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Article de méthode

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

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DOI :

10.3791/55904

⸱

26 mai 2017

 ,  , 
1College of Pharmacy, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit un protocole basé sur FACS qui permet un isolement facile et simultané des pericètes de type I et de type II provenant des muscles squelettiques.

Résumé

Les pericytes sont des cellules multiperces perivasculaires qui présentent une hétérogénéité dans différents organes ou même dans le même tissu. Dans les muscles squelettiques, il existe au moins deux sous-populations périticées (appelées type I et type II), qui expriment différents marqueurs moléculaires et possèdent des capacités de différenciation distinctes. En utilisant des souris doublement transgéniques NG2-DsRed et Nestin-GFP, les pericytes de type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) et de type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) ont été isolées avec succès. Cependant, la disponibilité de ces souris à double transgénique empêche l'utilisation généralisée de cette méthode de purification. Ce travail décrit un protocole alternatif qui permet l'isolement facile et simultané des pericytes de type I et de type II à partir des muscles squelettiques. Ce protocole utilise la technique de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS) et cible PDGFRβ, plutôt que NG2, avec le signal Nestin-GFP. Après l'isolement, type I et tyPe II pericytes présentent des morphologies distinctes. De plus, les pericytes de type I et de type II isolés avec cette nouvelle méthode, comme ceux isolés des souris doublement transgéniques, sont adipogènes et myogènes, respectivement. Ces résultats suggèrent que ce protocole peut être utilisé pour isoler les sous-populations de péricyte des muscles squelettiques et éventuellement d'autres tissus.

Introduction

La dystrophie musculaire est un trouble musculaire-dégénératif qui n'a jusqu'ici pas de traitements efficaces. Le développement de thérapies qui favorisent la régénération tissulaire a toujours été d'un grand intérêt. La régénération et la réparation des tissus après dommages dépendent des cellules souches / cellules progénitrices résidentes 1 . Les cellules satellites sont des cellules précurseurs myogènes actives qui contribuent à la régénération musculaire 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Leur utilisation clinique, cependant, est entravée par leur migration limitée et leur faible taux de survie après l'injection, ainsi que par leur diminution de la capacité de différenciation après l' amplification in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . En plus de satelliLes muscles squelettiques contiennent également de nombreuses autres populations de cellules avec un potentiel myogénique 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , telles que les cellules interstitielles positives du récepteur du facteur de croissance dérivées des plaquettes (PDGFRβ). Il existe des preuves montrant que les cellules PDGFRβ + dérivées de muscle peuvent se différencier en cellules myogènes et améliorer la pathologie musculaire et la fonction 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . Le PDGFRβ marque principalement les pericytes 21 , qui sont des cellules périvasculaires avec une pluripotence 22 , 23 . En plus de PDGFRβ, de nombreux autres marqueurs, y compris Neuron-Glial 2 (NG2) et CD146, sont également utilisés pour iDentify pericytes 21 . Il convient toutefois de noter qu'aucun de ces marqueurs n'est spécifique à un pericyte 21 . Des études récentes ont révélé deux sous-types de percytes musculaires, appelés type I et type II, qui expriment différents marqueurs moléculaires et réalisent des fonctions distinctes 19 , 24 , 25 . Biochimiquement, les pericytes de type I sont NG2 + Nestin - , tandis que les pericytes de type II sont NG2 + Nestin + 19 , 24 . Fonctionnellement, les pericytes de type I peuvent subir une différenciation adipogène, contribuant à l'accumulation de graisse et / ou à la fibrose, tandis que les pericytes de type II peuvent se différencier le long de la voie myogénique, ce qui contribue à la régénération musculaire 19 , 24 , 25 . Ces résultats démontrent que: (1) les pericytes de type I peuvent bE ciblés dans le traitement des troubles dégénératifs gras / fibrose, et (2) les pericytes de type II ont un grand potentiel thérapeutique pour la dystrophie musculaire. Une étude et une caractérisation plus poussées de ces populations nécessitent un protocole d'isolement qui permet de séparer les pericytes de type I et de type II à un haut niveau de pureté.

