Ici, nous présentons un protocole pour l'enregistrement du réseau neuronal rythmique theta et les oscillations gamma à partir d'une préparation isolée de l'hippocampe entier. Nous décrivons les étapes expérimentales de l'extraction de l'hippocampe aux détails des enregistrements de pince à lames, à l'unité et à l'ensemble des cellules, ainsi qu'à la stimulation optogénétique du rythme theta.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit les procédures de préparation et d'enregistrement de l'hippocampe entier isolé, des souris WT et transgéniques, ainsi que des améliorations récentes des méthodologies et des applications pour l'étude des oscillations theta. Une caractérisation simple de la préparation isolée de l'hippocampe est présentée dans laquelle la relation entre les oscillateurs internes de l'thetape de l'hippocampe est examinée conjointement avec l'activité des cellules pyramidales et les interneurones GABAergiques, des domaines cornu ammonis-1 (CA1) et sous -ulum (SUB). Dans l'ensemble, nous montrons que l'hippocampe isolé est capable de générer des oscillations theta intrinsèques in vitro et que la rythmicité générée dans l'hippocampe peut être manipulée avec précision par la stimulation optogénétique des interneurones positives à la parvalbumine (PV). La préparation in vitro isolée de l'hippocampe offre une occasion unique d'utiliser simultanément des enregistrements de pince-plaie intracellulaires et champêtres à partir d'un neu visuellement identifiéAfin de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la génération du rythme theta.
Introduction
Les oscillations de l'hippocampal theta (4 à 12 Hz) sont parmi les formes les plus prédominantes d'activité rythmique chez le cerveau mammalien et sont censés jouer un rôle clé dans les fonctions cognitives telles que le traitement de l'information spatio-temporelle et la formation de souvenirs épisodiques 1 , 2 , 3 . Alors que plusieurs études in vivo qui mettent en évidence la relation des cellules place-modulées avec des études de navigation spatiale et des lésions, ainsi que des preuves cliniques, étayent la vision selon laquelle les oscillations de theta de l'hippocampe sont impliquées dans la formation de mémoire 4 , 5 , 6 , les mécanismes associés Avec la génération des oscillations de theta de l'hippocampe sont encore pas complètement compris. Les premières études in vivo ont suggéré que l'activité theta dépendait principalement des oscillateurs extrinsèques, en particulier de l'entrée rythmiqueÀ partir de structures cérébrales afférentes telles que le septum et le cortex entorhinal 7 , 8 , 9 , 10 . Un rôle pour les facteurs intrinsèques - la connectivité interne des réseaux de neurones de l'hippocampe avec les propriétés des neurones de l'hippocampe - a également été postulé sur la base d'observations in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Cependant, en dehors de quelques études marquantes 19 , 20 , 21 , des difficultés dans l'élaboration d'approches qui pourraient reproduire des activités de population physiologiquement réalistes dans une préparation simple de tranche in vitroS ont, depuis longtemps, retardé un examen expérimental plus détaillé des capacités intrinsèques de l'hippocampe et des zones apparentées à l'auto-génération des oscillations theta.
Un inconvénient important de la configuration expérimentale standard de la coupe mince in vitro est que l'organisation cellulaire et synaptique 3D des structures cérébrales est habituellement compromise. Cela signifie que de nombreuses formes d'activités de réseau concertées basées sur des assemblages cellulaires distribués spatialement, allant des groupes localisés (rayon ≤ 1 mm) aux populations de neurones réparties sur une ou plusieurs zones cérébrales (> 1 mm), ne peuvent pas être supportées. Compte tenu de ces considérations, un autre type d'approche était nécessaire pour étudier la façon dont les oscillations theta apparaissent dans l'hippocampe et se propagent à des structures de sortie corticales et subcorticales apparentées.
Au cours des dernières années, le développement initial de la préparation «sépto-hippocampique complète» pour examiner les interiraux bidirectionnelsLes cisions des deux structures 22 et l'évolution qui en a résulté de la préparation du «hippocampe isolé» ont révélé que les oscillations intrinsèques de theta se produisent spontanément dans l'hippocampe dépourvue d'entrée rythmique externe 23 . La valeur de ces approches repose sur l'idée initiale selon laquelle toute la structure fonctionnelle de ces régions devait être préservée afin de fonctionner comme un générateur de rythme theta in vitro 22 .
