Identification et caractérisation des facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le RIP de roman-Tag ; RIP-tva modèle murin

Résumé

Nous présentons un protocole visant à démontrer un système de transfert de gène somatique utilisant RIP-Tag ; RIP-tva modèle de souris pour étudier la fonction des gènes à la métastase. Les rétrovirus aviaires sont livrés intracardiacally afin d’assurer le transfert de gènes en lésions précancéreuses et non invasives des cellules β pancréatiques chez la souris adulte.

Résumé

Cancer métastatique représente 90 % des décès chez les patients atteints de tumeurs solides. Il y a un besoin urgent de mieux comprendre les pilotes des métastases cancéreuses et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour étudier les événements moléculaires qui animent la progression du cancer primitif de métastase, nous avons développé un modèle de souris bitransgenic, RIP-Tag ; RIP-tva. Dans ce modèle de souris, le promoteur de l’insuline de rat (RIP) amène l’expression de l’antigène T de SV40 (Tag) et le récepteur pour le sous-groupe un virus de la leucose aviaire (tva) dans les cellules β du pancréas. Les souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas avec une pénétrance 100 % par des étapes bien définies qui ressemblent à la tumorigenèse humaine, avec étapes dont l’hyperplasie, angiogenèse, adénome et carcinome invasif. Parce que RIP-Tag ; RIP-tva souris ne développent pas la maladie métastatique, les altérations génétiques qui favorisent la métastase peuvent être identifiées facilement. Transfert de génique somatique en exprimant le tva, prolifèrent β du pancréas des lésions précancéreuses est réalisée par injection intracardiaque de rétrovirus aviaires nourrissait l’altération génétique désirée. Un titre de > 1 x 10⁸ unités infectieuses / ml est considéré comme approprié pour in vivo de l’infection. En outre, les rétrovirus aviaires peuvent infecter les lignées cellulaires dérivées de tumeurs dans RIP-Tag ; RIP-tva souris à haut rendement. Les lignées cellulaires permet également de caractériser les facteurs métastatiques. Ici, nous montrons comment utiliser ce modèle de souris et de lignées afin d’évaluer les fonctions des gènes candidats à la métastase des tumeurs de cellules.

Introduction

La plupart des cancers résultent de mutations somatiques ¹. Modèles conventionnels de souris génétiquement modifiées (GEMM) ont fourni des aperçus significatives de la contribution des altérations génétiques spécifiques à la tumorigenèse ². Toutefois, ils présentent plusieurs limites. L’inconvénient majeur de ces modèles est qu’ils ne reproduisent pas le caractère sporadique de la formation de tumeurs chez l’homme, dont seulement certaines cellules dans un tissu acquièrent des altérations génétiques. Les mutations chez les souris transgéniques et knock-out sont également des cellules germinales avec susceptibles d’affecter le développement. En outre, ces modèles de souris est long et coûteux.

Métastase est une question importante dans le domaine du cancer. Modélisation des métastases a été difficile à GEMM. Métastase spontanée est rare chez la souris. Pénétrance est variable et la latence est long dans GEMM de métastase ³. Métastase expérimental modèles emploient injection directe des cellules dans la circulation des souris, alors les premières étapes dans la cascade métastatique sont éliminés.

Pour remédier à certaines des limitations ci-dessus dans l’étude des facteurs métastatiques dans des modèles murins, nous avons développé un modèle de souris bitransgenic, RIP-Tag ; RIP-tva⁴. La stratégie repose sur la combinaison de l’utilisation d’un modèle de souris de la progression tumorale très synchronisés, RIP-Tag ⁵et le récepteur pour le virus de la leucose aviaire sous-groupe-A, tva ^6,7. Ce RIP -Tag ; RIP-tvamodèle de souris permet de gènes à introduire somatiquement dans une souche de souris unique bitransgenic. Avec l’antigène T de SV40 supprimant les fonctions suppresseurs de tumeur Rb et p53, souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas de manière similaire à la tumorigenèse humaine, avec étapes dont l’hyperplasie, angiogenèse, adénome et carcinome invasif. Ce modèle RIP-Tag a été très instructif pour notre compréhension des caractéristiques du cancer, sans s’y limiter à des tumeurs neuroendocrines du pancréas. Il a également été utilisé dans des essais précliniques ⁸.