À l'heure actuelle, l'isolement des sous-populations de péricyte repose sur les souris doublement transgéniques NG2-DsRed et Nestin-GFP 19 , 24 . La disponibilité des souris NG2-DsRed et la qualité de la plupart des anticorps NG2 limitent l'utilisation généralisée de cette méthode. Étant donné que tous les pericytes NG2 + expriment également le PDGFRβ dans les muscles squelettiques 19 , 20 , 24 , nous supposons que NG2 peut être remplacé par PDGFRβ pour l'isolement des pericytes et de leurs sous-populations. Ce travail décrit un protocole basé sur FACS quiUtilise la coloration PDGFRβ et le signal Nestin-GFP. Cette méthode est moins exigeante pour les chercheurs parce que: (1) il ne nécessite pas l'arrière-plan NG2-DsRed et (2) il utilise des anticorps PDGFRβ disponibles dans le commerce, qui sont bien caractérisés. En outre, il permet l'isolement simultané de pericytes de type I et de type II à haute pureté, ce qui permet d'approfondir la recherche sur la biologie et le potentiel thérapeutique de ces sous-populations de pericyte. Après la purification, ces cellules peuvent être cultivées en culture, et leurs morphologies peuvent être visualisées. Ce travail montre également que les pericytes de type I et de type II isolés en utilisant cette méthode, comme ceux purifiés à partir de souris doublement transgéniques, sont adipogènes et myogènes, respectivement.

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Protocole

Les souris transgéniques Wildtype et Nestin-GFP ont été logées dans l'établissement animal de l'Université du Minnesota. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'Université du Minnesota et étaient conformes au Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Dissection musculaire et isolement monocellulaire

  1. Euthanaser des souris adultes (6 à 10 semaines, hommes et femmes) avec du tribrométhanol (250 mg / kg, ip) et stériliser leur peau d'abdomen avec 70% d'éthanol.
    NOTE: On a utilisé du tribrométhanol à la place de la kétamine pour l'anesthésie / euthanasie, car on sait que la kétamine interagit avec les récepteurs NMDA, ce qui pourrait avoir un impact sur l'étude.
  2. Placez les souris en position couchée et utilisez un scalpel pour faire une incision horizontale sur la peau abdominale. Éloignez la peau à la main, en tirant dans des directions opposées pour exposer les muscles des membres postérieurs.
  3. CollecteT les muscles des membres postérieurs à l'aide de pinces et de ciseaux. Conservez-les dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) additionnée de 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) sur de la glace.
  4. Laver les muscles de la peau arrière disséqués dans du PBS glacé additionné de 1% de P / S deux fois et les transférer dans une plaque stérile de 10 cm.
  5. Nettoyer soigneusement les nerfs, les vaisseaux sanguins et le tissu conjonctif des muscles à l'aide de pinces et de ciseaux sous un microscope à dissection à un grossissement de 2X.
  6. Couper finement et hacher les muscles en petits morceaux (1-2 mm 3 ) à l'aide de ciseaux stériles et de lames. Si nécessaire, ajoutez une petite quantité de milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco pour vous assurer que les muscles ne sont pas séchés.
  7. Décomposer mécaniquement le tissu en pipetant vers le haut et vers le bas à travers une pipette sérologique de 10 mL 10 fois.
  8. Ajouter la solution de digestion fraîchement préparée (DMEM complétée avec 0,2% de collagénase de type 2) au mélange. Incuber à 37 ° C pendant 2 h avec gentlE agitation à 35 tours / min.
  9. Triturer avec une aiguille 18 G pour homogénéiser le mélange. Ensuite, centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant, puis remettre à nouveau le culot dans 0,25% de trypsine / EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 10 min. Répétez l'étape de centrifugation deux fois de plus.
  10. Ajouter 10 mL de DMEM additionné de 20% de sérum bovin fœtal (FBS) à la solution et centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans un tampon de lyse des globules rouges (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM et EDTA 0,1 mM).
  11. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans le tampon de tri (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM et 1% de BSA dans du PBS exempt de Ca / Mg 2 + , pH 7,0). Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 40 μm pour obtenir une suspension à une seule cellule.
  12. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 1 ml de tampon de tri.
  13. Compte leNuméro de cellule avec un hémocytomètre et diluer la suspension monocellulaire à 5 x 10 6 / mL dans le tampon de tri.