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures ont été effectuées selon les protocoles et les lignes directrices approuvés par le Comité des soins animaux de l'Université McGill et le Conseil canadien sur les soins des animaux.
1. Préparation inactive de l' hippocampe aiguë
REMARQUE: l'isolement de la préparation intacte de l'hippocampe comprend trois étapes majeures: (1) Préparation des solutions et du matériel, (2) Dissection de l'hippocampe et (3) Mise en place du système de vitesse de perfusion rapide nécessaire à la génération d'oscillations intrinsèques Theta. Dans ce protocole, l'exécution en temps voulu des procédures - de la dissection à l'enregistrement - est particulièrement importante car l'hippocampe isolé constitue une préparation si dense, mais délicate, que le maintien de la connectivité fonctionnelle de la structure in vitro nécessite un grand soin. Préparer tout au préalable assure qu'un niveau adéquat de perfusion est disponible le plus tôt possible pour minimiser les cellules dAmage et maintien de la fonction physiologique.
- Solution de fluide céramique cérébral artificiel (aCSF) à base de saccharose
- Préparez la solution de saccharose 1X pour être utilisée pour la dissection et l'incubation post-dissection. Combinez tous les composants énumérés dans le tableau 1 , à l'exception du CaCl 2 , dans 1 L d'eau désionisée et conservez à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Solution standard aCSF
- Préparez un aCSF standard pour une perfusion à haut débit de l'hippocampe isolé pendant les enregistrements électrophysiologiques. Pour obtenir le concentré (5X) de stock aCSF, dissolvez tous les composants indiqués dans le Tableau 2 , à l'exception du CaCl 2 , dans 2 L d'eau désionisée et conservez à 4 ° C.
- Préparer l'équipement
- Avant de commencer la dissection, installez la zone de banc avec un plateau en plastique rempli de glace (30 x 20 x 5 cm), des lignes de tubes en carbogèneEe glass Carrés de pétri (10 x 2 cm) (voir figure 1 ).
- Ajouter 300 mL de solution de saccharose (1X stock) dans un bécher de 500 mL, la faire buller avec du carbogène (95% O 2 , 5% de CO 2 ) et ajouter Ca 2+ [1,2 mM].
- Transférer 60 ml de cette solution de saccharose dans une boîte en Pétri en verre et laisser à température ambiante. Placez le reste dans un congélateur à 4 ° C pendant 10 à 15 min.
- Faire passer la solution de saccharose glacée avec du carbogène tout au long de la dissection.
- Remplir une deuxième boîte de Petri (chambre de maintien à froid) avec une solution de saccharose (4 ° C) et continuer à glacer.
- Ajouter 30 ml d'une solution de saccharose glacée à un bêcher de 50 ml.
2. Dissection entière d'hippocampe
NOTE: La méthode de dissection de l'hippocampe isolé est essentiellement identique à celle développée et décrite à l'origine 22 , mais avec des détails supplémentaires et des changements concernant les peTaux de rfusion et techniques d'enregistrement.
- Dissection du cerveau
- Anesthésier la souris (P20 - 35) sous une hotte avec une petite serviette en papier trempée avec 1 ml d'isoflurane (100%) ajoutée à la cage.
- Décapiter la souris anesthésiée et immerger rapidement la tête dans une solution de saccharose glacée (50 mL de bécher, ~ 5 s). Transférer sur une serviette en papier.
- Utilisez un scalpel pour faire une incision interne de la peau (caudale au rostral) et pousser la peau sur les côtés pour exposer le crâne.
- Couper le crâne avec un petit ciseau et utiliser une spatule pour extraire rapidement le cerveau et le déposer dans la boîte de Petri contenant une solution de saccharose glacée. Laisser 1-2 minutes pour que le cerveau refroidisse.
- Pendant que le cerveau se rétablit, ajoutez 2 à 3 ml de solution de saccharose sur un plat de peinture en poudre (dissection) sur papier glacé sur glace.
- Isoler l'hippocampe
- Placez le cerveau sur le plat de dissection dans une position verticaleN.
- Retirez le cervelet et le cortex frontal avec une lame de rasoir. Couper le cerveau en deux le long du plan midsagittal et retourner les deux hémisphères isolés dans la chambre de retenue. Laissez encore 1 à 2 minutes pour récupérer.
- Placez le cerveau hémisphérique seul debout sur le plat de dissection.
