Amélioration de l’Application de poids moléculaire élevé biotinylé Dextran Amine pour la Projection de Thalamocortical suivi chez le Rat

Résumé

Nous présentons ici un protocole raffiné pour révéler efficacement amine de dextran biotinylé (BDA) marquage avec une fluorescence coloration méthode via une voie neurale réciproque. Il est adapté pour l’analyse de la structure fine des BDA étiquetage et qui le différencient des autres éléments neurones sous un confocal laser scanning microscope.

Résumé

Amine de haut poids moléculaire biotinylé dextran (BDA) a été utilisé comme traceur neuroanatomique très sensible pendant de nombreuses décennies. Étant donné que la qualité de son étiquetage a été affectée par divers facteurs, ici, nous fournissons un protocole raffiné pour l’application de poids moléculaire élevé BDA pour l’étude de marquage neuronal optimal dans le système nerveux central. Après injection stéréotaxique du BDA dans le noyau de la périostite ventrale (VPM) du thalamus chez le rat par une pipette de verre délicat, BDA a été souillé avec fluorescent streptavidine-Alexa (AF) 594 et Eosine avec coloration de Nissl fluorescente AF500/525. Sur le fond de coloration de Nissl vert, le rouge BDA étiquetage, y compris des corps cellulaires neurones et terminaux d’axonal, a été démontrée plus distinctement dans le cortex somatosensoriel. En outre, double coloration fluorescente pour BDA et la parvalbumine de protéine liant le calcium (PV) a été réalisée pour observer la corrélation du BDA étiquetage et interneurones PV positif dans la cible corticale, fournissant l’occasion d’étudier le local neural circuits et leurs caractéristiques chimiques. Ainsi, cette méthode raffinée est non seulement appropriée pour la visualisation de neurones marquage avec la masse moléculaire élevée BDA à travers les voies nerveuses réciproques entre le thalamus et le cortex cérébral de haute qualité, mais permettra également à la manifestation simultanée de autres marqueurs neurones avec histochimie fluorescent ou immunochimie.

Introduction

Poids moléculaire élevé BDA (poids moléculaire de 10 000), un traceur très sensible, a été utilisé pour tracer des voies nerveuses dans le système nerveux central pour plus de 20 ans¹. Bien que l’utilisation de la BDA est une commune étendue neurale suivi technique, la qualité de l’étiquetage de la BDA peut être affectée chez les animaux par divers facteurs^1,2,3. Notre étude récente révèle que la structure optimale de l’étiquetage de la BDA est non seulement associée à un moment approprié de survie après l’injection, mais aussi en corrélation avec la coloration méthode⁴. Jusqu'à présent, classique complexe avidine-biotine-peroxydase (ABC), streptavidine-fluorescéine isothiocyanate et streptavidine-AF594 méthodes de coloration ont été utilisées pour révéler l’étiquetage BDA dans précédentes études^{2,3, 4,5}. En comparaison, une coloration fluorescente pour BDA peut être facilement effectuée.

Afin d’étendre l’application de poids moléculaire élevé BDA, un protocole raffiné a été introduit dans la présente étude. Suite à l’injection de BDA dans le VPM du thalamus dans le cerveau de rat, BDA d’étiquetage a été révélée par la méthode habituelle de souillure d’ABC standard ainsi que par la double coloration fluorescente, qui a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et base les éléments neurones ou interneurones dans la corticale cible avec la Streptavidine-AF594 et fluorescent Nissl histochimie ou PV-immunochimie, respectivement. Par le biais de voies neurales réciproques entre le VPM et le cortex somatosensoriel primaire (S1)^6,7,8, nous avons concentré notre observation sur BDA étiquetage dans les axones thalamocortical projeté et corticothalamiques somas cellule projetée dans le S1. Par ce processus, nous nous attendions à fournir non seulement un protocole détaillé pour l’obtention de la qualité de marquage neuronal à haut poids moléculaire BDA, mais aussi un protocole raffiné sur la combinaison de marquage fluorescent de BDA et d’autres marqueurs neurones fluorescents avec histochimie ou immunochimie. Cette approche est préférable d’étudier les circuits neurones locaux et leurs caractéristiques chimiques sous un laser confocal, microscopie à balayage.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique à l’Académie chinoise des chinois Medical Sciences (numéro de référence 20160014). Toutes les procédures ont été menées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Quatre rats mâles adultes (poids 250-280 g) ont été utilisées dans cette étude. Tous les animaux étaient logés dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec une température contrôlée et l’humidité et autorisés le libre accès à la nourriture et l’eau. Les instruments et les matériaux utilisés dans la présente étude ont été montrés à la Figure 1.  Avant la chirurgie, tous les instruments, tels que le cadre stéréotaxique et pipette en verre, ont été nettoyés à l’aide d’éthanol à 70 %.