2. Coloration et tri des cellules

  1. Préparez les contrôles et l'échantillon comme décrit dans le tableau 1 . Tacher la suspension à une seule cellule avec les anticorps respectifs sur de la glace pendant 30 min, comme décrit dans le tableau 1 .
  2. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min et laver les pastilles deux fois avec un tampon de tri.
  3. Ajouter DAPI aux solutions monocellulaires, comme indiqué dans le Tableau 1. Utiliser DAPI (concentration finale) 5 μg / mL pour le contrôle DAPI à une seule couleur et DAPI 1 μg / mL pour le contrôle PDGFRβ-PE-FMO et l'échantillon. Gardez tous les tubes sur la glace tout au long de l'expérience.
  4. Activez le trieur et le logiciel. Numérisez et insérez une puce de tri de 100 μm lorsque vous y êtes invité.
  5. Effectuer la configuration automatique ( c.-à-d. L' alignement des copeaux, l'étalonnage des gouttelettes, l'étalonnage du flux latéral et le calibrage du délai de triOn) en chargeant les perles de configuration automatique lorsqu'elles sont invitées.
  6. Une fois la configuration automatique terminée, accédez à l'onglet "Expérience", cliquez sur "Nouveau" et sélectionnez "Modèle vierge" dans "Modèles publics".
  7. Sous «Paramètres de mesure», entrez «DAPI» pour «FL1», «Nestin-GFP» pour «FL2» et «PDGFRβ» pour «FL3». Décochez les cases pour «FL4» - «FL6».
  8. Cochez les cases pour activer les lasers 405, 488 et 561 et cliquez sur "Créer une nouvelle expérience".
  9. Sélectionnez l'option "Start Compensation Wizard" et suivez les instructions du logiciel "Compensation Wizard" pour configurer la compensation.
    1. Chargez le contrôle non contrôlé et cliquez sur "Démarrer". Cliquez sur "Détecteur et paramètres de seuil" et ajustez le gain du capteur des détecteurs FSC et BSC pour placer la population sur la balance.
    2. Un dJuste les niveaux de gain des canaux de fluorescence FL1-FL3 pour placer les populations négatives sur le côté gauche des histogrammes. Cliquez sur le bouton "Enregistrer" pour enregistrer les données.
    3. Chargez les commandes mono-couleur une par une lorsque vous y êtes invité. Cliquez sur "Démarrer et Enregistrer" pour enregistrer les données. Ajustez les portes pour les populations positives sur les histogrammes. Cliquez sur Suivant."
    4. Passez à "Calculer la matrice" dans l'onglet "Compensation" et cliquez sur "Calculer" dans le panneau "Calculer les paramètres de compensation" pour effectuer la compensation. Cliquez sur "Terminer" pour quitter le "Assistant de compensation".
  10. Chargez le contrôle PDGFRβ-PE-FMO et cliquez sur "Démarrer". Dessinez une porte de polygone (Gate A) autour des cellules d'intérêt sous la trame "Tous les événements".
  11. Double-cliquez à l'intérieur de la porte A pour créer un tracé enfant. Changez l'axe Y en DAPI et dessinez une porte polygone (Gate B) autour des cellules live (DAPI low ). Double-cliquez sur iNside Gate B pour créer un tracé d'enfant. Modifiez l'axe X sur FSC-H et l'axe Y sur FSC-W et dessinez une porte polygone (Gate C) autour des single pour éliminer les doublets.
  12. Double-cliquez à l'intérieur de la porte C pour créer un tracé enfant. Modifiez l'axe X à Nestin-GFP et à l'axe Y à PDGFRβ-PE. Cliquez sur le bouton "Enregistrer" pour enregistrer les données.
  13. Chargez l'échantillon et répétez les étapes 2.11-2.12. Après l'enregistrement, cliquez sur "Pause" pour conserver l'échantillon.
  14. Définissez les limites de gating pour les cellules PDGFRβ + et Nestin-GFP + en fonction du contrôle PDGFRβ-PE-FMO. Dessinez des portes pour les populations PDGFRβ + Nestin-GFP et PDGFRβ + Nestin-GFP + .
  15. Sous "Méthode de tri", sélectionnez "Tubes bidirectionnels" et affectez les cellules "PDGFRβ + Nestin-GFP - " et "PDGFRβ + Nestin-GFP + " aux tubes collecteurs gauche et droit, reDe façon spectaculaire. Montez les tubes collecteurs remplis de tampon de tri de triage à l'étape de la collecte et cliquez sur le bouton "Charger la collection".
  16. Cliquez sur le bouton "Reprendre" pour garder l'exemple en cours d'exécution. Cliquez sur "Démarrer le tri" pour collecter les cellules PDGFRβ + Nestin-GFP - (type I pericytes) et PDGFRβ + Nestin-GFP + (type II pericytes).

