 | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 Média basal | Lonza | CC-3156 | |
| Collagène Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnésium, sans rouge de phénol | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Concentrations finales des suppléments de facteur de croissance SingleQuot pour le milieu EBM2 | Lonza | CC-4147 | |
| 5 % FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10 % Acide ascorbique | Lonza | CC-4147 | |
| 10 % Sulfate de gentamycine | Lonza | CC-4147 | |
| 25 % Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 du volume des facteurs de croissance fournis : facteur de croissance des fibroblastes, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance analogue à l’insuline, facteur de croissance de l’endothélium vasculaire | Lonza | CC-4147 | |
| Chlorhydrate de puromycine | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Système de dissociation des cellules de papaïne (papaïne et DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Péricytes humains | Sciencell | 1200 | |
| Péricytes moyens basaux | Sciencell | 1201 | |
| Supplément de croissance des péricytes | Sciencell | 1252 | |
| Astrocytes humains | Sciencell | 1800 | |
| Milieux astrocytaires | Sciencell | 1801 | |
| Astrocytes supplément de croissance | Sciencell | 1852 | |
| Membrane basale (facteur de croissance Matrigel réduit) | Corning | 356231 | |
| Angiogenèse m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Facteur de croissance épidermique humain | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker vert | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker bleu | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10 % Neutre Tamponné Formol | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL souris | Jackson Laboratory | na | |
| Bandelettes de tube PCR | GeneMate | T-3014-2 | |
| Microscope de dissection Zeiss stereo discover v.8 | Zeiss | na |
Références
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain bar....
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Réimpressions et autorisations