Nous présentons un protocole pour le transfert génique somatique par injection de rétrovirus aviaire intracardiacally dans RIP-Tag ; RIP-tva souris. Succès Infectionà RCASBP dérivés des rétrovirus aviaires nécessite activement la prolifération des cellules cibles. Par conséquent, nous avons choisi RIP-Tag ; RIP-tva souris à 7 semaines d’âge, quand l’hyperplasie se développe chez environ 50 % des îlots pancréatiques. Une injection intracardiaque ventriculaire gauche de virus de titre élevé est nécessaire pour atteindre un rendement d’infection de 10-20 % ⁴. Cette méthode de livraison réduit la dilution significative de particules virales dans la circulation avant virus atteignent les îlots pancréatiques.

En utilisant cette approche, nous avons démontré précédemment que Bcl-xL favorise les métastases cancéreuses indépendant de son anti-apoptotique fonction ^4,9. Cette fonction métastatique anti-apoptotique indépendante n’a été observée lorsque Bcl-xL a été exprimé par un transgène dans toutes les cellules β du pancréas tout au long de l’ontogénie tumorigène dans le RIP-Tag ; RIP-Bcl-xL souris modèle ¹⁰. Par conséquent, notre modèle de souris offre une occasion unique pour identifier et caractériser les fonctions des gènes exprimés à un stade ultérieur de la tumorigenèse. Parce que 2 à 4 % d’îlots se développent dans les tumeurs dans la RIP-Tag ; RIP-tva bitransgenic souris sans infection virale et pas toutes les lésions précancéreuses sont infectés par les rétrovirus aviaires dérivé de RCASBP, seulement les facteurs qui confèrent un avantage sélectif au cours de la tumorigenèse naturel peuvent être identifiés. En particulier, les facteurs métastatiques seront plus facilement reconnus par cette méthode, parce que les métastases aux ganglions pancréatiques ou d’autres organes ne se produit pas normalement dans RIP-Tag ; RIP-tva souris.

Protocole

éthique énoncé : expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et règlements établis par l’Institut pour la protection des animaux et utilisation Comité de Weill Cornell médecine.

1. choix des vecteurs rétroviraux aviaire (basé sur A RCASBP ou RCANBP(A)-based)

• vecteurs a été dérivée du sarcome de Rous virus ¹¹. Vecteurs rétroviraux aviaires peuvent livrer des ADNc (≤ 2,5 kb), courte hairpin RNAs (interférents), microARN (miARN) et autres ARN non codants. Les vecteurs commercialement disponibles sont répertoriés dans les matériaux et d’autres doivent être demandés directement auprès des auteurs.
• De surexprimer gènes d’intérêt, utilisez l’un des vecteurs suivants, RCASBP(A) ¹² ( Figure 1 a), ACS-X ( Figure 1 b), ACS-Y ¹³ ( figure 1), RCASBP-Y DV ¹⁴ ou autres vecteurs ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
• De frapper les gènes d’intérêt de shARN, utilisez l’un des vecteurs suivants : DV RNCan-X ¹⁵ ou ACS-RNAi ¹⁶.
• De surexprimer miARN, générer vecteur ACS-miR, comme décrit dans ¹⁷.
• Transformation en exigence d’e. coli et ADN.
• Préférence transformer l’ADN Stbl2 ou Stbl3 cellules compétentes, qui ont un génotype unique pour stabiliser des séquences répétées et rétrovirales directs. Purifier l’ADN de plasmide utilisant une méthode qui permettra d’obtenir pur, grade de transfection ADN. 5 µg d’ADN est nécessaire avec une concentration minimale de 0,1 µg/µl.

