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Article de méthode

Induction et diagnostic des tumeurs dans

15.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/55901

⸱

25 juillet 2017

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

Dans cet article

Résumé

L'analyse de clones de mosaïque dans l'épithélium de disque imaginal de Drosophila est un système modèle puissant pour étudier les mécanismes génétiques et cellulaires de la tumorigénèse. Nous décrivons ici un protocole pour induire des tumeurs dans des disques imaginaux d'ailes de Drosophila en utilisant le système GAL4-UAS et introduire une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes tumoraux.

Résumé

Aux premiers stades du cancer, les cellules mutantes transformées présentent des anomalies cytologiques, commencent une prolifération incontrôlée et perturbent progressivement l'organisation du tissu. Drosophila melanogaster est apparue comme un système de modèle expérimental populaire dans la biologie du cancer pour étudier les mécanismes génétiques et cellulaires de la tumorigénèse. En particulier, les outils génétiques pour les disques imaginatifs de Drosophila (développement d'épithélium dans les larves) permettent la création de cellules pro-tumorales transformées dans un tissu épithélial normal, une situation similaire aux étapes initiales du cancer humain. Cependant, une étude récente de la tumorigénèse dans les disques imaginaux d'ailes de Drosophila a montré que l'initiation de la tumeur dépend de la cytoarchitecture tissulaire-intrinsèque et du microenvironnement local, ce qui suggère qu'il est important de considérer la susceptibilité spécifique à la région aux stimuli tumorigènes dans l'évaluation des phénotypes tumoraux dans l'imaginaire Disques. Pour faciliter l'analyse phénotypique des progrès de la tumeurSur les disques imaginaux, nous décrivons ici un protocole pour les expériences génétiques utilisant le système GAL4-UAS pour induire des tumeurs néoplasiques dans des disques imaginaux d'ailes. Nous introduisons en outre une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes des lésions clonales induites dans les épithéliums imaginaux, car une méthode de classification claire pour discriminer les différentes étapes de la progression de la tumeur (comme l'hyperplasie, la dysplasie ou la néoplasie) n'a pas été décrite auparavant. Ces méthodes pourraient être largement applicables à l'analyse clonale des phénotypes tumoraux dans divers organes de Drosophila .

Introduction

Les tissus épithéliaux sont des systèmes hautement organisés qui ont la capacité homéostatique remarquable de maintenir leur organisation par le développement et le renouvellement cellulaire. Ce système auto-organisé robuste, cependant, est progressivement perturbé lors du développement de la tumeur. Au début du développement de la tumeur, des cellules mutantes individuelles issues de l'activation de l'oncogène ou de l'inactivation du gène suppresseur de tumeur apparaissent dans une couche épithéliale. Lorsque cette «cellule pro-tumorale» transformée évite un environnement suppresseur, perturbe l'organisation épithéliale et commence la prolifération incontrôlée, la tumorigenèse survient 1 . Au cours des dernières décennies, les progrès technologiques exceptionnels en génétique et en biologie moléculaire ont fait des progrès remarquables dans la recherche sur le cancer. En particulier, des études récentes utilisant les outils d'analyse de mosaïque génétique dans Drosophila melanogaster , telles que la recombinaison mitotique recombinante FLP-FRT (recombinant flippase / flippase recombinase)2 et les systèmes flip-out-GAL4-UAS (séquence d'activation en amont) 3 ont grandement contribué à mieux comprendre les mécanismes génétiques impliqués dans la formation et la métastase des tumeurs 4 , 5 , 6 .