3. Analyses post-tri

  1. Centrifuger les cellules triées à 500 xg pendant 5 min, renvoyer la pastille dans 1 mL de milieu pericyte (voir la Table des matériaux ) et compter la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre.
  2. Périphériques de type I et type II sur les lamelles coulées en poly-D-lysine (PDL) à ~ 1 x 10 4 cellules / cm 2 . Cultiver en milieu pericyte pendant 3 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2 .
  3. Le jour 3, examinez la morphologie du percyte (sous contraste de phase) et l'expression endogène de Nestin-GFP en utilisant un micro fluorescentPortée (laser d'excitation: 488 nm, filtre d'excitation: 470/40 nm et filtre d'émission: 515/30 nm). Prenez des images sous un objectif 20X (0,45 NA).
  4. Remplacer le milieu pericyte par un additif adipogène (moyen de base MSC basal + additif immunogène adipogène) et myogénique (DMEM + 2% de sérum de cheval) pour initier la différenciation adipogène et myogénique, respectivement, comme décrit précédemment 20 . Changer le support tous les 2-3 jours.
  5. Réparez les cellules le jour 17 (14 jours après la différenciation adipogène / myogénique) dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 20 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Attention, le PFA est cancérogène.
  6. Effectuer une immunocytochimie contre la périlipine (marqueur adipocytaire) et S-myosine (myotube mûr / marqueur de myofibres), comme décrit dans les publications précédentes 19 , 20 .
    1. Laver les cellules fixes 3 fois dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
    2. Ajouter un tampon de blocage (PBSSupplémenté avec 5% de sérum d'âne, 3% de BSA et 0,3% de Triton X-100) et incuber à température ambiante pendant 1 h.
    3. Incuber les cellules avec des anticorps anti-perilipine (2 μg / mL) et / ou anti-S-myosine (2 μg / mL) à 4 ° C pendant une nuit.
    4. Laver les cellules 3 fois dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
    5. Incuber les cellules avec des anticorps Alexa 555 anti-lapin (4 μg / mL) et / ou Alexa555 anti-souris (4 μg / mL) à température ambiante pendant 1 h.
    6. Laver les cellules 3 fois dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
    7. Monter les cellules immunostained avec un support de support contenant DAPI (voir la table des matériaux). Examiner l'expression de la périlipine et de la S-myosine à l'aide d'un microscope fluorescent (laser d'excitation: 543 nm, excitation 540/45 nm et émission 600/50 nm) et prendre des images sous un objectif 40X (0,60 NA).

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Résultats

Les paramètres FACS, y compris l'intensité laser et la compensation de canal, sont corrigés en fonction des résultats des contrôles non contrôlés et des contrôles à une seule couleur. La commande PDGFRβ-PE-FMO sert à régler le déclenchement de la population de PDGFRβ-PE + ( Figure 1A ). Parmi les cellules PDGFRβ-PE, deux populations représentant les cellules Nestin-GFP + et Nestin-GFP sont clairement séparées ( ...

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Discussion

Les pericytes sont des cellules perivasculaires multipotentes 22 , 23 situées sur la surface abluminal des capillaires 21 , 26 . Dans les muscles squelettiques, les pericytes peuvent se différencier selon les voies adipogènes et / ou myogènes 19 , 20 , 24 . Des études récentes ont révélé deux sous-populations de...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été partiellement soutenu par une subvention de Fund-A-Fellow de la Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) et la Subvention de développement scientifique de l'American Heart Association (16SDG29320001).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Trieur de cellulesSonySH800
Réglage automatique PerlesSonyLE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin  ;SigmaT48402
Milieu de croissance des péricytesScienCell1201
MSC Milieu basal (souris)Stemcell Technologies5501
Supplément de stimulation adipogénique (souris)Stemcell Technologies5503
Sérum de bovin fœtalGibco16000
Sérum de chevalSigmaH1270
Collagénase de type 2WorthingtonLS004176
0,25 % Trypsine/EDTA  ;Gibco25200
Pénicilline/StreptomycineGibco15140
PDLSigmaP6407
PDGFR&beta ;-PE AnticorpseBioscience12-1402
Perilipin AnticorpsSigmaP1998
S-Myosin AnticorpsDSHBMF-20
Alexa 555-anti-lapin Anticorps nbsp ;ThermoFisher ScientificA-31572
Alexa 555-anticorps anti-sourisThermoFisher ScientificA-31570
Milieu de montage avec DAPIVector LaboratoriesH-1200
DAPIThermoFisher ScientificD1306
HEPESGibco15630
EDTAFisherBP120
BSASigmaA2058
NH4ClFisher ScientificA661
KHCO3Fisher ScientificP184
PBSGibco14190
Aiguilles 18 GBD305196
10 mL Pipette sérologiqueBD357551
OneComp eBeadseBioscience01-1111

Références

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