- Faites pivoter le plat jusqu'à ce que les structures midsagittal façent face à l'observateur et le contour intégré du complexe septal soit visible sous la forme d'une mince couche de tissu en forme de poire antérieure au thalamus.
- Tenez le cerveau hémisphérique stable avec la microspatule et placez la petite extrémité de la spatule recouverte de polytétrafluoroéthylène (PTFE) immédiatement derrière (caudale à) la zone septique.
- Insérez la spatule enduit sous le septum et déplacez la pointe vers le bas jusqu'à ce que le plat de dissection soit atteint. Séchez les fibres qui relient la zone septique de manière caudale. Répétez la même opération le long du bord antérieur du septum et coupez les fibres qui se connectent à la partie frontale du cerveau.
- Avec la spatule qui maintient légèrement la partie interne du cortex juste au-dessus de l'hippocampe en position verticale, utilisez la microspatule pour retirer soigneusement les noyaux thalamiques, hypothalamiques et souches du cerveau. Utilisez la spatule pour couper et retirer les tissus étirés.
- Transformez l'hémisphère isolé sur son côté et identifiez le contour de l'hippocampe.
- Insérez la spatule enduit dans le ventricule latéral, sous l'extrémité rostrale de l'hippocampe dorsal.
- Tenez la spatule alignée horizontalement avec le plan midsagittal du cerveau hémisphérique et faites-le glisser dans le contour lisse des parois ventriculaires jusqu'à ce que la pointe émerge caudalement.
- Tenez la spatule sous l'hippocampe et appuyez légèrement sur les fibres de connexion, le long de la couche intérieure où l'hippocampe se joint au cortex superposé. Appliquer la microspatule sur le côté externe de cette couche et glisser contre la spatule enduit pour tranche à travers la connexion.
- Pour compléter l'extraction, faites pivoter le plat de dissection et insérez la spatule enduit sous l'hippocampe ventral. Tenir légèrement l'intérieur du pli cortical avec la spatule et couper les connexions entorhominales en utilisant un mouvement de coupe contre la microspatule.
REMARQUE: Le complexe septo-entamique entier peut être éliminé en plaçant la spatule enduit sous l'hippocampe entier et en retirant le tissu cérébral restant en dessous. - Une fois l'isolement terminé, gardez l'hippocampe reposant sur le plat et ajoutez une goutte de solution de saccharose glacée pour le garder au frais. Découper soigneusement tout cortex et fibres restants et séparer l'hippocampe du septum en appliquant doucement une lame de rasoir à travers le fornix.
REMARQUE: si les enregistrements de pinces de patch doivent être effectués à partir de cellules pyramidales (voir la section 4.6 Contrôle optogénétique), l'hippocampe isolé peut être coupé transversalement à un angle de 45 ° pour exposer la couche pyramidale de CA1 ("anglE-cut "), sans compromettre les circuits du réseau local dans la partie restante de l'hippocampe. - Transférer la préparation à la solution de saccharose à température ambiante et la laisser récupérer pendant 15 à 30 minutes avant de transférer dans la chambre d'enregistrement.
3. Configurer la perfusion rapide pour enregistrer l'hippocampe isolé
- Mettre en place le système de perfusion alimenté par gravité pour permettre l'entrée continue à haute vitesse d'aCSF oxygéné à 20-25 ml / min.
- Préparez les flacons aCSF (1X) à l'avance et immerges-les dans un bain de réchauffement (~ 30 ° C) au moins 15 minutes avant le début de l'expérience. Allumez le système de chauffage en solution en ligne (30 ° C).
- Utilisez des bubblers d'aquarium et des lignes de tubes connectés à un réservoir de carbogène pour oxygéner l'aCSF tout au long de l'expérience et ajoutez CaCl 2 [2 mM] avant le début de la perfusion.
- Arrêtez le flux d'aCSF et transférez l'hippocampe à la chambre d'enregistrement en utilisant le largeFin d'une pipette en verre. Permettre à la préparation saturée de saccharose de couler et de s'installer en bas.
- Placez la préparation au centre de la chambre d'enregistrement (en ligne avec l'axe d'entrée-sortie) avec la surface lisse de CA1 et SUB sur le dessus. Stabilisez l'hippocampe avec de petits poids aux extrémités septal et temporelles et relancez le flux d'aCSF.