2. Multiplication virale dans la lignée de fibroblastes DF1 poulet

1. l’utilisation de pointes de pipette filtré de culture cellulaire est nécessaire pour éviter de cross-contamination virale stocks ¹⁸.
2. Cellules de maintenir DF1 dans plat de 6 cm avec une croissance moyenne (DMEM avec hyperglycémie, 10 % sérum de veau fœtal, 6 mM (concentration finale) L-glutamine, 10 unités/ml de pénicilline, 10 µg/ml de streptomycine) à 37 ^o C et 5 % de CO ₂. Si des cellules de DF1 sont fraîchement décongelés de stocks congelés, leur culture pendant au moins 3 jours avant la transfection.
3. Un jour avant la transfection, passez DF1 cellules à un plat de culture de tissu de 6 cm afin qu’ils soient confluente de 30 à 50 % au moment de la transfection.
4. Diluer 5 µg d’ADN viral pure avec DMEM (sans le sérum, la pénicilline ou streptomycine) pour un volume total de 150 µl dans un tube de microcentrifuge à l’intérieur d’une hotte de vitroplants.
5. Ajouter 30 µL de Superfect directement dans le tube d’ADN dilué ; vortex ce mélange pendant 10 s, laissez le mélange à température ambiante pendant 5-10 min dans la culture de tissus la hotte pour permettre la formation d’un complexe transfection.
6. Tandis que la formation d’un complexe se déroule, aspirer doucement le milieu de croissance de la boîte de Petri de cellule de DF1 et se laver soigneusement les cellules avec 4 ml de PBS ^{- / -}.
7. Pipette 5 ml de croissance moyenne (contenant du sérum et antibiotiques) ; enregistrer 4 ml dans un tube Falcon pour la prochaine étape ; et ajouter le reste de 1 ml de milieu de croissance pour les complexes de transfection. Mélanger en pipettant également en haut et en bas deux fois et transférer immédiatement les complexes entiers de transfection pour les cellules de DF1. Agiter pour faire en sorte que la couche de cellules est couverte ; Incuber pendant 2-3 heures à 37 ^o C.
8. Aspirer le mélange de transfection, laver les cellules avec 4 ml de PBS ^{- / -}, ajouter 4 ml de milieu de croissance fraîche (contenant des sérum et antibiotiques) ; retour de cellules dans un incubateur à 37 ^o C.
9. Quand les cellules atteignent la confluence, passage des cellules (expression transitoire peut être dosée de 48 à 72 h après la transfection).
10. Continuer à passer des cellules pendant environ 7 jours jusqu'à ce que toutes les cellules sont probablement infectées ; test d’intégration de l’ADN virale par PCR et déterminer l’expression de la protéine Western Blot ; et congeler les cellules dans un milieu DMEM avec 10 % DMSO et 20 % de sérum de veau fœtal.

