Modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection du postconditionnement acide contre l'ischémie cérébrale

Résumé

Le postconditionnement acide protège contre l'ischémie cérébrale. Nous présentons ici deux modèles pour exécuter APC. Ils sont obtenus respectivement en transférant des tranches corticostriatales à un tampon acide après une privation d'oxygène-glucose in vitro et en inhalant 20% de CO ₂ après l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne in vivo .

Résumé

L'AVC est l'une des principales causes de mortalité et d'invalidité dans le monde, avec des approches thérapeutiques limitées. En tant que stratégie endogène pour la neuroprotection, les traitements de post-conditionnement se sont révélés être des thérapies prometteuses contre l'ischémie cérébrale. Cependant, des procédures compliquées et des problèmes potentiels de sécurité limitent leur application clinique. Pour surmonter ces inconvénients, nous avons développé un postconditionnement acide (APC) comme thérapie pour l'ischémie cérébrale focale expérimentale. L'APC se réfère au traitement d'acidose doux par inhalation de CO ₂ lors de la reperfusion suite à une ischémie. Nous présentons ici deux modèles pour exécuter APC in vitro et in vivo , respectivement. Le traitement contre la perte de glucose de l'oxygène (OGD) des souris et l'occlusion corticostriatale et l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) ont été utilisés pour imiter l'ischémie cérébrale. L'APC peut être simplement réalisée en transférant des tranches de cerveau à un tampon acide tamponné avec 20% de CO ₂ , oR par des souris inhalant 20% de CO ₂ . L'APC a montré des effets protecteurs importants contre l'ischémie cérébrale, comme en témoigne la viabilité tissulaire et le volume d'infarctus du cerveau.

Introduction

L'accident vasculaire cérébral est l'une des principales causes de mortalité et d'invalidité dans le monde entier. De grands efforts ont été déployés pour trouver des traitements efficaces pour les accidents vasculaires cérébraux au cours des dernières décennies, mais la réalisation est assez insatisfaisante. Le postconditionnement est un processus manipulé par des contraintes subtoxiques suite à un épisode ischémique. Le postconditionnement, y compris le postconditionnement ischémique, hypoxique, à faible taux de glucose et à distance ischémique, déclenchent des mécanismes adaptatifs endogènes et se sont révélés être des thérapies prometteuses contre l'ischémie cérébrale ^{1 , 2 , 3 , 4} . Cependant, le postconditionnement ischémique peut entraîner des blessures supplémentaires. Le postconditionnement ischémique à distance des membres nécessite généralement plusieurs cycles d'occlusion et de reperfusion de 5 à 20 min sur les membres postérieurs ipsilatéraux ou bilatéraux ^{5 , 6 , 7} . ThPar conséquent, ces manipulations de post-conditionnement sont dangereuses ou peu pratiques dans la pratique clinique. Pour surmonter ces inconvénients, nous avons développé APC comme thérapie pour l'ischémie cérébrale focale chez la souris ⁸ . Induite simplement en inhalant 20% de CO ₂ , l'APC réduit considérablement les lésions cérébrales ischémiques d'une manière plus réalisable et plus sûre. Récemment, nous avons prouvé que l'APC étend la fenêtre de reperfusion, soulignant la signification de l'APC pour la thérapie vasculaire ⁹ .

Nous présentons ici deux modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection de l'APC contre l'ischémie cérébrale. Le premier est le modèle de perte d'oxygène-glucose (OGD) dans les tranches corticostriatales de souris. La préparation et le transfert rapides des tranches de cerveau dans un environnement artificiel, généralement le fluide céphalo-rachidien artificiel (ASCF), peuvent maintenir la viabilité cellulaire et les circuits neuronaux, ce qui permet d'étudier la fonction cérébrale in vitro ^{10 , 11 . OGD dans ASCF imite l'ischémie cérébrale et induit une lésion ischémique 12 , 13 , 14 . Après OGD, les tranches de cerveau sont rafraîchies dans ASCF régulier (r-ASCF) pour fournir une reperfusion et ensuite traité avec APC en utilisant de l'acide ASCF bouillonné avec 20% de CO ₂ . La tranche corticostriatale maintient la caractérisation histologique intacte par rapport aux cellules cultivées primaires.}

Pour étudier la fonction cérébrale in vivo , on emploie le modèle d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne de la souris (MCAO). L'artère cérébrale moyenne est bloquée en insérant un monofilament floué par flamme par l'artère carotide commune. Comme l'un des modèles d'AVC les plus largement utilisés, le modèle MCAO présente une pertinence clinique et l'application d'un monofilament facilite l'obtention de reperfusion. Tout simplement en inhalant des gaz mixtes normoxiques contenant 20% de CO ₂ après le début du reperfusioN, l'APC a montré des effets protecteurs significatifs contre l'ischémie cérébrale indiquée par des volumes réduits d'infarctus cérébral.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées et conduites conformément aux directives éthiques du Comité d'expérimentation animale de l'Université du Zhejiang et étaient en totale conformité avec le Guide National des Instituts de Santé pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Des efforts ont été faits pour minimiser toute douleur ou inconfort, et le nombre minimal d'animaux a été utilisé.