4. Électrophysiologie dans l'Hippocampe isolé
- Enregistrement extracellulaire des oscillations hippocampiques theta in vitro
- Pour la surveillance extracellulaire du potentiel de champ local (LFP) ou de l'activité unitaire de l'hippocampe isolé in vitro , utiliser des micropipettes en verre (1 à 3 MΩ) remplies d'aCSF. Enregistrez des signaux de potentiel de champ à couplage AC à faible bruit avec un amplificateur à extension de patch de gain x1000, un filtrage passe-bande en ligne de 0,1 à 500 Hz et un taux d'échantillonnage de 5 à 20 kHz.
REMARQUE: Le microscope personnalisé utilisé dans ce protocoleEst équipé d'objectifs bas (2.5X) et de grand grossissement (40X) pour une vision à faible grossissement de l'hippocampe, ainsi que d'une microscopie vidéo infrarouge et d'une épifluorescence pour la reconnaissance d'une seule cellule. Les composants de ce système comprennent le microscope à fluorescence verticale, les cubes de filtre à fluorescence, une caméra vidéo analogique et un capteur de trame numérique avec un logiciel d'imagerie, une chambre de perfusion personnalisée sur scène ( Figure 2A , inset i) et des micromanipulateurs de haute précision pour les enregistrements neuronaux et Placement en fibre optique. - Utilisez la caméra montée sur le microscope et reliée à un écran d'ordinateur pour inspecter la préparation de l'hippocampe sous un faible grossissement (2.5X) et vérifiez rapidement qu'il n'y a pas de contre-dépouille ou d'endommagement de la surface externe. L'agencement orienté en diagonale des fibres d'alvéole le long de la surface lisse de CA1 devrait être visible ( Figure 2A , encadré ii) lors de la lumière brisée par l'intermédiaire de l'hippocampus.
- Utilisez l'objectif de grand champ à faible grossissement pour voir l'hippocampe isolé et le placement des électrodes LFP dans des emplacements d'enregistrement spécifiques.
REMARQUE: Une disposition de la préparation isolée de l'hippocampe avec de multiples électrodes placées dans des emplacements d'enregistrement différents est illustrée à la figure 2A . - Abaissez une électrode LFP dans le bain jusqu'à ce qu'elle touche la surface (alvéole) de la zone CA1.
REMARQUE: cela produit habituellement un transitoire rapide dans l'enregistrement à couplage AC semblable à ce qui se produit lorsque l'électrode entre en contact avec le support d'enregistrement. Un moniteur audio peut être utile pour écouter le signal du canal LFP après cette étape.
REMARQUE: Souvent, les premiers signes d'activité n'apparaissent qu'après 10 à 15 minutes, il est donc important de ne pas avancer rapidement dans la préparation. Si après cette période, l'électrode LFP de surface ne poursuit pas l'activité, avance un peu plus loin dans les stratum oriensEt faites une pause périodique pour voir si une forme quelconque d'activité survient lorsque vous approchez de la couche cellulaire principale. Si rien n'est détecté après 5 à 10 minutes supplémentaires, retirez soigneusement l'électrode et placez-la ailleurs le long de la même région. - Avancez l'électrode LFP à travers la couche pyramidale. Observez que l'activité de piquant extracellulaire augmente initialement à mesure que l'on détermine une décharge d'une seule unité provenant de neurones individuels (principalement des cellules de panier pyramidales et inhibitrices). Abaissez l'électrode plus loin et notez que les pointes commencent à s'effacer à nouveau lorsque la pointe croise dans le radiatum. Observez qu'une oscillation de réseau clairement visible dans la plage de fréquence theta (4 - 12 Hz) soit apparente et atteigne une amplitude maximale (~ 100 - 300 μV) lorsque l'emplacement d'enregistrement est abaissé par le radiatum.
- Pour la surveillance extracellulaire du potentiel de champ local (LFP) ou de l'activité unitaire de l'hippocampe isolé in vitro , utiliser des micropipettes en verre (1 à 3 MΩ) remplies d'aCSF. Enregistrez des signaux de potentiel de champ à couplage AC à faible bruit avec un amplificateur à extension de patch de gain x1000, un filtrage passe-bande en ligne de 0,1 à 500 Hz et un taux d'échantillonnage de 5 à 20 kHz.
- Les oscillations theta dans une seule région
- Pour tester les propriétés spatiales des oscillations theta spontanées dans la région CA1, placez la pointe oFa référence l'électrode LFP dans un site médical CA1 (localement situé le long de l'axe septo-temporel longitudinal) et l'abaisser dans le radiatum comme décrit précédemment.
