Nous démontrons une nouvelle approche à l’utilisation de tomographie à cohérence optique domaine spectral haute résolution (HR-SD-OCT) pour aider l’administration d’agents de thérapie génique dans l’espace sous-rétinienne, évaluer sa couverture areal et caractériser la vitalité des photorécepteurs.
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Article de méthode
Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne
Dans cet article
Résumé
Résumé
HR-SD-OCT est utilisé pour surveiller la progression de la dégénérescence des photorécepteurs dans des modèles de souris vivante, évaluer l’administration d’agents thérapeutiques dans l’espace sous-rétinienne et d’évaluer la toxicité et l’efficacité le in vivo. HR-SD-OCT utilise près de lumière infrarouge (800-880 nm) et a l’optique spécialement conçu pour l’unique optique de le œil de souris avec résolution axiale sub-2-micron. Modèles de souris transgéniques de dégénérescence rétinienne externe (photorécepteurs) et les contrôles ont été imagées pour évaluer la progression de la maladie. Verre tiré des micro-aiguilles servaient à administrer des injections rétinienne de sup d’adeno-associated virus (AAV) ou de nanoparticules (NP) via une approche trans-sclérale et trans-choroïdienne. Attention, positionnement de l’aiguille dans l’espace sous-rétinienne était nécessaire avant une injection pression calibrée, qui délivre le fluide dans l’espace rétinienne sub. Temps réel sous-rétinienne chirurgie a été réalisée sur notre rétine imaging system (RIS). HR-SD-OCT a démontré la dégénérescence rétinienne progressive uniforme en raison de l’expression d’un humain mutant mutante rhodopsine toxique (P347S) transgène (RHOP347S) chez la souris. HR-SD-OCT permet une quantification rigoureuse de toutes les couches des rétiniens. Couche nucléaire externe (ONL) épaisseur et photorécepteur segment externe (OSL) mesures de longueur sont corrélés avec la vitalité des photorécepteurs, dégénérescence ou de sauvetage. Le système de largage RIS permet une visualisation en temps réel des injections sous-rétinienne dans néonatale (~ P10-14) ou de souris adultes et HR-SD-OCT immédiatement détermine le succès de la livraison et cartes étendue aréale. HR-SD-OCT est un outil puissant capable d’évaluer le succès de la chirurgie sous-rétinienne chez la souris, en outre de mesurer la vitalité des photorécepteurs in vivo. HR-SD-OCT permet également d’identifier des cohortes animales uniformes pour évaluer le degré de dégénérescence rétinienne, la toxicité et sauvetage thérapeutique dans des études de recherche de thérapie génique préclinique.
Introduction
Chercheurs mettent au point des thérapies géniques pour une variété de maladies dégénératives rétiniennes et rétiniennes dans l’espoir de traduire les nouvelles thérapeutiques en traitements pour les maladies humaines1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. domaine temporel ou tomographie en cohérence o....
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Protocole
Protocoles animaux ont été examinés et approuvés par l’animalier institutionnel et l’utilisation des comités de la VA WNY HCS et l’Université de Buffalo-SUNY. Animaux ont été utilisés selon les stipulations de l’Association for Research in Vision et Ophthalmology (ARVO) et la déclaration d’Helsinki.
1. modèles de souris
- Identifier des modèles de souris pour être évalués, y compris les contrôles.
Remarque : L’imagerie a été réalisée pour un C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, un modèle de dégénérescence rétinienne partiellement humanisés souris homozygote pour humains mutants RHOP347S hC1 allè....
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Résultats
Évaluer la présence, la taux et l’homogénéité de dégénérescence rétinienne externe modèle
Mesures de l’ONL ont été enregistrés entre l’OPL et l’orme, définissant les limites de l’ONL en utilisant l’outil de l’étrier fourni dans le logiciel de l’instrument. Le but était de cartographier la progression de la dégénérescence rétinienne externe dans un modèle murin de PACA partiellement humanisés. Des images comparables d’un contrôle de la souris C57BL/6(J) et un mWT hC1/hC.......