Les études d'un groupe de gènes suppresseurs de tumeurs Drosophila conservés, de larves géantes létales ( lgl ), de disques grands ( dlg ) et de griffonnages ( scrib ) ont mis en évidence le lien critique entre la perte d'organisation épithéliale et le développement de la tumeur, car ces gènes jouent des rôles clés Dans la régulation de la polarité des cellules apicales-basales et de la prolifération cellulaire dans les tissus épithéliaux 7 . Alors que les disques imaginatifs de Drosophila sont normalement des épithéliums monocouches, des mutations homozygotes dans l'un de ces trois gènes provoquent une perte de structure et de polarité des cellules, ne parviennent pas à diffuserRentier, surprolifier et, finalement, former des masses amorphes multicouches qui fusionnent avec des tissus adjacents 7 . De même, la rupture de ces gènes chez les mammifères est impliquée dans le développement de tumeurs malignes 8 , 9 . Les phénotypes néoplasiques exposés par les tissus mutants ont conduit à la classification de ces trois gènes comme conservateurs, les gènes suppresseurs de tumeurs néoplasiques (nTSG) 7 , 8 . Cependant, lorsque des cellules mutantes nTSG homozygotes sont générées sporadiquement dans le développement de disques imaginaux de type sauvage en utilisant une recombinaison mitotique médiée par FLP-FRT, les cellules mutantes sont éliminées du tissu par l'apoptose dépendante de la kinase N-terminale c-Jun (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusion 15 , 16 , ou engulfment et phagocytose par voisins 17 . Dans cette épithélium génétiquement mosaïque, l'apoptose est surtout détectée dans les cellules mutantes nTSG situées à la limite des clones, ce qui suggère que les cellules normales adjacentes déclenchent l'apoptose des cellules mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Des études récentes dans des cellules de mammifères ont confirmé que cette élimination dépendante de la cellule des cellules pro-tumorales est un mécanisme d'autodéfense épithélial conservé de manière évolutive contre le cancer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Une étude récente dans les disques imaginatifs de Drosophila , cependant, a montré que les clones de knots de nTSG de mosaïque induisent des tumeurs néoplasiques en spécimensDisques imaginatifs des régions de l'aile 16 . La formation initiale des tumeurs a toujours été observée dans la région périphérique de la «charnière» et n'a jamais été observée dans la région centrale de la poche de l'épithélium du disque d'aile, ce qui suggère que le potentiel tumorigène des cellules knock-nTSG dépend de l'environnement local. La région de la poche centrale fonctionne comme une «tache de tumeur froide» où les cellules pro-tumorales ne présentent pas de prolifération dysplasique, alors que la région charnière périphérique se comporte comme un «hotspot tumoral» 16 . Dans les régions de poche "coldspot", les cellules nTSG-knockdown se délamment du côté basal et subissent une apoptose. En revanche, les cellules de charnière "hotspot" possèdent un réseau de structures cytosquelettiques robustes sur leurs côtés basaux, les cellules knockdowns nTSG se délamment du côté apical de l'épithélium et déclenchent une prolifération tumorigène 16 . Par conséquent, l'analyse des phénotypes tumoraux dans les disques imaginatifs nécessite une attention particulièreDéduction de la susceptibilité spécifique à la région aux stimuli tumorigènes.

Ici, nous décrivons un protocole pour induire une formation de tumeur néoplasique dans les disques imaginaux d'ailes de Drosophila en utilisant le système GAL4-UAS- RNAi par lequel des cellules knock-nTSG sont générées dans des épithéliums à disque d'aile normale. Bien que ces systèmes expérimentaux soient utiles pour étudier les premiers stades du cancer, une méthode de classification claire pour évaluer les étapes de la progression de la tumeur dans les épithéliums de disque imaginal n'a pas été clairement décrite auparavant. Par conséquent, nous proposons également une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes clonaux pro-tumoraux induits dans l'épithélium du disque d'aile en trois catégories: hyperplasie (accumulation d'un nombre excessif de cellules apparaissant normalement avec une prolifération accrue), dysplasie (tissu prémalignant composé d'apparences anormales Cellules) et néoplasies (tumeur bénigne ou maligne composée de cellules ayant un aspect anormal et un modèle de prolifération anormal).