- Placez une seconde électrode LFP dans un site CA1 (200 à 800 μm septal ou temporel à partir du premier LFP) et observez que les oscillations theta de CA1 peuvent se synchroniser sur des distances relativement importantes.
- Les oscillations Theta à travers les couches
- Pour tester les propriétés des oscillations theta sur les couches de l'hippocampe, laissez une électrode LFP de référence dans un site CA1 radiatum. À partir de juste au-dessus de la stratum oriens, abaisser une seconde électrode dans la couche de cellules pyramidales et à travers le radiatum. Observez une inversion graduelle du signal LFP (inversion de phase relative) à travers la couche pyramidale.
REMARQUE: pour des exemples représentatifs de ces types d'activité, voir la figure 2B . Exemples de profils laminaires / de profondeur et analyses de densité de source actuelle (CSD)Illustre le site d'inversion de phase dans les hippocampies isolés qui ont déjà été publiés 23 , 24 , 25 .
- Pour tester les propriétés des oscillations theta sur les couches de l'hippocampe, laissez une électrode LFP de référence dans un site CA1 radiatum. À partir de juste au-dessus de la stratum oriens, abaisser une seconde électrode dans la couche de cellules pyramidales et à travers le radiatum. Observez une inversion graduelle du signal LFP (inversion de phase relative) à travers la couche pyramidale.
- Les oscillations gamma et le couplage theta-gamma dans l'hippocampe intact
- Placez une électrode de champ sur la bordure CA1 / SUB et abaissez-la jusqu'à ce qu'elle soit située à l'interface entre les couches pyramidales et moléculaires. À ce niveau, un potentiel de champ affichant des oscillations gamma claires avec des changements d'amplitude que le verrouillage de phase au rythme theta local peut être enregistré 24 . Réglez la mise à l'échelle pour observer l'échelle de temps lente du couplage theta-gamma. Notez que les rafales gamma se produisent dans deux bandes de fréquences distinctes, ce qui peut être révélé par filtrage passe-bande du signal LFP en cours dans la gamme lente (25 - 50 Hz) et gamma rapide (150 - 250 Hz) (voir Figure 2C pour filtre représentatif traces).
- Enregistrement de la pince de patch intégral pendant les oscillations hippocampiques theta in vitro
REMARQUE: dans cette partie du protocole, l'objectif est d'obtenir des enregistrements de pince à patchs à cellules entières visuellement à partir d'interneurones identifiées dans des hippocampies isolés à partir de souris PV-TOM transgéniques exprimant la protéine fluorescente, tdTomato, sous le contrôle du promoteur PV (pour Plus de détails voir les matériaux et Ref 26 ).- Utiliser une microscopie vidéo à fluorescence avec un grossissement faible (2.5X) et une puissance élevée (40X) pour visualiser les interneurones TdTomato-positives situées près de la surface d'une préparation d'un hippocampe à partir d'une souris PV-TOM ( Figure 3 ). Notez que si les neurones PV-TOM peuvent être visualisés avec succès et ciblés pour le patch à travers l'alvéole (jusqu'à 100 μm), les cellules pyramidales non fluorescentes peuvent également être facilement atteintes lorsque l'hippocampe est préparé avec la technique de coupe d'angle (voir Note de la section 2.2.14).
- Sous une vue de faible amplification de l'hippocampe, placez une électrode LFP dans CA1 / SUB pour surveiller les oscillations theta tout en préparant les expériences de patch clamp.
- Passez à un grossissement 40X et immergez l'objectif sur la région cible; Abaissez-le jusqu'à ce que les couches supérieures deviennent visibles. Manipulez la position du microscope pour assurer un accès ouvert suffisant pour l'approche de la pipette patch du côté opposé.
- En microscopie à fluorescence, sélectionnez une cellule fluorescente PV-TOM et approchez-la avec une pipette patch (2 à 3 MΩ) remplie d'une solution intracellulaire standard.
- Utilisez une embouchure pour appliquer une pression positive légère sur la pipette et surveillez la résistance lorsque l'électrode est abaissée sur la cellule. Lorsque la pointe rencontre la cellule cible, la résistance de la pipette augmente et une fossette claire apparaît lorsque la pression positive pousse la membrane. Relâchez la pression et vérifiez que la pression actuelle s'allonge lorsque le joint commence à se former. Immédiatement clÀ un potentiel hyperpolarisé (-70 mV), et une fois qu'un joint d'étanchéité GΩ est atteint, rompre la membrane cellulaire avec une petite quantité de pression négative appliquée à travers le porte-pipette.
