PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Djoshkun Shengjuler; Simou Sun; Paul S. Cremer; Craig E. Cameron

doi:10.3791/55869

Article de méthode

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

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DOI :

10.3791/55869

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27 juillet 2017

Djoshkun Shengjuler¹ , Simou Sun² , Paul S. Cremer¹^,² , Craig E. Cameron¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, ²Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une bicouche lipidique supportée dans le contexte d'une plate-forme microfluidique pour étudier les interactions protéines-phosphoinositides en utilisant une méthode sans étiquette basée sur la modulation du pH.

Résumé

De nombreuses protéines cellulaires interagissent avec les surfaces membranaires pour affecter les processus cellulaires essentiels. Ces interactions peuvent être dirigées vers un composant lipidique spécifique dans une membrane, comme dans le cas des phosphoinositides (PIP), pour assurer une localisation et / ou une activation sous-cellulaires spécifiques. Les PIP et les domaines de liaison cellulaire PIP ont été largement étudiés pour mieux comprendre leur rôle dans la physiologie cellulaire. Nous avons appliqué un test de modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées (SLB) comme outil pour étudier les interactions protéines-PIP. Dans ces études, la phosphatidyléthanolamine conjuguée à l' ortho -Sulforhodamine B est utilisée pour détecter les interactions protéine-PIP. Lors de la liaison d'une protéine à une surface de membrane contenant du PIP, le potentiel interfacial est modulé ( c.-à-d. Le changement du pH local), en déplaçant l'état de protonation de la sonde. Une étude de cas de l'utilisation réussie du test de modulation de pH est présentée en utilisant la phospholipase C delta1 PleckstrDans le domaine de l'homologie (PLC-δ1 PH) et de l'interaction phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P ₂ ) à titre d'exemple. La constante de dissociation apparente ( K _{d, app} ) pour cette interaction était de 0,39 ± 0,05 μM, similaire à K _d, valeurs d' _application obtenues par d'autres. Comme précédemment observé, le domaine PLC-δ1 PH est PI (4,5) P ₂ spécifique, montre une liaison plus faible au phosphatidylinositol 4-phosphate et ne se lie pas aux SLB de phosphatidylcholine pure. Le dosage PIP-on-a-chip est avantageux par rapport aux essais traditionnels de liaison au PIP, y compris, mais sans s'y limiter, le faible volume de l'échantillon et les exigences d'étiquetage du ligand / récepteur, la capacité de tester des interactions membranaires à haute et faible affinité avec les petits et les petits De grandes molécules et un rapport signal / bruit amélioré. En conséquence, l'utilisation de l'approche PIP-on-a-chip facilitera l'élucidation des mécanismes d'une large gamme d'interactions membranaires. En outre, cette méthode pourrait être possibleDans l'identification des agents thérapeutiques qui modulent la capacité des protéines à interagir avec les membranes.

Introduction

De nombreuses interactions et processus biochimiques se déroulent sur des surfaces à membrane bidimensionnellement fluides. Les organites membranaires dans les cellules eucaryotes sont exclusives non seulement dans les procédés biochimiques et leur protéome associé, mais également dans leur composition lipidique. Une classe exceptionnelle de phospholipides est la phosphoinositide (PIP). Bien qu'ils ne représentent que 1% du lipidome cellulaire, ils jouent un rôle crucial dans la transduction du signal, l'autophagie et le trafic de la membrane, entre autres ¹ ^, ² ^, ³ ....