Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

Résumé

Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.

Résumé

Les mécanismes régulant la traduction de l’ARNm sont impliqués dans divers processus biologiques, tels que le développement des lignes germe, la différenciation cellulaire et organogenèse, ainsi que dans plusieurs maladies. Convaincante, nombreuses publications ont montré que des mécanismes spécifiques réglementent étroitement traduction de l’ARNm. Un intérêt accru dans la régulation induite par la traduction de l’expression protéique a conduit à l’élaboration de nouvelles méthodes pour étudier et suivre de novo protéine synthèse en cellulo. Cependant, la plupart de ces méthodes est complexe, ce qui les rend plus coûteux et souvent limitant le nombre de cibles ARNm qui peuvent être étudiés. Cet article propose une méthode qui nécessite seulement de base réactifs et un système d’imagerie confocal fluorescence de mesurer et de visualiser les changements en traduction de l’ARNm qui se produisent dans n’importe quelle ligne de la cellule dans diverses conditions. Cette méthode a récemment été utilisée pour montrer la traduction localisée dans les structures subcellulaires des cellules adhérentes sur une courte période de temps, offrant ainsi la possibilité de visualiser de novo traduction pendant une courte période au cours de diverses biologiques processus ou de validation des modifications dans l’activité traductionnelle en réponse à des stimuli spécifiques.

Introduction

La régulation de la traduction par différentes fonctions cellulaires a incité de nombreuses équipes de recherche pour développer de nouveaux outils et méthodes pour déterminer la localisation subcellulaire de traduction de l’ARNm et de protéines réglementé synthèse^{1,2 ,3,4}. Ces progrès technologiques récents permettent une meilleure compréhension des mécanismes impliquant upregulation de traduction ou de la répression des ARNm spécifiques au cours de processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et l....

Protocole

1. détermination des Conditions de Puromycilation

Remarque : cette technique décrit la méthode utilisée pour évaluer une traduction localisée au cours de la MRC-5 cell adhesion processus ⁵. Comme puromycilation peut être fait dans n’importe quelle cellule, il est important d’optimiser les conditions de puromycilation pour les lignées de cellules spécifiques à utiliser, parce que les conditions de traitement ne sont pas identiques pour chaque ligne de la cellule en fonction de la concentration de la puromycine et le désiré temps d’incubation. Pour montrer comment ces conditions sont définies, trois lignées de cellule....

Résultats

Pour précisément observer les événements de traduction à l’aide d’incorporation de la puromycine, il est essentiel de déterminer les conditions optimales pour chaque lignée cellulaire car chacun montre différents puromycine incorporation cinétique (Figure 1)^{9,11 ,12,18}. Par conséquent, afin de valider l’incorporation de la puromyci.......

Discussion

Les progrès technologiques récents ont permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’upregulation translationnelle ou la répression d’ARNm spécifiques dans des processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase. La méthodologie économique décrite ici permet aux événements de traduction à visualiser dans les cellules afin d’étudier comment les protéines de liaison à l’ARN régulent les processus métastatiques, tels que l’adhésion cellulaire, la migrat.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM		wisent 319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin Anticorps 12D10	EMD Millipore		MABE343 Western blot dilution 1:25 000 Dilution par immunofluorescence 1:10 000
IgG anti-souris, HRP Signalisation	cellulaire anticorps technologie	7076	dilution par transfert western 1:8 000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
IgG anti-souris (H+L), F(ab')2 Fragment (conjugué Alexa Fluor 488)	technologie de signalisation cellulaire	4408	dilution d’immunofluorescence 1:400
CF568 Phalloïdine	biotium	00044	immunofluorescence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µ ; g/ml concentration finale
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)	Invitrogen	D1306	concentration finale 1µ ; g/ml
Puromycine	bio-Basic	PJ593	2.5µ ; g/ml à 10µ ; g/ml
Ibidi µ ;-Dish 35 mm, haut, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cellules	ATCC	CCL-171
HeLa cellules	ATCC	CCL-2
Huh-7	cellules du Dr. Mazroui (Université ; Laval)
Fv1000	olympus	d’imagerie confocale
Fiji logiciel			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldéhyde 37 % Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Bioréactifs	BP337-500