3. In Vivo Infection de RIP-balise ; RIP-tva souris

1. collection de Virus et de concentration
   utilisation concentrée fraîchement virus in vivo de l’infection. Le titre du virus conservés à 4 ^o C moins d’une semaine n’est pas significativement réduit. Cependant, les aliquotes congelées de stock virale affichent 10 fois moindre titre après décongélation.
   1. Cellules de DF1 de virus-producteur Expand dans des plats de 15 cm selon la quantité de virus nécessaire. Pour in vivo l’infection de souris, préparer une moyenne d’une plaque par souris.
   2. Refroidir avant le rotor (par exemple, SW28), le seau de la balançoire et la machine ultracentrifugeuse à 4 ^o C.
   3. Collect surnageant de vaisselle confluentes de 15 cm. Enlever les débris de cellules par centrifugation à basse vitesse à 1 650 x g pendant 10 min à 4 ^o C.
   4. Transférer le surnageant viral à tubes ultracentrifugeuse (tubes à centrifuger polyallomère). Tournez dans une ultracentrifugeuse pendant 1 h 30 à 95 400 x g 4 ^o C. Pour machine de Beckman XL-100 d’ultracentrifugeuse, utilisez Accel : 1 ; Coupure : 1 réglages.
   5. Enlever le surnageant d’ultracentrifugeuse tubes autant que possibles. Ajouter PBS sans calcium et magnésium (PBS ^{- / -}) dans le tube d’ultracentrifugeuse faire final 100 µl de suspension virale d’un plat de 15 cm. Couvrir les tubes avec Parafilm. Resuspendre le culot viral invisible au vortex l’ultracentrifugeuse tubes pendant 2 min à vitesse moyenne.
   6. Rock les tubes ultracentrifugeuse à 4 ^o C pendant une heure pour la nuit.
   7. Transférer la suspension virale dans un tube de microcentrifuge. Réchauffer la suspension virale à température ambiante avant l’injection à des souris.
2. Titre viral détermination.
   Pour chaque nouvelle construction virale, titre viral doit être déterminé avant l’in vivo de l’infection.
   1. Graines DF1 cellules dans tous les puits d’une plaque de culture de tissu de 12 puits (suggestion : 2 x 10 ⁴ cellules/puits, 1 ml/puits), de sorte qu’ils seront 30 % anastomosé au moment de l’infection. Une plaque de 12 puits est nécessaire pour une détermination du titre viral.
   2. Faire une série de dilutions 10 fois du liquide surnageant viral dans le milieu comme suit :
      1. Mix 5 µl surnageant viral avec 495 µl milieu de croissance pour la dilution de ² 10 dans un tube de microcentrifuge. Vortex brièvement pendant quelques secondes.
      2. Prendre 40 µl du 10 ² dilution dans 360 µl de milieu de croissance dans un tube à microcentrifugation pour la dilution de ³ 10. Vortex brièvement pendant quelques secondes.
      3. Suivre étape 3.2.2.2 pour 10 ⁴ et 10 dilution ⁵.
      Tubes
      4. set up 5 6 ml en polystyrène. Milieu de croissance aliquote 2,25 ml par tube et étiquette eux 10 ⁶ 10 ⁷, 10 ⁸, 10 ⁹, 10, ¹⁰, respectivement.
      5. Mélanger 0,25 ml de la dilution de ⁵ 10 avec 2,25 ml de milieu de croissance dans le 6 ml de tube de polystyrène pour la dilution ⁶ 10. Vortex brièvement pendant quelques secondes.
      6. Suivre étape 3.2.2.5 pour 10 ⁷, 10 ⁸, 10, ⁹ et 10 dilution ¹⁰.
      7. Supprimer le support original de culture de cellules de DF1 sur la plaque de 12 puits. Mettre le virus 1 ml dilué à chaque puits en reproduit (non infectés, 10 ¹⁰ 10 ⁶ UI/ml).
   3. Permettre aux cellules de croître pendant au moins 7 jours (effectuer trypsinzation lorsque cela est nécessaire). Prélever des cellules pour isoler l’ADN et vérifier la présence d’ADN viral par PCR comme décrit dans " 6. Les protocoles PCR ". Si ce titre viral 10 ⁸ unités infectieuses par ml (UI/ml), on remarquera une positifs produits PCR bp 398 de RCASBP en utilisant l’ADN des cellules avec 10 ⁸ 10 ⁶ virus d’UI/ml, mais pas des cellules non infectées, ou des cellules avec 10 ¹⁰ 10 ⁹ Virus d’UI/ml. Un titre de > 1 x 10 ⁸ unités infectieuses par ml doivent être utilisées pour in vivo de l’infection.