1. OGD des tranches Corticostriatales

1. Préparation de la solution:
   1. Préparer 1000 mL r-ACSF (124 mmol / L, NaCl, 5 mmol / L de KCl, 1,25 mmol / L KH ₂ PO _4, 2 mmol / L MgSO _4, 26 mmol / L de NaHCO _3, 2 mmol / L de _CaCl2, 10 mmol / L de glucose, pH final 7,4). Bulle avec 5% de CO ₂ et 95% de O ₂ tout au long de l'expérience.
   2. Préparez 200 mL d'ACSF sans glucose (gf-ACSF) comme ci-dessus, mais à l'exclusion du glucose, faites barboter avec 5% de CO ₂ et 95% de N ₂ . Faire passer les gaz pendant 30 min avant d'appliquer à brAin slices pour réduire la teneur en oxygène dans la solution. Continuez à bouillonner jusqu'à ce que la procédure OGD soit terminée.
   3. Préparez l'ACSF acide (a-ACSF) en équilibrant 200 mL de r-ACSF avec 20% de CO ₂ et 80% de O ₂ . Faire passer les gaz pendant 30 minutes avant d'appliquer sur des tranches de cerveau pour réduire le pH de la solution à pH 6,8 et continuer à bouillonner jusqu'à ce que la procédure APC soit terminée.
   4. Placez trois supports de tissu dans le r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF, respectivement.
2. Préparation de la tranche de cerveau:
   Note: Des souris mâles C57Bl / 6J de 8 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les animaux ont été logés sous une température contrôlée (22 ± 2 ° C), avec une période de cycle de lumière de 12 h et l'accès aux aliments granulés et à l'eau.
   1. Sacrifiez une souris avec une overdose d'isoflurane dans une chambre d'induction. Décapiter la souris. Dissecez le cerveau à l'aide de petits ciseaux et pinces. Retirez le cerveau avec une mince spatule et déposez-le soigneusement dans un bécher en verre avecLe r-ACSF refroidi à la glace avec du 5% de CO ₂ et 95% de O ₂ .
      REMARQUE: ces étapes doivent être effectuées aussi rapidement que possible de manière méticuleuse.
   2. Garder le cerveau dans le r-ACSF glacé pendant 5 min. Ajustez la pression du gaz pour éviter les mouvements du cerveau.
   3. Placez la pâte cryoprécipitée sur la plaque vibratome en deux bandes. Mettez un morceau d'agarose à 3% sur la bande de colle de la lame pour supporter le cerveau.
   4. Inverser une boîte de Petri de 10 cm sur de la glace, puis mettre un papier filtre sur le plat. Humidifiez le papier filtre avec des gouttes de r-ACSF glacées.
   5. Transférer le cerveau au papier filtre avec une pince. Coupez le pôle frontal et le cervelet avec la lame et la pince.
      REMARQUE: Les sections transversales doivent être aussi lisses que possible et plan vertical à sagittal.
   6. Placez le tissu cérébral restant verticalement sur l'autre bande de colle et gardez le cerveau appuyé contre l'agarose. Ajouter le r-ACSF glacé au réservoir de coupe pourImmerger le cerveau et ajouter de la glace à la zone du support de glace. Gardez le r-ACSF dans le réservoir bouillonné avec 5% de CO ₂ et 95% de O ₂ .
   7. Relevez le réservoir et ajustez la position du rasoir pour placer le rasoir aussi près du cerveau que possible et juste au-dessus du cerveau.
   8. Choisissez le mode "CONT" pour découper en continu les sections cérébrales. Réglez l'épaisseur de coupe à 400 μm, la fréquence vibrante à 6 - 8 et la vitesse à 3 - 4. Appuyez sur le bouton "start / stop" pour démarrer la coupe automatique.
   9. Couper la pointe d'une pipette Pasteur de 3 mL pour faire une ouverture correspondant à la taille des tranches de cerveau.
      REMARQUE: L'ouverture doit être suffisamment grande pour éviter d'endommager les tranches de cerveau.
   10. Dessinez cinq tranches de cerveau une par une avec la pipette de pointe et passez-les dans le porte-mouchoirs dans du r-ACSF glacé avec 5% de CO ₂ et 95% de O ₂ . Ne pas collecter la première tranche produite. Ajuster la pression du gaz à avoiD mouvements des tranches de cerveau.
       NOTE: Les tranches de cerveau ne doivent pas se couvrir.
   11. Placer les tranches de cerveau avec le r-ACSF à température ambiante pendant 30 min puis à 37 ° C dans un bain d'eau pendant encore 10 minutes pour récupérer les fonctions synaptiques.
3. OGD et APC:
   1. Placez gf-ACSF et a-ACSF dans un bain-marie à 37 ° C et bulle les tampons avec les gaz correspondants mentionnés ci-dessus en 1.1.2 et 1.1.3 pendant 30 min.
   2. Laissez une tranche dans le r-ACSF comme un contrôle. Transférer soigneusement les quatre autres tranches de cerveau dans le porte-tissu avec du gf-ACSF préchauffé et incuber pendant 15 minutes. Transférez les tranches dans le porte-tissu dans le r-ACSF pour obtenir une reperfusion.
   3. Pour étudier la fenêtre temporelle d'APC, transférez une tranche directement de gf-ACSF à a-ACSF. Transférer les trois autres tranches au r-ACSF d'abord, puis transférer deux sur le porte-tissu dans a-ACSF 5 et 15 min après reperfusion respectivement.
   4. IncubatE les deux tranches dans a-ACSF pendant 3 min, puis les transférer vers le r-ACSF. Incuber les trois tranches dans le r-ACSF pendant 1 heure supplémentaire. Réglez les tranches restantes dans r-ACSF en tant que groupe OGD.
   5. Pour une étude de réponse à la dose, transférez les quatre tranches au support de tissu dans le r-ACSF d'abord après OGD et incubez pendant 5 minutes. Ensuite, laissez une tranche dans r-ACSF comme groupe OGD et transférez les trois autres tranches à un-ACSF. Incuber les tranches dans a-ACSF pendant 1, 3 et 5 min respectivement, puis les transférer à r-ACSF. Incuber les trois tranches dans le r-ACSF pendant 1 heure supplémentaire.
4. Détermination de la viabilité des coupes:
   1. Préparer 0,25% de solution saline normale de chlorhydrate de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC). Ajouter 1,25 g de poudre TTC à 500 ml de solution saline normale.
      REMARQUE: Après la dissolution complète de la poudre, transférer la solution dans une plaque de 24 puits (500 μL par puits) recouverts de papier et l'entreposer à 4 ° C. Le TTC et les tissus teints avec TTC sont légersSitif.
   2. Transférer les tranches dans une plaque de 24 puits (une tranche par puits) contenant une solution de TTC et étirer la tranche dans la solution. Incuber les tranches dans une solution de TTC à 37 ° C dans un bain d'eau peu profonde pendant 30 min.
   3. Transférer les tranches dans des tubes de centrifugation propres de 1,5 mL recouverts de feuille et mesurer le poids sec des tranches.
   4. Ajouter de l'éthanol / diméthylsulfoxyde (1: 1) dans les tubes centrifuges (v: w = 10: 1) pour extraire le formazan. Incuber les tranches dans de l'éthanol / diméthylsulfoxyde à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 24 h.
   5. Ajouter tout l'éthanol / diméthylsulfoxyde dans les tubes dans une plaque à 96 puits et mesurer l'absorbance à 490 nm par un lecteur de plaques.
   6. Normaliser l'absorbance sur le poids sec de la tranche et exprimer la viabilité en tant que pourcentage de tranche de contrôle.

