Numérisation Retroviral: Mapping des sites d&#39;intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

Oriana Romano; Ingrid Cifola; Valentina Poletti; Marco Severgnini; Clelia Peano; Gianluca De Bellis; Fulvio Mavilio; Annarita Miccio

doi:10.3791/55919

Article de méthode

Numérisation Retroviral: Mapping des sites d'intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

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DOI :

10.3791/55919

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28 mai 2017

Oriana Romano¹^,² , Ingrid Cifola³ , Valentina Poletti⁴ , Marco Severgnini³ , Clelia Peano³ , Gianluca De Bellis³ , Fulvio Mavilio¹^,⁴ , Annarita Miccio¹^,²^,⁴^,⁵

¹Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, ²Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, ³Institute for Biomedical Technologies, CNR, ⁴Généthon, ⁵Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration des vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney dans les cellules humaines.

Résumé

Les vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney (MLV) s'intègrent principalement dans les agents améliorant et promoteurs acétylés. Pour cette raison, les sites d'intégration mLV peuvent être utilisés comme marqueurs fonctionnels des éléments réglementaires actifs. Ici, nous présentons un outil de balayage rétroviral, qui permet l'identification du génome des amplificateurs et des promoteurs spécifiques de cellules. En bref, la population de cellules cibles est transduit avec un vecteur dérivé de mLV et l'ADN génomique est digéré avec une enzyme de restriction souvent coupante. Après ligature de fragments génomiques avec un lieur d'ADN compatible, la réaction en chaîne par polymérase (LM-PCR) médiée par un lieur permet l'amplification des jonctions génome virus-hôte. Un séquençage massif des amplicons est utilisé pour définir le profil d'intégration de mLV en fonction du génome. Enfin, des grappes d'intégrations récurrentes sont définies pour identifier les régions réglementaires spécifiques aux cellules, responsables de l'activation des programmes de transcription spécifiques aux cellules.

p. Ex. Cellules souches somatiques) qui manquent de marqueurs robustes pour l'isolement prospectif.

Introduction

L'identité cellulaire est déterminée par l'expression d'ensembles spécifiques de gènes. Le rôle des éléments cis-régulateurs, tels que les promoteurs et les amplificateurs, est crucial pour l'activation de programmes de transcription spécifiques au type cellulaire. Ces régions réglementaires sont caractérisées par des caractéristiques spécifiques de la chromatine, telles que les modifications particulières des histones, les facteurs de transcription et la liaison des co-facteurs, et l'accessibilité à la chromatine, qui ont été largement utilisés pour leur identification à l'échelle du génome dans plusieurs types de cellules ^1....