3. Injection intracardiaque
   hémizygote RIP-Tag souris, souris pas homozygotes, sont utilisées dans cette étude. Hémizygote RIP-Tag souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas autour de 10 ~ 12 semaines d’âge, tandis que les souris homozygotes ont une latence plus courte de la tumeur. Parce que la prolifération cellulaire est nécessaire pour l’incorporation de l’ADNc virale dans l’hôte génome, âgés de 7 semaines RIP-Tag ; RIP-tva souris avec des cellules β pancréatiques hyperplasique sont utilisés. Veuillez noter que les cellules β plus normales ne prolifèrent pas chez la souris adulte.
   1. Utilisation 7 semaines RIP-Tag ; RIP-tva souris dans un pur C57BL/C pour les expériences.
   2. Anesthésier la souris à l’aide d’une combinaison de kétamine/xylazine (150 mg/kg ; 15 mg/kg). Utiliser le support de chaleur pour maintenir la température corporelle de souris pendant toute la durée de l’anesthésie.
   3. Appliquer du lubrifiant de l’oeil sur les deux yeux pour éviter le dessèchement cornéen.
   4. Rasage des cheveux de la cavité thoracique de RIP-Tag ; RIP-tva souris. Souris de position sur le dos la poitrine vers le haut. Un orteil-pinch est effectuée afin d’observer l’animal pour non-réponse confirmer l’effet de l’anesthésie complète.
   5. Prolonger la branche avant et les fixer avec les bandes. Souris de marque ' poitrine s pour injection. Marquer un emplacement à mi-chemin entre l’encoche sternale et haut de xyphoid processus et légèrement à gauche (anatomique) du sternum ( Figure 2).
   6. Gommage la paroi thoracique antérieure avec un gommage povidone-iode ou un gommage de chlorhexidine suivie d’un alcool isopropylique à 70 % ou 70 % éthanol imbibé de gaze.
   7. Tirer 50 µl d’air dans une insuline stérile 28 g ½ seringue pour créer un espace entre le plongeur et le ménisque d’une seringue µL 500 et puis aspirer à 100 µl de virus. L’espace aérien sans aucun liquide sur le mur est crucial pour voir pouls cardiaque.
   8. Garder vertical de l’aiguille. Doucement la peau de souris tendue d’une main et insérer l’aiguille à l’emplacement marqué. Lorsqu’une impulsion rouge vif du sang apparaît dans la seringue, arrêter de faire avancer l’aiguille et fixer la profondeur de l’aiguille chez la souris d’une main.
   9. Utiliser l’autre main pour soigneusement et pousser lentement le piston pour livrer la suspension virale (~ 100 µl volume) sur une période environ 60 secondes. Livrer 10-20 µl de chaque fois que voir une impulsion lumineuse rouge de sang apparaissent dans la seringue. Entrée continue de rouge sang oxygéné dans le hub d’aiguille transparent indique le positionnement de l’aiguille dans le ventricule gauche.
   10. Après la dernière Poussée du piston pour livrer la suspension virale et avant de voir la prochaine impulsion rouge de sang, rapidement rétracter l’aiguille hors de la cavité thoracique.
   11. Appliquez une légère pression sur le site de l’injection pour réduire le saignement pendant au moins 1 min.
   12. Déplacer délicatement la souris sur un coussin chauffant ou sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que pleinement conscient. Souris seront surveillés jusqu'à ce que l’anesthésie s’estompe afin qu’ils peuvent se désengager des stimuli, une période qui dure habituellement environ une heure. Souris seront fera tous les jours pour manteau même et intact ainsi que tout changement dans le comportement.