2. MCAO

1. Préparation:
   1. Désinfectez l'établi, la surface du flux laser DopplerY (LDF) et ses accessoires avec 70% d'alcool éthylique.
   2. Préparer des instruments autoclavés: deux ciseaux, 10 cm; Deux pinces, 10 cm; Une pinceau ophtalmique, 11 cm; Un ciseau micro-ophtalmique, 9 cm; Une bride microventeuse, 1,8 cm; Entraînement en ligne, r 12,5 cm; Plusieurs sutures chirurgicales (△ 1/2 4 × 10); cotons-tiges.
   3. Préparez une seringue (sans aiguille) avec une solution saline pour maintenir une zone d'opération hydratée.
   4. Préparez le gaz anesthésique (100% O ₂ + isoflurane).
2. Détection du flux sanguin du cerveau:
   1. Configurez l'instrument LDF.
   2. Injecter des analgésiques par voie intrapéritonéale dans la souris: metamizol 200 mg / kg, carprofène 4 mg / kg et buprénorphine 0,1 mg / kg.
   3. Placez la souris dans une chambre d'induction avec 4% d'isoflurane dans de l'oxygène pour l'anesthésier jusqu'à ce que le mouvement spontané du corps et les vibrations s'arrêtent.
   4. Placez la souris dans une position propice avec son nez monté dans la pièceE cône de nez et maintenir l'isoflurane à 1,5% pour la procédure suivante.
   5. Appliquer une pommade oculaire sur dexpanthenol sur les deux yeux.
   6. Désinfectez la tête avec 70% d'alcool éthylique.
   7. Faites une incision correcte de la peau par les yeux et les oreilles en utilisant un scalpel pour exposer le bregma.
   8. Frottez le crâne avec du coton stérile.
   9. Appliquer une à deux gouttes de colle chirurgicale sur la surface du crâne.
   10. Placez la pointe de la sonde à fibre optique 5 mm caudale à la bregma et 6 mm latérale à la ligne médiane.
   11. Commencez à enregistrer le flux sanguin sur le logiciel. Attendez jusqu'à ce qu'il y ait une base de débit sanguin stable, puis appliquez un catalyseur de 20 μL sur la colle pour réparer la sonde.
       REMARQUE: une ligne de base idéale devrait être supérieure à 500 flux.
   12. Si la ligne de base est inférieure à 200 flux, ajustez la position finement pour obtenir une ligne de base appropriée. Gardez la sonde attachée au crâne pour la durée de l'expérience.
   13. Désinfectez la tête avec iodophor afLa sonde à fibre optique est attachée.
3. MCAO:
   1. Placez et réparez la souris anesthésiée (avec une sonde LDF attachée à son crâne) en position couchée et maintenez sa température corporelle à l'aide d'une lampe chauffante pendant toute la chirurgie. Désinfectez le cou avec de l'alcool éthylique à 70%.
   2. Faire une incision cutanée paramédic dans le cou en utilisant un scalpel; Dissimuler les tissus mous avec des pinces pour exposer les vaisseaux. Ajouter une goutte de solution saline aux tissus exposés pour les garder au frais.
   3. Dissectionnez l'artère carotide commune du tissu environnant et du nerf vague en utilisant des pinceaux ophtalmiques. Veillez à ne pas endommager le nerf vague. Désinfecter la peau du cou avec de l'iodophor après avoir exposé l'artère carotide commune.
   4. Placez une pince microventeuse à l'extrémité distale de l'artère carotide commune, puis attachez un noeud mort avec des sutures de soie 6-0 à l'extrémité proximale. Placez la pince aussi près que possible pour les opérations ultérieures. Veillez à ce que la longueur deLe navire entre la pince et le noeud mort est aussi long que possible pour les opérations ultérieures.
   5. Faire une suture temporaire proximale à la pince en attachant un noeud lâche. Assurez-vous qu'il y a suffisamment d'espace entre deux noeuds pour l'insertion de monofilaments.
   6. Faire une petite incision longitudinale entre les deux noeuds avec des ciseaux micro-ophtalmiques. Assurez-vous que l'incision est aussi proche du nœud mort que possible pour les opérations ultérieures. Veillez à ne pas couper le navire.