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Discussion
HR-SD-OCT fournit une méthode simple pour la caractérisation des modèles animaux de maladies humaines afin de déterminer leur utilité dans l’essai thérapeutique possible. La capacité de rapidement et sûrement caractériser un modèle animal de la maladie humaine est essentielle pour le processus de découverte de médicaments thérapeutiques (par exemple, thérapie de remplacement de gène, ribozyme ou shARN défiant thérapie génique, la thérapie génique combinée). HR-SD-OCT fournit une méthode simple, rapide et non inv.......
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Déclarations de divulgation
Relations commerciales : MCB : None ; JMS : aucun. La rétine imaging system (RIS)23 utilisée dans cette étude est un dispositif novateur d’utilisation importante à n’importe quel groupe qui cherchent à mener des études de livraison de thérapie génique chez des souris, rongeurs ou petits animaux. Bien que les auteurs n’aient aucun conflit de déclarer à l’égard de cet appareil en ce moment, l’Université de SUNY Buffalo - et l’Administration des anciens combattants ont des droits dans la propriété intellectuelle et peut chercher à commercialiser cet instrument à l’avenir.
Remerciements
Ce matériel est basé sur le travail soutenu, en partie, par le ministère des anciens combattants (VA), le Veterans Health Administration, le Bureau de recherche et le développement (laboratoire de recherche biomédicale et le développement) (Bourse de mérite VA 1I01BX000669). JMS travaille, en partie, comme médecin-chercheur, ophtalmologie, VA WNY ; MCB est employé, en partie, par VA WNY. L’étude a été menée à et financée en partie par le système de santé des anciens combattants Administration Western New York (Buffalo, NY). Contenu ne représente pas les vues du ministère des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis. Également pris en charge, en majeure pa....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R-N | /A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A N/A | ||
| Envisu R-2200 Instrument de tomographie par cohérence oculaire (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. ; ; | |
| Système d’imagerie rétinienne (RIS) | Microscope interne | N/A | |
| Stemi 2000C | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Extracteur de micropipettes flamboyant/brun | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micromanipulateur ; | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 ; micro-injecteur | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Porte-micropipette (rotatif) | Interne | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| ; Tubes capillaires en verre borosilicaté 1,5-1,8 X 100 mm, ; | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-tribromoéthanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Alcool Tert-amylique | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Solution ophtalmique, USP 1 % | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Solution ophtalmique de chlorhydrate de cyclopentolate, USP ; 2 % | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Pommade au sulfate de gentamicine USP, 0,1 % | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Chlorhydrate de tétracaïne | Bausch et Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Solution ophtalmique, USP 0,5 % | Bausch et Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Préparations virales | ViGene /UNC | N/A | |
| Nanotiges d’or | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Sulfate de fluorescéine AK-FLUOR 25 % | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Lamelles | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Pince | Milton | 18-825 | |
| Aiguilles 30 gauge | Beckton Dickenson ; ; | W11604 | |
| Seringues | Beckton Dickenson ; ; | ||
| Progiciel Bioptigen Bioptigen | N/A | ||
| Solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne, USP 0,5 % | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe ; | ||
| Échelle | Mettler | ||
| Ciseaux | World Precision Instruments | ||
| Poinçon | d’oreille Nat' l band | ||
| CL 100 Source lumineuse | Welch Allyn | CL100 | |
| Azote gazeux | Jackson Soudage Alimentation | N/A Bain-marie | |
| chauffé | Neslab | RTE-140 | |
| Plaque chauffante | In House | N/A | |
| Tapis chauffant | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Porte-souris en argile | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine ; | NDC53329-938-06 | |
| Applicateurs d’embouts en coton | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70 % | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gants Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Lentilles de contact | Interne | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Logiciel Origin 6.1 | OriginLab Corp. | N/A | |
| Électrodes de référence | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24" |
Références
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W.
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Réimpressions et autorisations