1. interventions chirurgicales

1. Déterminer la zone de coordination d’intérêt dans VPM à l’aide d’un atlas stéréotaxiques⁹ (Figure 2 a).
2. Préparer une 1 µL micro-seringue équipée d’une micropipette de verre (avec un diamètre d’environ 10 à 20 µm) (Figure 1) et de le tester avec de la paraffine liquide.
3. Anesthésier les rats avec 7 % d’hydrate de chloral (0,7 mL/100 g) par injection intrapéritonéale.
4. Une fois confirmée une anesthésie profonde avec queue pincez pédale réflexe de retrait, raser le dessus de la tête de l’animal avec un rasoir électrique et frotter le site chirurgical 3 fois avec 10 % polyvidone iodée, suivie de l’éthanol à 70 % respectivement.
5. Placez le rat dans l’appareil stéréotaxique en plaçant des barres d’oreilles émoussé dans les oreilles et placez des incisives supérieures de rat dans le support de la bouche (Figure 1E) puis appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.
6. Nettoyer la peau en tête du site chirurgical à l’aide de l’éthanol à 70 %. Utiliser des gants chirurgicaux stériles et serviettes pour maintenir la chirurgie dans des conditions stériles.
7. Faire une incision sagittale dans la peau avec un scalpel le long de la suture sagittale (Figure 1F).
8. Grattez les muscles et le périoste loin du crâne à l’aide de cotons-tiges stériles tout au long de la chirurgie pour contrôler le saignement (Figure 1F).
9. À l’aide de coordonnées prédéfinies d’un atlas (Figure 2 a), déterminer l’emplacement (point de Bregma mm-3,30, droit de 2,6 mm de la ligne médiane) de craniotomie (Figure 1).
10. Effectuer une craniotomie avec un foret de bavures avec un peu de pointe ronde (#106) (Figure 1 H) et continuer le forage à sur une profondeur de 1 mm en quelques minutes jusqu'à atteindre les méninges (Figure 1I).
11. L’accise la dure-mère utilisant des Micropinces pour exposer le cortex cérébral sur le site d’injection (Figure 1I).
12. Changer de paraffine liquide dans la seringue à injection avec solution 10 % BDA (10 000 poids moléculaire, dans l’eau distillée) (Figure 1J).
13. Monter la seringue dans l’appareil de la microinjection et se connecter avec une micro pompe (Figure 1 K).
    Remarque : Le volume injecté est dépendant de la vitesse de la micro pompe. Ici, il était réglé à 30 nL/min (Figure 1 L).
14. Sous un stéréomicroscope, insérez une micropipette verre manuellement avec l’appareil de microinjection dans le VPM à travers la surface corticale du cerveau à la profondeur de 5,8 mm (Figure 1 M).
15. Pression-injecter un 100 nL 10 % BDA dans le VPM sur une période de 3 min (35 nL/min) avec une micro pompe (Figure 1 L, M).
16. Après l’injection, tenir la pipette en place pour une supplémentaire de 5 min et retirer ensuite lentement.
17. Suture de la plaie avec fil stérile (Figure 1N). Suivre vos directives du Comité local de soins aux animaux pour l’analgésie pré- et post-opératoire.
18. Placez le rat dans une zone de restauration chaude jusqu'à ce qu’il reprend conscience et est complètement rétabli.
19. Remettez le rat récupéré sa cage.