   7. Insérez un monofilament à 12 mm à l'aide d'une incision pour entrer dans la lumière de l'artère et avancez-le quelques millimètres. Serrer le noeud lâche autour de la pointe du monofilament, puis retirer la pince.
   8. Prévoyez le filament dans l'artère carotide interne (10 mm pour occluser l'artère cérébrale moyenne) avec des pinces ophtalmiques jusqu'à ce que le logiciel LDF affiche une forte baisse (> réduction de 80% du débit sanguin de base) dans le flux sanguin. Enregistrez l'heure de début de l'occlusion.
      REMARQUE: l'installation de l'instrument LDF estDécrit dans la section 2.2.
   9. Occlure l'artère cérébrale moyenne pendant 1 h. Couper la sonde LDF et mettre les souris dans un incubateur à 30 ° C pendant la durée de l'occlusion.
4. Réperfusion et APC:
   1. Ré-anesthésier les animaux avec l'isoflurane comme décrit ci-dessus 55 min après le début de l'occlusion. Placez et réparez les souris en position couchée. Ouvrez l'incision du cou et ré-exposez l'artère carotide commune.
   2. Retirez délicatement le filament avec un pinceau ophtalmique après la période d'occlusion pour obtenir une reperfusion et tournez la suture temporaire dans une position permanente en resserrant le nœud.
   3. Pour un traitement d'acidose, changez le gaz inhalé par le cône du nez aux gaz de mélange contenant 20% de CO ₂ , 20% de O ₂ et 60% de N ₂ pendant 5 min à 5, 50 ou 100 minutes après la reperfusion. Fermer l'incision avec une suture chirurgicale interrompue.
   4. Placer les souris dans une cage de chaleur à 30 ° C jusqu'à ce que les souris rétablissent la conscienceEt ensuite renvoyer les souris pour nettoyer, les cages individuelles. Fournir aux souris une boîte de Petri d'eau et des aliments humidifiés. Surveillez les souris de près après la chirurgie pour une douleur et une mort excessives.
5. Mesure du volume des infarctus du cerveau:
   1. Mesurer le volume de l'infarctus du cerveau en utilisant une coloration TTC 24 h après la reperfusion.
   2. Préparez une solution TTC à 0,25% comme mentionné à l'étape 1.4.1 avant le temps de sacrifice désigné. Transférer la solution dans une plaque de 24 puits (1 ml par puits) recouverts de papier d'aluminium et le ranger à 4 ° C.
      REMARQUE: TTC et tissus teints avec TTC sont sensibles à la lumière.
   3. A 24 h après la reperfusion, sacrifiez l'animal avec un surdosage d'isoflurane dans une chambre d'induction. Décapiter les souris. Dissectez les cerveaux à l'aide de petits ciseaux et pinces. Examinez les points de sang sur le cerveau pour exclure les souris qui ont subi une hémorragie sous-arachnoïdienne au cercle de Willis.
   4. Placez le cerveau sur une glissière de verre propre à -20 ° ; Paquet de glace C. Placez le cerveau et le verre glisse dans un réfrigérateur de -20 ° C pendant 5 minutes pour rendre le cerveau plus facile à trancher.
   5. Sortez le cerveau et glissez le verre de -20 ° C et remettez-les sur le paquet de glace de -20 ° C. Dissectez le pôle frontal et le cervelet avec la lame et la pince.
   6. Coupez les sections du cerveau horizontalement jusqu'à une épaisseur de 1 mm avec une lame pour produire 5 tranches. Transférer les tranches dans la plaque de 24 puits contenant une solution de TTC (1 tranche par puits) avec une pince et étirer les tranches dans la solution. Incuber les tranches dans une solution de TTC à 37 ° C dans un bain d'eau peu profonde pendant 30 min.
   7. Aspirez la solution TTC. Ajouter 10% de formaldéhyde (1 ml par puits) et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Placez les tranches dans l'ordre dans lequel elles ont été découpées sur une feuille de cellophane et numérisez les segments dans l'imageur de plaque photographique.
   8. Analyser la taille de l'infarctus en pourcentage de la tranche entière du cerveau à l'aide du logiciel d'analyse ImageJLass = "xref"> 8 basé sur l'identification visuelle; Voir la figure 2 (à gauche).