- Une fois dans la configuration de cellules entières, examinez les propriétés physiologiques des cellules PV identifiées lors des oscillations spontanées de l'hippocampe ( Figure 3B ).
- Observez que l'enregistrement du potentiel de membrane intracellulaire à partir de cellules photovoltaïques est caractérisé par un comportement rapide et des rafales de potentiels d'action synchronisés avec le rythme théta CA1 / SUB continu.
- Passez à la tension et serrez la cellule à différents potentiels de membrane pour caractériser le rapport des courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs générés par l'activité rythmique intrinsèque. Un exemple d'enregistrement de la pince patch à partir d'une cellule pyramidale est illustré à la figure 3A pour comparaison.
- Contrôle optogénétique dans l'hippocampe isolé
NOTE: Pour le contrôle optogénétique de l'activité du réseau de l'hippocampe, une stratégie spécifique de type cellulaire impliquant l'activation rythmique de cellules GABAergiques contenant du PV est utilisée ici car ces cellules ont joué un rôle majeur dans la synchronisation des principales populations de cellules dans l'hippocampe isolé 25 . L'expression sélective de la canalrhodopsine-2 excitatrice (ChR2) dans les cellules photovoltaïques est obtenue en traversant la ligne de souris PV-Cre avec des souris exprimant constitutivement ChR2 Cre-dependent (Ai32), générant ainsi des souris PV-ChY. En variante, les constructions de vecteurs viraux ( par exemple , AAVdj-ChETA-eYFP) peuvent être injectées dans l'hippocampe de souris PV-Cre ou PV-TOM (P15-16) pour conduire l'expression de l'opsine excitatrice dans les interneurones CA1 / SUB ( Figure 4A ).
NOTE: Cette stratégie a déjà été décrite 25 .- Placez une électrode LFP dans la zone CA1 / SUB et réparez une cellule pyramidale proche dans l'hippococès isoléAmpleur d'une souris exprime l'opsin excitateur à lumière bleue ChR2 dans les interneurones photovoltaïques.
- Placez un guide de lumière à fibre optique (0,2 - 1 mm de diamètre) au-dessus de la préparation de l'hippocampe et centrez-le sur la région enregistrée. Utilisez la lumière bleue (473 nm) à partir d'une source LED pour la stimulation optogénétique, consistant en des impulsions lumineuses (10-20 ms, déclenchées par un signal logique transistor-transistor) ou des commandes de tension des ondes sinusoïdales livrées aux fréquences (4 à 12 Hz).
REMARQUE: l'assemblage personnalisé de stimulation lumineuse à base de LED a été décrit ailleurs 25 . - Passez à la pince actuelle et caractérisez l'activité de la pyramide lors d'oscillations théta spontanées.
- Commencez le protocole de stimulation et enregistrez les réponses lumineuses. Garder que les oscillations de champ et l'activité synaptique dans le neurone enregistré se synchronisent de plus en plus pendant la stimulation optogénétique et que la stimulation rythmique des cellules photovoltaïques entraîne un contrôle robuste des deux fréquencesLa puissance et la puissance des oscillations theta ( Figure 4 ).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en étudiant les oscillations theta dans la préparation d'hippocampe isolée sur la souris in vitro . La procédure de dissection pour extraire l'hippocampe isolé est illustrée à la figure 1 . En utilisant cette préparation, les oscillations theta intrinsèques peuvent être examinées pendant le placement de plusieurs électrodes de champ, enregistrant l'activité g...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Bien que les enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches d'hippocampe aiguë constituent une technique standard in vitro , les méthodes présentées ici diffèrent sensiblement de l'approche classique. Contrairement aux préparations en tranche mince où des couches cellulaires spécifiques sont visibles à la surface et peuvent être examinées directement, les préparations intactes d'hippocampe sont plus proches des configurations in vivo où les électrodes sont abaissées dan...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt commercial ou financier concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé et sciences naturelles du Canada.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs <>forts | |||