2. les perfusions et Sections

1. Après un temps de survie de 10 jours en général, injecter l’animal avec un surdosage de 10 % uréthane (2 mL/100 g) par injection intrapéritonéale d’induire l’euthanasie.
2. Perfuse les rats expérimentaux dans la hotte (Figure 1O).
   1. Une fois que la respiration s’arrête, à l’aide de ciseaux et pinces, ouvrir la cavité thoracique du rat pour accéder au cœur. Insérer un cathéter intraveineux dans le ventricule gauche vers l’aorte et ouvrez l’oreillette droite.
   2. Tout d’abord perfuse avec 0,9 % saline tamponnée au phosphate (PBS) à température physiologique (37 ° C) environ 1-2 min jusqu'à ce que le sang sortant du cœur est clair et puis continuer avec 250-300 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate 0,1 M (PB, pH 7,4).
3. Après la perfusion, inciser la peau de la tête et ouvrir le crâne et ensuite disséquer sur le cerveau du rat. Fixer le cerveau disséqué en paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h à température ambiante (26 ° C), puis cryoprotect à 30 % de saccharose à 0,1 M PBS (pH 7,4) pendant 3 jours à 4 ° C jusqu'à ce que le cerveau est immergé dans la solution (Figure 1 P).
4. Une fois que le cerveau est immergé dans la solution, diviser le cerveau en trois blocs en direction coronaire sur les matrices de cerveau (Figure 1 q). Le bloc central contient le VPM et S1.
5. Couper le bloc central du cerveau à 40 µm sur une étape de congélation coulissant système microtome en direction coronaire. Recueillir ces sections ordonnées dans un plat de 6 puits avec PBS à 0,1 M (pH 7,4) (Figures 1R, S).

3. norme ABC coloration

NOTE : Sections flottantes libres de chaque troisième section coronale du cerveau ont été utilisées pour la visualisation de la BDA marquage à la norme ABC procédure¹⁰.

1. Rincer les sections dans du PBS de 0,1 M pendant environ 1 min.
2. Incuber les sections en solution à 1 % ABC en PB de 0,1 M (pH 7,4) contenant 0,3 % Triton X-100 pendant 1 h à température ambiante.
3. Laver les sections trois fois dans un tampon Tris 50 mM (pH 7,4).
4. Tacher les sections dans une solution contenant 0,02 % 3, tétrahydrochlorure 3'-diaminobenzidine (DAB) et 0,01 % H₂O₂ dans un tampon Tris 50 mM pour environ 2 à 5 min à température ambiante.
5. Laver les sections trois fois dans un tampon Tris 50 mM (pH 7,4).
6. Monter les sections sur les lames de microscope à l’aide des techniques histochimiques standards (Figure 1 t; voir III de fichier vidéo supplémentaire, perfusion et sections).
7. Sécher les sections dans l’air du jour au lendemain à la température ambiante.
8. Déshydrater les sections brièvement dans une série de solutions d’alcool (50 %, 70 %, 95 %, 100 %). Submerger les diapositives de chaque solution pour environ 15 s. Ne laissez pas les diapositives à sécher entre chaque étape.
9. Désactivez les sections dans le xylène trois fois, environ 20 min.
10. Mettre 2 ou 3 gouttes de baume sur les tranches puis posez les lamelles sur les sections.

4. double coloration fluorescente pour BDA et les éléments fondamentaux de neurones dans le Cortex cérébral

Remarque : en revanche, une coloration fluorescente double a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et éléments neurones de base sur les sections adjacentes à ce qui précède utilisant avec la Streptavidine-AF594 et Eosine avec coloration de Nissl fluorescente AF500/525.

1. Rincer les sections dans du PBS de 0,1 M pendant environ 1 min.
2. Incuber les sections dans une mélange de la solution de streptavidine-AF594 (1/500) et AF500/525 vert fluorescent Nissl teinture (1:1, 000) dans du PBS de 0,1 M (pH 7,4) contenant 0,3 % Triton X-100 pendant 2 h à température ambiante.
3. Laver les sections trois fois en PB de 0,1 M (pH 7,4).
4. Monter les sections sur les lames de microscope à l’aide des techniques histochimiques standards. Sécher les sections dans l’air pendant environ 1 h.
5. S’applique à lamelles couvre-objet pour les sections fluorescentes avec 50 % de glycérine dans l’eau distillée avant l’observation.