4. L’analyse histopathologique des tumeurs

1. neuf semaines après l’injection, euthanasier 16 semaines RIP-Tag ; RIP-tva souris. Enregistrer la taille et le nombre de tumeurs pancréatiques primaires et des métastases bruts.
2. Fix pancréas, foie et autres organes dans 10 % tamponnée au formol pendant la nuit à température ambiante dans une plate-forme bascule.
3. Transférer les tissus fixés dans l’éthanol à 70 % le lendemain. Traiter les tissus en sections paraffine.
4. Perform immunohistochemical souillant pour synaptophysine (un marqueur neuroendocrine) ou insuline (marqueur spécifique des cellules β) suivant le fabricant ' s directives pour identifier les métastases des cellules β du pancréas à des ganglions pancréatiques ou le foie. Cependant, des cellules tumorales hors différenciées ou cellules tumorales peu différencié peut perdre l’expression de l’insuline et seulement peut être détectés par immunomarquage synaptophysine.

5. In Vitro L’infection de cellules exprimant tva

il n’est pas nécessaire d’utiliser des virus concentrés pour in vitro de l’infection. Le protocole décrit ci-dessous est pour deux tours de l’infection. Séries d’infection peuvent être effectuées en répétant le protocole suivant.

1. à frais virés le surnageant viral de DF1 confluentes. Gardez le surnageant viral à 4 ^o C pour infection à moins d’une semaine. Avant l’infection, passer le surnageant viral à travers un filtre de 0,45 μm pour obtenir des virus acellulaire.
2. Rincer brièvement tva exprimant des cellules cibles (c.-à-d. N134 β du pancréas cellule lignée de cellules tumorales d’un RIP-Tag ; RIP-tva souris) avec PBS ^{- / -} pour éliminer toute trace de sérum, qui contiennent des inhibiteurs de trypsine. Rincer brièvement la tva exprimant des cellules cibles avec solution de trypsine-EDTA (tels que 0,25 % trypsine-2.21 mM EDTA). Ajouter la solution de trypsine-EDTA et incuber pendant 2 minutes. Tapoter légèrement la plaque. Observer des cellules au microscope inversé. Cellules détachement généralement en 2 à 3 min. cellules cibles de graines dans une assiette de 6 cm. Utilisation 3 ~ 4 ml filtrés surnageant viral comme milieu de culture.
   Remarque : La nutrition dans le surnageant viral est consommée par les cellules de DF1, alors changer le milieu le lendemain.
3. Le lendemain, réchauffer suffisamment quantité de surnageant viral à température ambiante. Retirer le support de cellules cibles et remplacez par surnageant viral de 3 à 4 ml.
4. Le troisième jour, passage des cellules selon les besoins. Si les cellules ne sont pas suffisamment denses pour être repiquées, réchauffer ~ 4 ml de milieu de croissance régulière (DMEM avec hyperglycémie, 10 % sérum de veau fœtal, 6 mM (concentration finale) L-glutamine, 10 unités/mL de pénicilline, 10 µg/mL de streptomycine) pour remplacer le surnageant viral.
5. Expand cellules infectées et d’examine l’expression de la protéine candidat par Western blotting ¹⁹. Les effets des gènes candidats sur la migration et invasion peuvent être analysées dans les essais transwell. Ces lignées cellulaires peuvent également être testées pour leur potentiel métastatique au foie lors d’un essai de veine de queue pour métastases.

6. Les protocoles PCR

Solutions doivent être montées aussi rapidement que possible sur la glace. Un mastermix sans le modèle est possible pour un grand nombre d’échantillons et aliquotés dans des tubes PCR. Multipliez le montant de chaque réactif nécessaire par le nombre d’échantillons. Mélanger les réactifs par pichenette avant et avant de prendre certains d’ajouter à la mastermix à jet hélicoïdal avec embout. Après avoir ajouté chaque réactif dans le tube de mastermix, pipette up et down pour livrer les résidus à l’intérieur les pointes.

