Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP

Résumé

Ici, nous décrivons l'application de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après photoblanchage (3D-FRAP) pour l'analyse de la permutation dépendant de la jonction de miRNA. Contrairement aux méthodes couramment appliquées, 3D-FRAP permet de quantifier le transfert intercellulaire de petits ARN en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Résumé

Les petits ARN antisens, comme le miARN et l'ARNi, jouent un rôle important dans la physiologie et la pathologie cellulaires et, en outre, peuvent être utilisés comme agents thérapeutiques dans le traitement de plusieurs maladies. Le développement de nouvelles stratégies novatrices pour la thérapie miRNA / siRNA repose sur une connaissance approfondie des mécanismes sous-jacents. Les données récentes suggèrent que les petits ARN sont échangés entre les cellules d'une manière dépendant de la jonction, ce qui induit des effets de régulation des gènes dans la cellule destinataire. Les techniques biologiques moléculaires et l'analyse cytométrique en flux sont couramment utilisées pour étudier l'échange intercellulaire du miARN. Cependant, ces méthodes ne fournissent pas une résolution temporelle élevée, ce qui est nécessaire lors de l'étude du flux de jonction entre les molécules. Par conséquent, pour étudier l'impact du miRNA / siRNA en tant que molécules de signalisation intercellulaire, de nouveaux outils sont nécessaires pour permettre l'analyse de ces petits ARN au niveau cellulaire. Le présent protocole décrit l'apPlication de la récupération de fluorescence tridimensionnelle après microscopie de photoblanchissement (3D-FRAP) pour élucider l'échange de molécules d'ARNm entre les cellules cardiaques. Il est important de noter que cette approche directe et non invasive d'imagerie en cellule vive permet de visualiser et de quantifier le passage à genoux jumelé de petits ARN marqués par fluorescence en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les données obtenues par 3D-FRAP confirment une nouvelle voie de régulation des gènes intercellulaires, où les petits ARN agissent comme des molécules de signalisation dans le réseau intercellulaire.

Introduction

Les petits ARN non codants sont des acteurs importants de la régulation des gènes cellulaires. Ces molécules sont composées de 20 à 25 nucleotides qui se lient à un ARNm cible spécifique, conduisant au blocage de la traduction ou à la dégradation ¹ de l'ARNm. Le processus de réglementation des gènes entrepris par les petits ARN, tels que le miARN et l'ARNi, est un mécanisme hautement conservé qui a été trouvé dans de nombreuses espèces différentes ³ . En particulier, les molécules d'ARNm sont d'une importance cruciale pour une variété de processus physiologiques, y compris la prolifération, la différenci....

Protocole

Toutes les étapes de ce protocole impliquant des souris néonatales ont été effectuées selon les directives éthiques pour les soins des animaux du Centre médical de l'Université de Rostock.

1. Préparation des plats de culture cellulaire et du milieu pour la culture des cardiomyocytes

1. Revêtir une plaque de culture cellulaire avec 0,1% de gélatine dans du PBS et incuber à 37 ° C pendant 4 h ou à 4 ° C pendant une nuit. Retirez la gélatine et laissez-la sécher sous un flux d'air laminaire stérile.
2. Préparer un milieu de culture cellulaire composé de 50 mL de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1....

Résultats

Ici, nous présentons la microscopie 3D-FRAP comme une technique non-invasive pour étudier la liaison de jonction entre le miRNA fluorescent dans les cardiomyocytes néonatals. Les cardiomyocytes isolés ont révélé le schéma typique de l'α-actinine striée et contenaient de grandes plaques de Cx43 le long des frontières des cellules ( figure 1A , pointes de flèches blanches), ce qui a permis le flux intercellulaire élevé des molécules. La pureté des cardiomyocyt.......

Discussion

Les miARN sont des acteurs clés de la physiologie cellulaire et ont été considérés comme des molécules de signalisation en utilisant entre autres les GJ comme voie d'échange intercellulaire ^{11 , 12 , 22} . Le protocole actuel présente une technique in vitro d'imagerie par cellule vivante pour caractériser ce transfert GJ-dependant en utilisant des ARNm fluorescents dans des grappes de cellules.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris NMRI néonatales	Charles River
	Gelatin Sigma Aldrich	G7041	Solution à 0,1 % dans PBS, PBS stérilisé
	Pan Biotech	P04-53500
Dulbecco´ ; s milieu modifié	Pan Biotech	P04-03550
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100µ ; g/mL
Sérum fœtal bovin	Pan Biotech	P30-3306
Culture cellulaire plastique	TPP
Kit d’isolement des cardiomyocytes primaires	Thermo Fisher Scientific	88281
HBSS	Thermo Fisher Scientific	88281	inclus dans le kit d’isolement des cardiomyocytes primaires
Bleu trypan	Thermo Fisher Scientific	15250061
miRIDIAN Dy547 marqué microARN Mimic	Dharmacon	CP-004500-01-05	se dissoudre dans de l’eau libre d’ARNase, solution mère 20µ ; M
Phosphate de sodium monobasique	Sigma	S3139
Phosphate de sodium dibasique	Carl Roth	T877.2
Chlorure de potassium	Sigma	P9333
Chlorure	de magnésium Serva	28305.01
Succinate de sodium	Carl Roth	3195.1
de trypsine/EDTA à 0,05 %	Merck	L2153
puits - Lames de chambre à fond en verre	IBIDI	80827	couche avec une solution de gélatine à 0,1 %
Amaxa Nucleofector II	Le programme Lonza		G-009 a été utilisé pour l’électroporation  ;
LSM 780 ELYRA Système PS.1	Zeiss
Excel Anticorps	Microsoft
&alpha ;-actinine	Abcam	ab9465	dilution 1:200
Anticorps Connexin43	Santa Cruz	sc-9059	dilution 1:200
chèvre anti-souris Alexa 594 anticorps	Thermo Fisher Scientific	A-11005	dilution 1:300
chèvre anti-lapin Alexa 488	anticorps Thermo Fisher Scientific	A-11034	dilution 1:300
Connexin43 siRNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708 ID158724	concentration finale 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	L10119
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
DAPI coloration nucléaire	Thermo Scientific	D1306