5. double coloration fluorescente pour BDA et interneurones dans le Cortex cérébral

Remarque : Une coloration fluorescente Double a été réalisée pour l’observation de la corrélation de l’étiquetage de la BDA et d’interneurones sur les sections représentatives dans la corticale cible avec la Streptavidine-AF594 et PV-immunochimie.

1. Rincer les sections représentatives dans du PBS de 0,1 M (pH 7,4) pendant environ 1 min.
2. Incuber les sections dans une solution de blocage contenant 3 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % Triton X-100 dans du PBS de 0,1 M pendant 30 min.
3. Transférer les sections dans une solution de souris monoclonal anti-PV IgG (1:1, 000) dans le sérum de chèvre normal 1 % contenant 0,1 M PBS (pH 7,4) et 0,3 % Triton X-100 pour la nuit à 4 ° C.
4. Le lendemain, laver les sections trois fois dans du PBS de 0,1 M (pH 7,4).
5. Exposer les sections d’un mélange de solution d’anticorps secondaire de chèvre anti-mouse-AF488 (1/500), streptavidine-AF594 (1/500) et 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 01:40, 000) dans le sérum de chèvre normal 0,1 M PBS (pH 7,4) contenant 1 % et 0,3 % Triton X-100 pendant 1 h.
6. Répétez les étapes de 4,3 à 4,5.

6. observation

1. Prendre des photos du VPM, thalamocortical les axones et les neurones corticothalamiques.
   1. Observer les échantillons fluorescents avec un système d’imagerie confocal équipé de lentilles objectifs (4 x, NA : 0,13 ; 10 x, NA : 0,40 ; et 40 x, NA : 0,95). Utiliser des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 405 488 (bleu), (vert) et 559 nm (rouge).
      NOTE : Ici, le trou d’épingle confocal est 152 µm (4 x, 10 x) et 105 µm (40 x). La résolution spatiale de capture d’image est 1024 × 1024 pixels (4 x, 10 x) et 640 × 640 pixels (40 x).
   2. Prendre vingt images en images successives de 2 µm de chaque section à l’épaisseur de 40 µm (série Z).
   3. Intégrer les images dans une seule image de mise au point avec l’image confocale traitement logiciel pour l’analyse en trois dimensions comme suit : définition du premier plan focal → fin jeu plan focal → étape set taille → choisir profondeur modèle → image capture → Z series.
2. Prendre des images de fond clair par un microscope optique équipé d’un appareil photo numérique (4 x, NA : 0,13 ; 10 x, NA : 0,40 ; et 40 x, NA : 0,95 lentilles). Utilisez un temps de pose de logiciel de retouche de photo utilisation de 500 m pour ajuster la luminosité et le contraste des images et ajouter des étiquettes.

Résultats

Survie des 10 jours post injection de BDA dans le VPM est suffisante pour la production intense neural étiquettes apposées sur les aires corticales correspondantes ipsilatérale à la face d’injection (Figure 2). Classiques ABC et fluorescentes procédures de coloration pour BDA a révélé le modèle similaire de marquage neuronal sur le S1, y compris axonales intitulée thalamocortical axones et marqués intitulée corticothalamiques neurones (Fi...

Discussion

Sélection d’un bon traceur est une étape essentielle pour une expérience réussie de traçage neuronal. Dans la famille de BDA, poids moléculaire élevé BDA (poids moléculaire de 10 000) a été recommandé à transporter préférentiellement par le biais de la voie neuronale antérograde contrairement à faible poids moléculaire BDA (3 000 poids moléculaire)^{2,3 , 11 , 12 , 13...}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dextran amine biotinylée (BDA)	Sondes moléculaires	D1956	10 000 poids moléculaire
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Sondes moléculaires	S32356	Protéger de
la lumière 500/525 vert fluorescent Nissl	Sondes moléculaires	N21480	Protéger de la lumière
Instrument de stéréotaxie cérébrale	Narishige	SR-50
Microtome de congélation	Thermo	Microm International GmbH
Imagerie confocale	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus lames de microscope	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop et Illustration	Adobe	CS5