1. Pour détecter la présence de RCASBP dans les cellules infectées ou transfectées.
   Le protocole suivant demande 11,5 µL de la mastermix et 1 µL d’ADN génomique pour chaque échantillon. Veillez à agiter avant d’ajouter chaque réactif.
   1. Préparer un mastermix de l’eau sans nucléase 7.68 µL, 0,75 µL DMSO, 1,25 µl de tampon de 10 x II pour l’ADN polymérase AmpliTaq, 1.375 µl de 25 mM MgCl ₂ et 0,125 µl de 25 mM dNTP.
   2. Ajouter 0,125 µL de 100 µM avant peinture primaire RCAS5626F : (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') et 0,125 µL de 100µm inverser l’apprêt RCAS6023R : (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') à la mastermix.
   3. Ajouter 0.075 µL AmpliTaq ADN polymérase à la mastermix.
   4. Mélanger le mastermix en effleurant le tube avec les doigts. Tournez en bas la matermix en un instant de machine centrifugey pour 3 ~ 5 secondes.
   Tubes de PCR
   5. aliquot 11,5 µL de la mastermix à chaque individu. Tourbillon chaque fois avant aliquotage dans un nouveau tube.
   6. Tourbillon et ajouter 1 matrice d’ADN génomique µL à chaque tube PCR. Pour préparer l’ADN génomique : culot cellulaire
      1. Lyse dans 200 µl de 0,05 M NaOH. Pipette de haut en bas pour dissoudre le culot.
      2. Chauffer la cellule lysate à 98 ° C pendant 20 minutes dans une machine PCR, puis refroidie à 25 ° C.
      3. Ajouter 20 µL 1,0 M Tris-HCl (pH 7.5) pour les tubes et le magasin de l’ADN des échantillons à 4 ° C.
   7. Mélanger les échantillons en effleurant et centrifuger brièvement pendant 3 à 5 secondes. Mettre les tubes dans une machine PCR.
   8. PCR la condition est définie pendant 2 min à 92 ° C, pour dénaturation initiale, suivie de 40 cycles de 30 s à 94 ° C pendant la dénaturation, 30 s à 67° C de recuit, 30 s à 72 ° C pendant l’extension et de 10 m à 72 ° C extension finale.
   9. Après que la PCR est terminée, ajouter 3 µL de 6 x colorant de chargement de l’ADN à chaque échantillon. Mélanger en effleurant et centrifuger brièvement pendant 3 ~ 5 secondes.
   10. Produits PCR sont examinés par électrophorèse sur un gel d’agarose de 2 % (p/v) dans un tampon de x TAE 1. La taille de son produit PCR est 398 BP.
2. Génotypage tag.
   Le protocole suivant appelle à 10,5 µL de la mastermix et 2 µL de l’ADN génomique pour chaque échantillon. Veillez à agiter avant d’ajouter chaque réactif.
   1. Préparer un mastermix de l’eau sans nucléase 4,5 µL et 4,00 µL 5 x MyTaq tampon de réaction pour l’ADN polymérase MyTaq.
   2. Ajouter 0,4 µL de 100 µM avant peinture primaire TagF2 : (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') et 0,4 µL de 100µm inverser l’apprêt TagR2 : (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') au master mix.
   3. Ajouter 0,8 µL du mélange de l’apprêt précurseur bêta-2-microglobuline (B2m) de 10 µM pour le contrôle interne. Des amorces PCR pour B2m le contrôle interne, précurseur de la bêta-2-microglobuline (B2m), sont F B2 (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') et B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
   4. Ajouter 0,4 µL MyTaq ADN polymérase à la mastermix.
   5. Mélanger le mastermix en effleurant le tube avec les doigts. Tournez en bas le mastermix dans les centrifugeuses pour 3 ~ 5 s.
   Tubes de PCR
   6. µL de 10,5 aliquote dans le mastermix à chaque individu. Tourbillon chaque fois avant aliquotage dans un nouveau tube.
   7. Tourbillon et ajouter la matrice d’ADN génomique 2 µL à chaque tube PCR. L’ADN génomique est préparé comme décrit ci-dessus.
   8. Mélanger la solution de pichenette et centrifuger brièvement pendant 3 à 5 secondes. Mettre les tubes dans la machine de PCR.
   9. PCR la condition est définie pendant 3 min à 95° C pendant la dénaturation initiale, suivie de 35 cycles de 15 s à 95 ° C pendant la dénaturation, 15 s à 65 ° C pour le recuit, 30 s à 72 ° C pendant la prolongation et à 10 min à 72 ° C extension finale.
   10. Après que la PCR est terminée, ajouter 3 µL de 6 x chargement colorant à chaque échantillon. Mélanger en effleurant et centrifuger brièvement pendant 3 ~ 5 secondes.
   11. Produits PCR sont examinés par électrophorèse en gel d’agarose 2 % (p/v) dans un tampon de x TAE 1. Les tailles des produits Tag et B2m PCR sont ~ 450 bp et 300 bp, respectivement.
3. génotypage tva.
   Le protocole suivant appelle à 10,5 µL du mélange réactif pour chaque échantillon. Veillez à agiter avant d’ajouter chaque réactif.
   1. Préparer un mastermix 5,6 eau libre de la nucléase µL 0,5 µL DMSO, 1,25 ml 10 x tampon II pour l’ADN polymérase AmpliTaq et 1.375 µL de 25 mM MgCl ₂ et 0,125 µL de 25 mM dNTP.
   2. Ajouter 0,125 µL de 100 µM tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') et 0,125 µL de 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') à la mastermix.
   3. Ajouter 1,275 µL du mélange de l’apprêt B2m de 10 µM pour le contrôle interne à le mastermix.
   4. Ajouter 0,125 µL AmpliTaq ADN polymérase à la mastermix.
   5. Mélanger le mastermix en effleurant le tube avec les doigts. Tournez en bas le mastermix dans centrifugeuses brièvement pendant 3 à 5 secondes.
   Tubes de PCR
   6. µL de 10,5 aliquote dans le mastermix à chaque individu. Tourbillon chaque fois avant aliquotage dans un nouveau tube.
   7. Tourbillon et ajouter 2 matrice d’ADN génomique dans chaque tube PCR. L’ADN génomique est préparé comme décrit ci-dessus.
   8. Mélanger la solution en feuilletant et centrifuger brièvement pour 3-5 s. mettre les tubes dans PCR machine.
   9. PCR la condition est définie pendant 2 min à 92 ° C, pour dénaturation initiale, suivie de 35 cycles de 30 s à 94 ° C pendant la dénaturation, 30 s à 60° C pour le recuit, 30 secondes à 72 ° C pendant l’extension et à 10 minutes à 72 ° C extension finale.
   10. Après que la PCR est terminée, ajouter 3 µL de 6 x chargement colorant à chaque échantillon. Mélanger en effleurant et centrifuger brièvement pendant 3-5 s.
   11. Produits PCR sont examinés par électrophorèse sur un gel d’agarose de 2 % (p/v) dans un tampon de x TAE 1. Les montants de tva et B2m amplicons sont 500 bp et 300 bp, respectivement.