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Protocole

1. Fly Crosses and Clone Induction

  1. Retirez toutes les mouches dans le flacon 12 h avant de collecter les mouches vierges.
  2. Anesthésier les mouches dans le flacon en injectant du CO 2 gaz et placer les mouches sur un coussin de CO 2 .
  3. Transférer 10 à 20 femelles vierges et 10 mâles dans le flacon de CO 2 dans un flacon frais et incuber pendant 1 jour à 25 ° C.
  4. Transférer ces mouches dans un flacon frais et incuber pendant 12 h à 25 ° C.
    REMARQUE: Jeter le premier flacon en tant que femelles vierges ne déposez pas assez d'oeufs au premier jour.
  5. Pour les lignes d'amplificateur-GAL4, enlever les mouches adultes et incuber le flacon à 25 ° C jusqu'à dissection.
  6. Pour l'induction de clones de mosaïque par flip-out-GAL4, retirer les mouches adultes et incuber le flacon pendant 2 à 4 jours à 25 ° C. Le temps d'incubation avant choc thermique dépend du but expérimental. Un choc thermique deux jours après le dépôt des œufs (AED) génère des clones de mosaïque en immature secondeInstar imaginal epithelia. Un choc thermique après 3 ou 4 jours L'AED génère des clones de mosaïque dans des épithéliums imaginaux différenciés de début à mi-troisième stade.
    NOTE: Il est important d'examiner l'effet de la modification du temps de choc thermique sur les phénotypes tumorigènes.
  7. Pour l'induction de clones de mosaïque par flip-out-GAL4, choc thermique du flacon par immersion dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 à 45 minutes, puis incubation pendant 2 à 3 jours à 25 ° C.
    REMARQUE: L'information sur le temps de choc thermique, le temps et le temps d'incubation dans chaque expérience est illustrée dans les légendes des figures.

2. Dissection des larves

  1. Recueillir des larves de troisième stade errant avec un bâton de bois ou une pince serrée, les génotyper par des marqueurs fluorescents appropriés ( p . Ex. , EGFP) sous un microscope stéréoscopique à fluorescence et les placer dans un plat de dissection avec du PBS (solution salée tamponnée au phosphate).
  2. Laver les larves dans le PBS en pipettant avec 2 mL de pipettes de transfert en plastique.
  3. Pincer le centre de la larve avec une pince et déchirer le corps en deux avec l'autre pince.
  4. Pincer le crochet de la bouche de la moitié antérieure avec une pince et pousser la bouche vers le corps avec l'autre pince pour éteindre le corps.
  5. Retirez les matériaux inutiles tels que les glandes salivaires ou les corps gras avec des pinces.

3. Fixation et coloration des anticorps

  1. Transférer la moitié antérieure disséquée du corps larvaire (y compris les disques d'ailes imaginaux) jusqu'à un tube en plastique de 1,5 ml et réparer dans 1 ml de solution Fix (4% de Formaldéhyde dans PBS) pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité avec une rotation douce.
    ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique et présente un potentiel cancérogène. Portez des gants et des vêtements de protection pour éviter tout contact avec la peau.
    REMARQUE: Dans cette partie, toutes les étapes ont lieu sur un nutator à température ambiante dans l'obscurité, sauf indication contraire.
  2. Retirez la solution Fix et laissez-la. Laver les tissus avec 1 ml de PBT (0,3% de TritSur X-100 dans PBS) trois fois pendant 15 minutes chacun.
  3. Retirez le PBT et ajoutez 1 mL de PBTG (albumine de sérum bovin à 0,2% et 5% de sérum de chèvre normal dans PBT) pour bloquer et nuer 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C.
  4. Retirez PBTG et ajoutez une solution d'anticorps primaire diluée de manière appropriée avec PBTG (voir la Table des matériaux ) et nutatez pendant une nuit à 4 ° C.
  5. Retirez la solution d'anticorps primaire et lavez les tissus avec 1 mL de PBT trois fois pendant 15 minutes chacun.
  6. Retirer PBT et ajouter une solution d'anticorps secondaire diluée avec PBTG (1: 400). Nutatez pendant 2 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C.
  7. Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver les tissus avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacun.
  8. Pour tacher l'actine F, retirer PBT et ajouter une solution de Phalloidine diluée de manière appropriée dans du PBS (1:40). Ensuite, interceptez pendant 20 min. Retirez la solution de Phalloidine et lavez les tissus avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacun.
  9. Pour contre-durcir l'ADN nucléaire, éliminer le PBT et ajouter la solution DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) (0,5 μg / mL de DAPI dans PBS). Ensuite, nutez 10 min.
    ATTENTION: DAPI a un potentiel cancérogène. Portez des gants et des vêtements de protection pour éviter tout contact avec la peau.
  10. Retirer la solution DAPI et laver les tissus avec 1 mL de PBT deux fois pendant 15 minutes chacun.
  11. Rincer une fois dans 1 mL de PBS pendant 10 min à température ambiante.
  12. Retirer PBS et ajouter 500 μL de glycérol 100% comme support de pré-montage.