Résultats

Dans le modèle de la tranche corticostriatale décrite ci-dessus, la viabilité corticostriatale des tranches a été quantifiée par dosage TTC à 1 heure après la reperfusion. La conversion TTC a été calculée en normalisant l'absorption à 490 nm à la tranche de contrôle. Selon la conversion TTC, APC a été protégé contre les lésions de reperfusion induites par l'OGD en fonction de la durée et de la durée. En détail, les 1 et 3 minutes de traitement par acidose ont amélioré de manière signific...

Discussion

Nous présentons ici deux modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection de l'APC contre l'ischémie cérébrale. Dans les tranches de cerveau, l'APC est réalisée en incubant des tranches corticostriatales de souris dans un tampon acide bouillonnant avec 20% de CO ₂ après l'apparition de reperfusion, tandis que dans le modèle MCAO, l'APC est obtenue par inhalation de 20% de CO ₂ chez la souris après reperfusion. Les deux modèles reflètent la neuroprotection de l'APC contr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de sodium	Sigma	S5886
Chlorure	de potassium Sigma	P5405
Phosphate de potassium monobasique	Sigma	P9791
Sulfate de magnésium	Sigma	M2643
Bicarbonate de sodium	Sigma	S5761
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma	C5080
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Vibratome	Leica	VT1000 S Chlorhydrate
2,3,5-triphényltétrazolium	Sigma	T8877
Éthanol absolu	Aladdin Industrial Corporation	E111993
Diméthyl sulfoxyde	Sigma	D8418
Laser Doppler Flowmetry	Moor Instruments Ltd	Modèle Moor VMS-LDF2
Éther diéthylique anhydre	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Trichloracetaldehycle hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10 % Formalin	Aladdin Industrial Corporation	F111936
24-well plaques	Jet Biofil	TCP-010-024