Résultats

Le taux d’infection in vivo et in vitro de RIP-Tag ; RIP-tva des cellules tumorales par d’éventuels virus axée sur les RCASBP sont respectivement environ 20 % et environ 80 % ²⁰. Dans la balise de RIP ; RIP-tva modèle de souris, environ 4 % des 400 îlots pancréatiques dans chaque souris développera naturellement dans les tumeurs ²⁰; par conséquent, il y a une quantité suffisante de cellules tumorales dans ...

Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit un modèle de souris puissante, RIP-Tag ; RIP-tva, pour assurer une prestation génique somatique par l’intermédiaire de rétrovirus aviaires pour l’identification et la caractérisation des facteurs métastatiques. Bien que RIP-Tag ; RIP-tva souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas, métastatiques facteurs identifiés dans ce modèle de souris peuvent aussi promouvoir des métastases d’autres types de cancer.

Notre approche a l’av...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plasmide RCASBP-Y DV	Addgene	11478
Plasmide RCAS-RNAi	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
sérum fœtal bovin	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-glutamine, 100x	Corning	25-005-CI
Solution de pénicilline-streptomycine, 100x	Corning	30-002-CI
PBS-/-, 1x	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
Tube à centrifuger Polyallomer	Beckman Coulter	326823
0,45 mm Nalgene Filtres à seringues avec membrane PES	Thermo Scientific	194-2545
Seringues à insuline	BD
synaptophysine	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (peroxydase, IgG de lapin)	Vector Laboratories	PK-6101
AmpliTaq DNA polymérase avec tampon II	Life Technologies	N8080153
MyTaq DNA polymérase	Bioline	BIO-21106