4. Montage sur des lames de microscope

  1. Placez les tissus colorés sur une lame à microscope en utilisant une pipette de transfert de plastique de 2 mL.
  2. Transférer les tissus à des gouttes de milieu de montage sur une autre glissière de microscope avec une pince.
  3. Maintenez enfoncée la fin du tissu disséqué avec une pince et retirez les disques cérébraux et antenaux avec les autres pince.
    REMARQUE: Gardez le cerveau disséqué pour les placer près des disques imaginaux de l'aile. Les cerveaux agissent comme une plate-forme empêchant la lamelle de couper les disques imaginaux de l'aile.
  4. Pour isoler les disques imaginaux de l'aile, maintenez enfoncée la fin du tissu disséqué avec une pince et grattez délicatement la paroi du corps et déchirez les disques avec les autres pinces.
    REMARQUE: s'il est difficile de trouver des disques imaginaux d'ailes, éplucher la trachée du côté postérieur au côté antérieur. Les disques imaginaires de l'aile s'accrochent à la trachée.
  5. Recouvrir doucement les disques imaginaux avec une lamelle et sceller avec un vernis à ongles; Conserver à 4 ° C.

5. Microscopie confocale

  1. Pour acquérir des images confocales à l'aide d'un microscope confocal, des paramètres d'acquisition d'image comprennent une gamme de longueur d'onde d'émission, l'intensité laser, le gain, le décalage, la vitesse de balayage et la taille d'image 24 .
    REMARQUE: pour une procédure détaillée des paramètres d'acquisition d'image, reportez-vous au mode d'emploi fourni par chaque fabricant de microscope.
  2. Pour capturer un seul coSections nfocales d'un disque imaginal d'aile entière, utilisez un objectif objectif 20X.
  3. Acquérir des images tridimensionnelles par balayage de la pile z à une taille de pas de 0,5 à 1,0 μm en utilisant des lentilles 40X ou 60X.
    REMARQUE: pour analyser les phénotypes cellulaires en haute résolution, une taille d'image devrait être supérieure à 512 x 512 pixels.

6. Analyse d'image à l'aide d'ImageJ

  1. Utilisez Fiji, un logiciel ImageJ open source basé sur l'analyse de l'image biologique (https://fiji.sc/) 25 , pour acquérir et analyser les images confocales de la pile z.
  2. Pour acquérir des sections verticales, ouvrez les images de la pile z dans ImageJ et sélectionnez l'option de menu "Image / Stacks / Reslice".
    REMARQUE: L'axe XZ ou l'axe YZ peuvent être sélectionnés dans le menu Reslice. La section verticale peut être obtenue également dans une direction arbitraire en dessinant une droite ou un rectangle sur l'image de la pile z.