| Chlorure de sodium | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Bicarbonate de sodium | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - phosphate de sodium monobasique | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Sulfate de magnésium | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Chlorure de potassium | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Ascorbate de sodium | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Nom | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Ciseaux | Fisher Scientific | 08-951-25 | Extraction du cerveau |
| Scalpel Manche #4, 14 cm | WPI | 500237 | extraction du cerveau |
| Filter pinces, mâchoires plates, droites (11 cm) | WPI | 500456 | extraction de cerveau |
| Paragon Lames de scalpel en acier inoxydable #20 | Ultident | 02-90010-20 | extraction de cerveau |
| Ciseaux de dissection incurvés à pointe fine | Thermo Fisher Scientific | 711999 | de cerveau |
| Téflon (PTFE) -spatule fine recouverte de téflon VWR | 82027-534 | préparation de l’hippocampe | |
| Hayman Style Microspatule | Fisher Scientific | 21-401-25A | préparation hippocampique |
| Cuillère de laboratoire | Fisher Scientific | 14-375-20 | préparation hippocampique |
| Verre borosilicaté Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | préparation hippocampique |
| Droper | Fisher Scientific | préparation hippocampique | |
| Lames de rasoir à simple tranchant | VWR | 55411-055 | préparation de l’hippocampe |
| Papier pour lentilles (4 x 6") | VWR | 52846-001 | préparation de l’hippocampe |
| Boîtes de Pétri en verre (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | préparation de l’hippocampe |
| Plateau en plastique pour la glace ; taille 30 x 20 x 5 cm | n.a.n.a.préparation | l’hippocampe | |
| Solution unique en ligne Chauffage | Warner Instruments | Système de perfusion SH-27B | |
| Pierres à air d’aquarium pour bouillonnement | n.a.n.a.système | de perfusion | |
| Tygon E-3603 tube (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | système de perfusion |
| poêle électrique | Noir & Système | perfusion | n.a. |
| 95 % O2/5 % CO2 mélange gazeux (carbogène) ; | Système de perfusion | Vitalaire | SG466204A |
| Flacons/flacons en verre (4 x 1 L) | n.a.n.a.système | de | perfusion |
| Chambre d’enregistrement immergée | conception personnalisée (FM) | n.a.Une | alternative commerciale peut être utilisée |
| Pipettes en verre (1,5/0,84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | électrophysiologie |
| Hum Bug 50/60 Hz Éliminateur de bruit | Quest Scientific | Q-Humbug | électrophysiologie |
| Multiclamp 700B amplificateur patch-clamp | Dispositifs moléculaires | Électrophysiologie | MULTICLAMP |
| Multiclamp 700B Commander Program | Appareils moléculaires | MULTICLAMP | électrophysiologie |
| Convertisseur numérique/analogique Dispositifs | moléculaires | DDI440 | électrophysiologie |
| PCLAMP10 | Dispositifs moléculaires | PCLAMP10 | électrophysiologie |
| Table d’isolation des vibrations ; | Newport | n.a.electrophysiologie | |
| Micromanipulateurs (à commande manuelle) | Siskiyou ; | MX130 | électrophysiologie (LFP) |
| Micromanipulateurs (automatisés) | Siskiyou ; | MC1000e | électrophysiologie (patch) |
| Moniteur audio ; | A-M Systems | Modèle 3300 | Électrophysiologie |
| Micropipette/Patch Extracteur de pipette | Sutter | P-97 | Électrophysiologie |
| Microscope à fluorescence vertical sur mesure | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Caméra vidéo analogique | COHU | 4912-2000/0000 | Imagerie |
| Acquisition d’images numérique avec logiciel d’imagerie | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imagerie |
| Objectif Olympus 2.5X | Imagerie | Olympus MPLFLN | Imagerie |
| Objectif à immersion dans l’eau Olympus 40X Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging | |
| Système de diodes électroluminescentes (LED) sur mesure ; | stimulation | n.a. | (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | >Comments |
| Animals | |||
| PV ::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Autoriser ; Expression génique dirigée par Cre dans les interneurones PV |
| Souris Ai9 constitutive-conditionnelle (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Numéro de | Jackson Laboratory | 007905 | Express TdTomato après recombinaison médiée par Cre |
| Souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | de stock du | Jackson Laboratory | Exprimer la protéine de fusion channelrhodopsine-2/EYFP améliorée suite à une exposition à Cre souris PVChY recombinase |
| En maison d’élevage | n.a.Progéniture | obtenue par croisement de la lignée PV-Cre avec des souris Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Références
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