7. Diagnostic des phénotypes néoplasiques

  1. Ouvrir la verticaleSections (axe XZ ou YZ) obtenues à partir d'un ensemble d'images de pile z et analyser les phénotypes morphologiques et la coloration des anticorps.
  2. Pour le diagnostic des phénotypes tumoraux, concentrez-vous principalement sur les trois points suivants: (1) si une masse cellulaire, y compris des clones knockdown, s'écarte de la couche épithéliale principale, (2) si la localisation subcellulaire des protéines jonctionnelles est altérée dans cette masse cellulaire , Et (3) si le diamètre de cette masse cellulaire est supérieur à 4 cellules.
  3. Catégoriser les phénotypes tumoraux selon le diagramme décrit dans la figure 1 .

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Résultats

Pour démontrer la formation de tumeur néoplasique induite expérimentalement par NTSG-knockdown médié par RNAi dans des disques imaginaux d'ailes de Drosophila , trois pilotes GAL4 différents ont été utilisés pour exprimer UAS-RNAi pour lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, qui conduit une forte expression d'UAS dans le Poche d'aile et expression douce dans les régions de charnière ( figure 2 et

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Discussion

Le système GAL4-UAS est l'un des outils génétiques les plus puissants pour l'expression des gènes ciblés dans Drosophila 26 et facilite grandement l'induction et l'analyse des cellules tumorales in vivo 4 . Ce système permet de générer des clones portant un knockdown de gènes suppresseurs de tumeurs ou une surexpression d'oncogènes dans un tissu épithélial de type sauvage, une situation très similaire aux stades initiaux du cancer huma...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions J. Vaughen pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 et The Takeda Science Foundation Research Grant to YT

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs
salin tamponné au phosphate (PBS)Wako162-19321
TritonX-100Wako168-11805
FormaldéhydeWako064-00406
albumine sérique bovineSigmaA7906
sérum de chèvre normalSigmaG6767
milieu de montage, VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
souris-anti-Dlg 4F3Etudes développementales Hybridoma Bank4F3 anti-disques grands, RRID :AB_528203diluer dans PBTG, 1:40
souris-anti-MMP1Etudes développementales Hybridoma Bank3A6B4, RRID :AB_5797803 mixte 1:1:1 et dilué dans PBTG, 1:40
souris-anti-MMP1Études développementales Hybridoma Bank3B8D12, RRID :AB_5797813 mélangé 1:1:1 et dilué dans PBTG, souris 1:40-anti-MMP1
Études développementales Hybridoma Bank5H7B11, RRID :AB_5797793 mélangé 1:1:1 et dilué dans PBTG, souris 1:40-anti
-atubulineDéveloppement Etudes Hybridoma BankAA4.3, RRID :AB_579793dilué dans PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 PhalloidinSondes moléculairesA22283diluées dans PBS, 1:40
Anticorps IgG anti-souris de chèvre, Alexa Fluor 546Sondes moléculairesA11030diluées dans PBTG, 1:400
NameCompanyNuméro de catalogueComments
>Fly sspirs
sd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#8609recombiné avec UAS-EGFP
>upd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#26796recombiné avec UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAiVienna Drosophila RNAi center#51247
UAS-scrib-RNAiDrosophila RNAi center#105412
UAS-RasV12Centre de stock de drosophile de Bloomington#64196
UAS-Yki3SACentre de stock de drosophile de Bloomington#28817
hsFLPCentre de stock de drosophile de Bloomington#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)Bloomington Drosophila Stock Center#4780recombiné avec UAS-EGFP
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#5428X chromosome
UAS-EGFPBloomingtonDrosophila Stock Center#6658troisième chromosome
UAS-Dicer2Bloomington Centre de stock de drosophile#24650deuxième chromosome
UAS-Dicer2BloomingtonDrosophila Stock Center#24651troisième chromosome
vkg-GFPMorinet al. 2001Piège à protéines GFP
Vienna

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Disques imaginaux de Drosophilasyst me GAL4 UASinduction tumoralediagnostic tumoralmicroscopie confocaleanalyse ImageJGAL4 Flip outinduction par choc thermiqueclassification des l sions clonalesstadification de la progression tumorale
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